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요약

여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다.

초록

흉선은 T 림프구 개발을위한 중요한 기관이다. T 세포 고집, 긍정적 및 부정적 선택을 선택 : 흉선 간질 세포, 흉선 상피 세포 (TEC는)은 T 세포 발달의 여러 단계에서 특히 중요하다. 그러나, 흉선에서 TEC는의 기능이 불완전하게 이해 상태를 유지합니다. 기사에서는 기계적 중단과 소화 효소의 조합을 사용하여 신선한 마우스 흉선에서 TEC 서브 세트를 분리하는 방법을 제공한다. 방법은 흉선 기질 세포 및 흉선 세포를 효율적으로 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질로부터 연결 해제 될 단일 세포 현탁액을 형성 할 수있다. 세포 격리하여, 다중 매개 유동 세포 계측법은 TEC는 수지상 세포의 확인 및 특성화에 적용될 수있다. TEC는가 흉선에서 희귀 세포 집단 때문에, 우리는 또한 풍부하고 흉선 세포, 흉선에서 가장 풍부한 세포 유형을 고갈하여 TEC는 정화 할 수있는 효과적인 방법을 설명한다. FOLLO세포 생존의 상실 TEC는 정제 과정을 최소화 할 수 있도록 날개가 농축, 세포 정렬 시간은 감소 될 수있다. 정제 된 세포는 리얼 타임-PCR, 웨스턴 블롯 및 유전자 발현 프로파일 링 같은 다양한 다운 스트림 분석에 적합하다. 프로토콜은 TEC의 기능 연구뿐만 아니라 시험 관내 T 세포 재구성의 발전을 촉진 할 것이다.

서문

초기 T 세포 개발, 골수 조혈 줄기 세포 유래 다 분화능 전구 세포가 흉선의 피질 모집, T 계보에 대한 약속을 받아야하고 T 세포 전구체 1이된다. 매우 가변적 T 세포 수용체 1 전구 세포의 큰 풀을 형성 피질에서, T 세포 전구체 CD4 및 CD8 더블 네거티브 (DN) 흉선 세포 확장 및 미성숙 CD4 및 CD8 이중 양성 (DP) 흉선 세포로 분화. 만 DP 세포의 선택 MHC 제한 집합은 CD4 또는 CD8 하나의 긍정적 인 (SP) 흉선 세포가 흉선의 수질로 마이그레이션하고, 기능적 능력 성숙 T 세포에 긍정적 인 선택 2 불린다 이벤트를 차별화 6. 반면, 자동 반응 흉선 세포의 클론 부정적인 선택을 받아야하고 자기 공차 규제 T 세포로 변환, 또는 아직 명확하지 않은 목적을 위해 상피내 림프구로 전환, 세포 사멸을 통해 제거 3,7-10.

흉선에서, 흉선 간질 세포는 이러한 다양한 T 세포 발달의 운명 5,11,12에 대한 신호를 제공하는 고유의 미세 환경을 형성한다. 대뇌 피질의 TEC는 (cTECs) 및 수질의 TEC는 (mTECs), 수지상 세포, 대 식세포, 섬유 아세포, 혈관 내피 세포, 신경 크레스트에서 파생 된 혈관 주위 세포와 다른 중간 엽 세포 13 ~ 15 포함 - 흉선 간질 세포는 흉선 상피 세포 (TEC는)로 구성된다. 이들 중에서는 TEC는 T 세포의 발달 1,2,16,17 다양한 단계에 중요하다. 그러나, TEC는 격리 할 수있는 강력한 방법의 부족은 그 기능 (16)의 포괄적 인 이해를 방해하고있다. 특히 피질 전구 세포를 둘러싸 삼차원 네트워크를 형성 cTECs는 아직 확실하지 않은 이유로 양성 선택 13,18,19 필수적이다. 이전 연구는 대부분의 형태 학적 및 조직 학적 도구 (13)에 의존, TEC는의 이질성과 역할에 대한 단서를 제공 . 최근 TEC 부분 집합의 고유 한 역할은 마우스 모델 12, 20에 유전 적 방법에 의해 해결되었다. TEC는을 분리하는 강력하고 재현 가능한 방법은 cTECs가 긍정적 인 선택을 어떻게 지원하는지 TEC 부분 집합, TEC 기능의 양적 및 질적 평가 및 메커니즘의 해명의 편견 특성을 달성하기 위해 필수적입니다.

