El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

Resumen

Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.

Resumen

El timo es un órgano vital para el desarrollo de linfocitos T. De las células del estroma tímico, células epiteliales del timo (TEC) son particularmente cruciales en múltiples etapas de desarrollo de células T: compromiso de las células T, la selección positiva y selección negativa. Sin embargo, la función de TEC en el timo sigue siendo incompleta entendido. En el artículo, se proporciona un método para aislar los subconjuntos TEC de timo de ratón fresco con una combinación de alteración mecánica y digestión enzimática. El método permite que las células del estroma tímico y timocitos a ser liberados de manera eficiente de célula-célula y célula-matriz conexiones extracelular y para formar una suspensión de una sola célula. Uso de las células aisladas, citometría de flujo multiparamétrica se puede aplicar a la identificación y caracterización de TEC y las células dendríticas. Debido TEC son una rara población de células en el timo, también se describe una forma eficaz para enriquecer y purificar TEC por el agotamiento de los timocitos, el tipo de célula más abundante en el timo. Folloala el enriquecimiento, el tiempo de clasificación de células se puede disminuir de modo que la pérdida de viabilidad celular puede reducirse al mínimo durante la purificación de TEC. Las células purificadas son adecuados para diversos análisis aguas abajo como el Real Time-PCR, Western blot y perfiles de expresión génica. El protocolo promoverá la investigación de la función de TEC y así como el desarrollo de la reconstitución in vitro de células T.

Introducción

Temprano en el desarrollo de células T, la médula ósea madre hematopoyéticas progenitoras multipotentes derivadas de células son reclutados a la corteza del timo, someterse compromiso de linaje T y se convierten en precursores de células T ^1. En la corteza, precursores de células T CD4 y CD8 doble negativos (DN) timocitos se expanden y se diferencian en células CD8 doble positiva (DP) timocitos inmaduros CD4 y, formando un gran grupo de progenitores con receptores de células T altamente variable ^1. Sólo un selecto subconjunto restringido por MHC de las células DP se convertirá en único positivos (SP) timocitos CD4 o CD8, migran a la médula del timo, y se diferencian en células T maduras funcionalmente competentes, un evento que se conoce como selección positiva ^{2 6.} En contraste, los clones de los timocitos autorreactivos se someten a selección negativa y se eliminan a través de la apoptosis, convertido a las células T reguladoras para la auto-tolerancia, o desviado a los linfocitos intraepiteliales para los propósitos que aún no están claras ^3,7-10.

En el timo, las células estromales tímicas forman un microambiente único que proporciona señales para estos diversos destinos de desarrollo de células T ^5,11,12. Células del estroma tímico se componen de células epiteliales del timo (TEC) - incluyendo TEC corticales (CTEC) y TEC medulares (mTECs), células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales, pericitos derivadas de la cresta neural y otras células mesenquimales ^13-15. Entre estos, TEC son cruciales en las diversas etapas de desarrollo de células T ^1,2,16,17. Sin embargo, la falta de una manera robusta para aislar TEC ha obstaculizado una comprensión global de sus funciones ^16. En particular, CTEC, que forman una red tridimensional que rodea a los progenitores en la corteza, son esenciales para la selección positiva ^13,18,19 por razones que aún no están claras. Estudios anteriores proporcionaron pistas sobre la heterogeneidad y el papel de los TEC, sobre todo contando con herramientas morfológicas e histológicas ¹³ . Recientemente las funciones únicas de subconjuntos TEC fueron abordados por enfoques genéticos en modelos de ratón ^12,20. Una manera robusta y reproducible para aislar TEC es fundamental para lograr la caracterización objetiva de subconjuntos TEC, la evaluación cuantitativa y cualitativa de las funciones TEC, y la aclaración de los mecanismos de cómo CTEC apoyan la selección positiva.