때문에 그들은 그대로 장기에 형성 흉선에서 TEC는의 희소성과 긴밀한 상호 작용, TEC는의 분리 도전하고있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이전의 발견, 현재 이용 가능한 시약, 기법, 및 흉선 구조 및 기질 조성물의 지식에 기초한다. 거의 20 년 전, 몇 가지 절차는 트립신, 콜라게나 제와 디스 파제 등 다양한 효소가 소화하는 동안 사용 된에서 흉선 조직 21-27을, 해리하는 것으로보고되었다. 회색 등. 그들의 precedure 28에서와 효소를 비교하고 개선 메트 신고되었고 효소 칵테일 (29)의 여러 단계 소화 외경 (20), (30)을 널리 사용 하였다. 그러나,이 방법은 긴 준비 시간, 심지어 동일한 코호트 29,30 쥐에서 세포 수의 비율과 TEC는 최종 변수 복잡한 소화 단계 및 결과를 포함한다. 몇 년 전에, Liberase 연구 등급 효소, 고도로 정제 된 콜라게나 중성 프로테아제는 흉선 조직의 해리 (30)에 사용되기 시작 함유. 여기서 우리는 마우스 흉선 조직에서 실행 가능한 TEC는 높은 수를 산출 최적화 된 기계적 분리 절차 Liberase 소화 기반 프로토콜을, 설명합니다. .

해리 기질 세포를 풍부하게하기 위해, 이전의 연구는 밀도 구배 또는 자기 비드 분리 21,29를 사용하고 있습니다. 그러나 두 방법은 흉선 간질 세포, cTECs 29 특히 인구의 특정 집단의 손실 심각한 원인이된다. 세포 독성 제거 및 패닝 기법 (31, 32)까지 널리 면역 필드 12,31에 고갈 또는 림프구의 분리를 위해 사용되어왔다. 이러한 기술을 비교 한 결과, TEC는 우리의 농축을위한 전류 패닝 프로토콜을 세웠다. 농축 절차를 수행하는 동안 부드러운 상태가 적은 세포 죽음과 편견 증가 TEC 복구로 연결됩니다.

제 3 항에 기재된 절연 흉선 세포 현탁액을 직접 TEC 서브 세트와 수지상 세포의 확인 및 특성화를위한 유세포 분석 흐름에 적용될 수있다. 4 장에서는 사이토 다중 매개 흐름을 사용하여 TEC 하위 집합을 식별 할 수있는 간단하고 유용한 방법을 설명합니다. 정제 cTECs 또는 mTECs, TEC 농축 및 절차를 정렬 셀을 얻기 위해 추구 실험을 위해 제 5 및 6에서 찾을 수 있습니다.

프로토콜

본 연구에서는, 성인 (6 - 8 주) 암컷 C57BL / 6 쥐를 사용 하였다. 마우스는 국립 암 연구소에서 구입 한 특정 병원균이없는 상태에서 유지되었다. 미네소타 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC)는 모든 동물 실험을 승인했다.

인스 트루먼 트와 버퍼의 1 준비

  1. 효소 용액을 준비 알부민 풍부한 완충액 (PBS 1X [칼슘 / 마그네슘 2 + 불 함유]와 0.5 % 소 혈청 (0.05 %와 RPMI1640 배지를 Liberase TH의 DNase I 및 100 U / ㎖ [/ w V]) 알부민 및 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 산 [EDTA]), FACS 완충액 (1X PBS [칼슘 / 마그네슘 2 + 불 함유 함유하는 1 % 태아 소 혈청 [FBS] 및 0.02 % NaN3가), 버퍼 정렬 FACS (1X PBS [칼슘 / 마그네슘이 2 + 불 함유] 2 % FBS), RP10 및 배지를 함유하는 (RPMI-1640 배지)는 10 % FBS와 함께 공급된다.
  2. 10 패닝 접시를 준비합니다. (0.01 ㎎ / ㎖ G 40 ml의 코팅 용액을 준비귀리는 0.1 M 탄산 수소 나트륨 완충액 안티 쥐의 IgG), 각 100 × 15mm 플레이트, 소용돌이로 코팅 용액 4 mL를 넣고 4 ° CO / N 부화. 항체 용액을 붓고 두 번 1X PBS 5 ㎖를 사용하여 판을 세척, 헹굼 사이에 격렬하게 소용돌이 친다. 4 ° C에서 제조 된 판을 보관하십시오.