Debido a la rareza de TEC en el timo y las interacciones apretados forman en el órgano intacto, el aislamiento de TEC ha sido desafiante. El protocolo descrito aquí se basa en descubrimientos anteriores, actualmente reactivos disponibles, las técnicas y el conocimiento de la estructura y composición del estroma del timo. Hace casi dos décadas, se reportaron varios procedimientos para desagregar los tejidos del timo ^21-27, en el que se utilizaron diferentes enzimas durante la digestión, incluyendo tripsina, colagenasa y dispasa. Gray et al. comparado esas enzimas en su precedure ^28, e informó de una mejora de la metanfetaminaod con la digestión de múltiples pasos de cócteles enzimáticos ²⁹ que se hicieron ampliamente utilizado ^20,30. Sin embargo, este método implica un largo tiempo de preparación y los pasos y los resultados de digestión complejos en el número de células y proporciones de TEC última variable, incluso en la misma cohorte murino ^29,30. Hace varios años, Liberase enzima grado de investigación, con adición altamente purificada de colagenasa y proteasa neutra se empezó a utilizar en la disociación del tejido del timo ^30. A continuación, describimos un protocolo basado en la digestión-Liberase, con procedimientos de separación mecánica optimizados, que produce un alto número de TEC viables a partir de tejidos de timo de ratón. .

Para enriquecer las células del estroma disociadas, estudios previos han utilizado tanto los gradientes de densidad o la separación de cuentas magnéticas ^21,29. Sin embargo, ambos métodos causan severa perdida de ciertas poblaciones de células del estroma del timo, en particular la población de CTEC ^29. Eliminación citotóxica y técnicas de paneo 31,32 han sido ampliamente utilizados para el agotamiento o la separación de los linfocitos en el campo inmunológico ^12,31. Después de la comparación de estas técnicas, hemos establecido el protocolo actual de panoramización para el enriquecimiento de TEC. La condición suave durante el procedimiento de enriquecimiento conduce a una menor muerte celular e imparcial y una mayor recuperación de TEC.

La suspensión de células aisladas del timo se describe en la Sección 3 se puede aplicar directamente a análisis citométrico de flujo para la identificación y caracterización de subconjuntos TEC y células dendríticas. Sección 4 describe una forma sencilla y útil para identificar subconjuntos TEC utilizando citómetro de flujo multiparamétrica. Para los experimentos que buscan obtener CTEC purificados o mTECs, enriquecimiento TEC y clasificación de células procedimientos se pueden encontrar en la sección 5 y 6.

Protocolo

En este estudio, los adultos - se utilizaron (6 8 semanas) hembra C57BL / 6 ratones. Los ratones se adquirieron en el Instituto Nacional del Cáncer y mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. La Universidad de Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Minnesota (IACUC) aprobó toda la experimentación animal.

1 Preparación de Instrumentos y búferes

1. Preparar la solución de enzima (medio RPMI 1640 con 0,05% [w / v] de Liberase TH y 100 U / ml de DNasa I), tampón rico en albúmina (1X PBS [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 + libre]} con 0,5% de suero bovino mM de ácido etilendiaminotetraacético albúmina y 2 [EDTA]), tampón FACS (PBS 1X [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 + libre]} que contiene suero bovino fetal al 1% [FBS] y 0,02% NaN _3), FACS clasificación tampón (PBS 1X [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 + libre]} que contiene 2% de FBS), y medio RP10 (medio RPMI-1640 suministrado con FBS al 10%).
2. Preparar 10 placas paneo. Preparar la solución de recubrimiento 40 ml (0,01 mg / ml de Gavena anti-IgG de rata en 0,1 M _NaHCO3 Buffer), y añadir 4 ml de solución de revestimiento en cada placa de 100 mm x 15, remolino e incubar a 4 ° CO / N. Vierta la solución de anticuerpo y enjuagar la placa con 5 ml de 1x PBS durante 2 horas, agite vigorosamente entre enjuagues. Guarde las placas preparadas a 4 ° C.

2. Cosecha de Timo Tejido

1. La eutanasia de ratón en una cámara de CO _2. Coloque el animal sobre su espalda sobre una estera de disección, fijar los pies en el felpudo y humedecer la piel mediante pulverización con etanol al 70%.
2. Hacer una incisión en la línea media a través de la piel, a partir de por encima de la abertura de la uretra hacia arriba a la mandíbula inferior con una tijera y extender la incisión hacia abajo para las rodillas en ambos lados. La incisión se ve como un revés de "Y". Tire de la piel suelta de nuevo en los lados, y el pin a la lona disección.
3. Perforar el diafragma del xifoides, cortar las costillas en cada lado hasta alrededor de la clavícula, luego levante las costillas confórceps y el pin a la lona disección. El timo es justo debajo de las costillas, y se ve como dos lóbulos blancas finas que recubren el corazón (Figura 1). Tejido conectivo que rodea Desconecte el timo, tirar y eliminar el par de lóbulos del timo con pinzas dentadas curvadas suavemente. Lóbulos del timo lugar en una placa de 6 pocillos que contenía 5 ml de medio RPMI-1640.

3. Preparación de las células del estroma tímico

1. Recortar cualquier tejido graso y conectivo circundante y transferir los lóbulos del timo a un nuevo pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene 5 ml de solución de enzima recién preparan. Hacer pequeñas incisiones en los lóbulos del timo con tijeras finas, y se incuba la placa a 37 ° C durante 20 min.
2. Pipetear suavemente digerir tejido del timo arriba y abajo 2-3 veces usando la pipeta 5 ml para la disociación del tejido. Recoger la fracción de sobrenadante en un tubo de 50 ml que contiene 10 ml de tampón de albúmina rica en frío para neutralizar enzimas. Mantener el tubo de recogida en hielo. Añadir 2,5solución de enzima ml para el tejido restante y se incuba la placa a 37 ° C durante 15 min.
3. Realizar agitación mecánica suave con una jeringa de 3 ml y 18 g de aguja para romper los agregados. Piscina sobrenadante en el tubo de recogida. Añadir 2,5 ml de solución de enzima para el tejido restante y se incuba la placa a 37 ° C durante 15 min.
4. Repita la agitación mecánica suave con una jeringa de 3 ml y una aguja de 25 G, y se incuba la placa adicional de 5 - 10 min.
5. Después de la digestión completa, piscina el sobrenadante en el tubo de recogida. Centrifugar el tubo de recogida a 400 xg, 4 ° C durante 8 min para recoger las células. Aspirar el líquido y suspender las células sedimentadas en 10 ml de tampón de albúmina-rica y filtrar la muestra a través de malla de 100 mm. Contar las células utilizando un hemocitómetro. A continuación, realice el análisis de flujo cytometic (Sección 4) o el enriquecimiento TEC (Sección 5).

4. Identificación del TEC por Citometría de Flujo

1. Preparar las células para una concentración final de 4 x 10 ⁶ células por 100 l en tampón de FACS para la tinción en una placa de ensayo de pocillos de fondo redondo 96 y mantener la placa en hielo. Añadir 20 l solución de bloqueo Fc (-anticuerpo anti CD16 / CD32 a 10 mg / ml en tampón FACS) a las células e incubar las células durante 10 min en hielo. Haga girar la placa a 400 xg, 4 ° C durante 3 min. Deseche el líquido de los pozos con un movimiento rápido de la cara de la placa hacia abajo en un fregadero.
2. Suspender las células sedimentadas en 100 l cóctel de anticuerpos (anti-CD45, -EpCAM, clase MHC II, y -Ly51 anticuerpos, y la lectina UEA-1 marcado con diferentes fluorocromos en fabricante recomienda o probado concentraciones óptimas de cada anticuerpo en tampón FACS ), y se incuban las células en hielo durante 20 min en la oscuridad. Para la compensación, manchar 1 x 10 ⁶ células con cada fluorocromo individual.
3. Añadir 100 l de tampón de FACS a cada pocillo y girar la placa a 400 xg, 4 ° C durante 3 min. Repita el paso de lavado setiempo y, a continuación, volver a suspender las células en tampón de FACS 100 l. Transferir las células a un tubo de FACS de fondo redondo de 12 x 15 mm lleno de 300 l de tampón FACS. Adquirir las muestras en el citómetro de flujo y análisis de datos utilizando el software de análisis FACS. Estrategia gating TEC se muestra en la Figura 2.