흉선 조직의 2 수확

  1. CO 2 챔버에 마우스를 안락사. , 해부 매트에 그 뒷면에있는 동물을 넣어 매트에 발을 핀 및 70 % 에탄올로 분사하여 모피 젖은.
  2. 똑바로 가위로 아래턱에 요도 위에서 시작하여 피부를 통해 중간 선 절개를하고 양쪽 무릎 아래쪽으로 절개를 확장 할 수 있습니다. 절개는 "Y"거꾸로처럼 보인다. 측면에 느슨한 피부를 뒤로 당겨 절개 매트에 핀.
  3. , 검상 돌기에서 진동판에 구멍 쇄골에 대해 다음 갈비뼈를 들어 올려까지 양쪽의 갈비뼈를 잘라집게 해부 매트에 고정합니다. 흉선은 갈비뼈 아래에, 그리고 마음 (그림 1) 위에 놓인 두 개의 얇은 흰색 엽 (叶)처럼 보인다. 분리 결합 조직을 부드럽게 당겨 곡선 톱니 모양의 집게와 흉선 로브의 쌍을 제거, 흉선 주변. 5 ㎖의 RPMI-1640을 포함하는 6 웰 플레이트에 배치 흉선 엽.

흉선 기질 세포의 3 준비

  1. 모든 주위 지방 및 결합 조직을 손질하고 5 ml의 갓 효소액을 제조 함유 6 웰 플레이트의 웰에 새로운 흉선 로브 옮긴다. 미세 가위로 흉선 엽 (叶)에 작은 절개를 확인하고 20 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
  2. 조직 해리 5 ml의 피펫을 사용하여 3 회 - 부드럽게 흉선 조직 상하 2를 소화 피펫. 10 ㎖의 효소를 중화 알부민 풍부한 차가운 완충액을 함유하는 50 ㎖의 튜브에 상청 분획을 수집한다. 얼음에 포집 관을 유지합니다. 2.5 추가ML 효소 나머지 조직에 솔루션을 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
  3. 골재 분리를 위해 3 ML의 주사기와 18 G 바늘 부드러운 기계적 교반을 수행합니다. 포집 관에 풀 상층 액. 나머지 조직에 2.5 ml의 효소 솔루션을 추가하고 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
  4. 3 ML의 주사기와 25 G 바늘 부드러운 기계적 교반을 반복 한 접시 추가 5 품어 - 10 분.
  5. 완전한 소화 한 후, 포집 관에 뜨는을 풀. 원심 분리기 400 XG, 8 분 세포를 수집하기위한 4 ° C에서 포집 관. 대기음 액체 및 10 ㎖ 알부민 풍부한 버퍼에 펠렛 세포를 중단하고 100mm 메쉬를 통해 샘플을 필터링. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 그런 흐름 cytometic 분석 (제 4 절) 또는 TEC는 농축 (5 장)을 수행합니다.

유동 세포 계측법에 의해 TEC는의 4 확인

  1. 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 테스트에 대한 FACS 염색 버퍼 100 μL 당 4 × 106 세포의 최종 농도로 세포를 준비하고 얼음에 플레이트를 유지한다. 세포 (10 μg FACS 버퍼 / ㎖에서 항 CD16 / CD32 항체) 20 μL의 Fc 블록 솔루션을 추가하고 얼음에 10 분 동안 세포를 배양한다. 400 XG, 3 분 동안 4 ° C에서 접시를 스핀. 싱크대 아래로 판의 얼굴을 쓸어 넘겨 우물에서 액체를 폐기하십시오.
  2. 펠렛 세포 100 ㎕의 항체 칵테일 (항-CD45, -EpCAM, -MHC 클래스 II, 및 -Ly51 항체, 및 제조 업체에서 서로 다른 형광 색소로 표지 UEA-1 렉틴은 권장 또는 FACS 버퍼에 각 항체의 최적 농도를 시험 일시 중단 ) 및 어둠 속에서 20 분 동안 얼음 위에서 세포를 배양. 보상의 경우, 각각의 형광 색소와 1 × 10 6 세포를 염색.
  3. 각 웰에 FACS 버퍼의 100 μl를 추가하고 400 XG, 3 분 동안 4 ° C에서 접시를 회전. 세척 단계를 반복시간 후 100 ㎕의 FACS 완충액에 세포를 재현 탁. 300 ㎕의 FACS 버퍼 가득 12 × 15mm 둥근 바닥 FACS 튜브에 세포를 전송합니다. 유동 세포 계측기에 샘플을 획득하고 FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. TEC 게이팅 전략은 그림 2에 나타내었다.