5. Enriquecimiento del TEC por Toma panorámica

1. Centrifugar las células del timo (que se formulan en la sección 3) a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. Aspirar el líquido y suspender las células sedimentadas en tampón de clasificación de FACS en una concentración de 2 x 10 ⁸ células por ml en un tubo cónico de 15 ml o 50 ml. Añadir anticuerpo anti-CD90.2 (Clon 30-H12) (o anti-CD45) a una concentración final de 2,5 mg / ml de suspensión celular y se incuban las células suavemente en un mezclador que gira a 4 ° C durante 30 min. Después de la incubación, lavar con un 5 - 10 veces el volumen de medio RP10 y se centrifuga el tubo a 400 xg, 4 ° C durante 5 min.
2. Aspirar el líquido y resuspender las células sedimentadas enRP10 medio a una concentración de 1 x 10 ⁷ por ml. Añadir 5 ml de suspensión celular a cada placa recubierta panning (preparado en la Etapa 1.3), remolino y se incuba durante 30 min a TA. Agitar vigorosamente; transferir los sobrenadantes en un tubo cónico. Enjuague la placa dos veces con medio RP10 y agrupar los sobrenadantes en el tubo de recogida.
3. Centrifugar el tubo de recogida a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. Aspirar el líquido y resuspender las células sedimentadas en medio RP10 5 ml. Añadir la suspensión celular a una nueva placa de paneo, agitar e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Recoger las células enjuagar la placa y piscina para ellos en un tubo cónico. Una vez TEC se enriquecen, de girar las células a 400 xg, 4 ° C durante 5 min y la suspensión de células en 5 ml de tampón FACS clasificación.

6. Purificación del TEC por la clasificación de células

1. Contar las células usando un hemocitómetro y preparar la suspensión de células a una concentración de 4 x 10 ⁷ células en tampón de clasificación FACS. Añadir anticuerpos described en la Sección 4.4 en solución de células e incubar las células suavemente en un mezclador que gira a 4 ° C durante 30 min. Después de la tinción, lavar y suspender las células a una concentración de 10 x 10 ⁶ células por ml de tampón de clasificación FACS.
2. Ordenar subconjuntos TEC través de una boquilla 100 mM usando la clasificación de células activadas por fluorescencia. Ordenado de células se recogen en 30% (v / v) de FBS en medio RPMI-1640). Una vez que la clasificación de células se realiza, centrifugar las células a 400 xg, 4 ° C durante 5 min y se preparan para análisis de aguas abajo.

Resultados

Usando este protocolo, un órgano timo fue retirado de un ratón adulto (Sección 2) y una suspensión de células del timo se preparó como se describe en la Sección 3. La suspensión celular obtenida constaba de timocitos, células estromales hematopoyéticas derivadas de las células del estroma y no hematopoyéticas. CD45 es un marcador pan-hematopoyético expresó en ambos timocitos y células estromales hematopoyéticas tales como macrófagos y células dendríticas. En contraste, los TEC no son de origen hematop...

Discusión

En el protocolo, los pasos críticos son la preparación de las células del estroma del timo (Sección 3) y el enriquecimiento de los TEC (Sección 4). Se recomienda firmemente que la solución de enzima fresca se prepara cada vez y el tejido se trata tan pronto como sea posible. Para timos agrupado, se requiere optimizar el volumen de solución de enzima en función del número de timos. Si cualquier residuo de tejido que queda después de la transformación, la adición de más solución de enzima y la extensión del...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
Anti-mouse MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
Anti-mouse Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Flow cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa
Flow cell sorter	BD Biosciences	FACSAria
FACS tubes	BD Biosciences	352052
Flow cytometry analysis software	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.