패닝에 의해 TEC는의 5 심화

  1. 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 (제 3에서 제조) 흉선 세포를 스핀 다운. 대기음 액체 및 15 ㎖의 50 ml의 원추형 튜브 ML 당 2 × 108 세포의 농도로 FACS 정렬 버퍼에 펠렛 세포를 일시. 세포 현탁액의 2.5 ㎍ / ml의 최종 농도 방지 CD90.2 항체 (클론 30-H12) (또는 항 CD45)을 추가하고 30 분 동안 4 ° C에서 회전 믹서에 부드럽게 세포를 배양한다. 배양 후, 5 씻어 - RP10 매체의 10 배 볼륨과 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 튜브를 원심 분리기.
  2. 대기음 액체의 펠렛 세포를 재현 탁ML 당 1 × 107의 농도로 RP10 매체. 각 코팅 팬 (단계 1.3에서 준비) 판 소용돌이에 5 ㎖의 세포 현탁액을 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 격렬하게 소용돌이 친다; 원뿔 튜브에 상층 액을 전송합니다. 판에게 RP10 매체를 사용하여 두 번 씻어 컬렉션 튜브에 상층 액을 풀.
  3. 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 포집 관을 원심 분리기. 대기음 액체 및 5 ㎖의 RP10 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 새로운 패닝 플레이트에 세포 현탁액을 추가 소용돌이 및 RT에서 30 분 동안 배양한다. 세포가 접시를 씻어 원뿔 튜브로를 풀 수집합니다. TEC는이 충실하면, 정렬 버퍼 5 ML의 FACS에서 셀을 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 세포를 스핀 다운 및 일시 중지합니다.

셀 정렬하여 TEC는의 6 정화

  1. 혈구를 사용하여 세포를 세어 FACS 정렬 버퍼에 4 × 10 7 세포의 농도에서 세포 현탁액을 준비합니다. 항체 데 추가세포 용액에 4.4 절에 cribed 30 분 동안 4 ° C에서 회전 믹서에 부드럽게 세포를 배양한다. 염색 후, 씻어 FACS 정렬 버퍼의 ML 당 10 × 106 세포의 농도로 세포를 일시.
  2. 정렬 100 μM 노즐을 통해 TEC 부분 집합은 형광 활성 세포 정렬을 사용. 정렬 세포는 RPMI-1640 (v / v)로 FBS) 30 %에 수집됩니다. 셀 정렬은 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기 세포를 수행하고 다운 스트림 분석을 위해 준비되면.

결과

수득 된 세포 현탁액은 흉선 세포, 조혈 유래 기질 세포 및 비 - 조혈 기질 세포로 구성 3 절에서 설명한 바와 같이이 프로토콜을 사용하여, 흉선 오르간 성인 마우스 (섹션 2) 및 흉선 세포 현탁액으로부터 제거 제조 하였다. CD45는 조혈 팬 마커가 흉선 세포 및 대 식세포와 수지상 세포로 조혈 기질 세포 모두에서 발현이다. 반면, TEC는 조혈 기원하지 않으며 CD45 15을 표명하지 아니합니다. ?...

토론

프로토콜에서 중요한 단계는 흉선 간질 세포 (섹션 3)의 준비와 TEC는의 농축 (4 절)입니다. 이 적극 신선한 효소 용액마다 준비하고, 조직이 가능한 한 빨리 처리하는 것이 좋다. 풀링 thymi 들어, 효소 용액의 부피를 최적화 thymi의 수에 따라 요구된다. 모든 조직 잔사 처리 후에 남아 있으면, 더 효소액 및 배양 시간의 연장을 첨가하여 세포 수율을 증가시킬 수있다. TEC는의 농축, 상층 액의 수집을 완...

공개

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 (KAH에) 건강 그랜트 R01 AI088209 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 또한 미네소타 유동 세포 계측법 자원의 대학 감사합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse EpCAMeBioscienceXX-5791-YY*Clone G8.8
Anti-mouse MHC IIeBioscienceXX-5321-YY*Clone M5/114.15.2
Anti-mouse Ly51eBioscienceXX-5891-YY*Clone 6C3
UEA-1Vector LaboratoryFL-1061
Flow cytometerBD Biosciences LSRFortessa
Flow cell sorterBD Biosciences FACSAria
FACS tubesBD Biosciences352052
Flow cytometry analysis softwareTreeStar - FlowjoFlowJo v7/9
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

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