Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Zusammenfassung

Der Thymus ist ein wichtiges Organ für die T-Lymphozyten-Entwicklung. Von Thymus-Stromazellen sind Thymus-Epithelzellen (TEC) besonders wichtig in mehreren Stufen von T-Zell-Entwicklung: T-Zell-Engagement, positive und negative Selektionsauswahl. Allerdings bleibt die Funktion der TEC in der Thymusdrüse unvollständig verstanden. In dem Artikel wird ein Verfahren zur TEC Teilmengen aus frischen Maus Thymus mit einer Kombination von mechanischen Störungen und enzymatische Verdauung zu isolieren. Das Verfahren ermöglicht Thymus-Stroma-Zellen und Thymozyten effizient von Zell-Zell-und Zell-extrazellulären Matrix-Verbindungen freigesetzt werden, und um eine Einzelzellsuspension zu bilden. Verwendung der isolierten Zellen können Multi Durchflusszytometrie, um die Identifizierung und Charakterisierung von TECs und dendritischen Zellen verwendet werden. Da TEC sind eine seltene Zellpopulation im Thymus, wir beschreiben auch eine effektive Möglichkeit zu bereichern und zu reinigen TEC durch abbau Thymozyten, die am häufigsten vorkommende Zelltyp im Thymus. FolloFlügel die Anreicherung, Zellsortierzeit kann verringert werden, so dass der Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen kann während der Reinigung von TEC minimiert werden. Gereinigten Zellen sind für verschiedene Downstream-Analysen wie Echtzeit-PCR, Western-Blot-und Gen-Expressionsprofilen. Das Protokoll wird die Forschung von TEC-Funktion und so gut wie die Entwicklung von in-vitro-T-Zell-Rekonstitution zu fördern.

Einleitung

Frühen T-Zell-Entwicklung werden Knochenmark hämatopoetische Stammzellen abgeleiteten multipotenten Vorläuferzellen an der Rinde des Thymus rekrutiert zogen Engagement der T-Linie und zu T-Zell-Vorläufer ^1. In der Rinde, T-Zell-Vorläufer-CD4 und CD8 doppelt negative (DN) Thymozyten erweitern und differenzieren sich in unreifen CD4 und CD8 doppelt positiven (DP) Thymozyten, bilden einen großen Pool von Vorläuferzellen mit sehr unterschiedlichen T-Zell-Rezeptoren ^1. Nur eine ausgewählte MHC-beschränkten Teilmenge von DP-Zellen werden CD4 oder CD8 einzigen positiven (SP) Thymozyten zu werden, wandern in der Medulla des Thymus und differenzieren sich in funktional zuständigen reifen T-Zellen, eine Veranstaltung, die als positive Selektion bezeichnet wird ^{2 6.} Im Gegensatz dazu Klone von autoreaktiven Thymozyten zogen negative Selektion und über Apoptose entfernt, um regulatorische T-Zellen, die für Selbst-Toleranz umgewandelt oder intraepitheliale Lymphozyten für Zwecke, die nicht klar sind, abgeleitet ^3,7-10.

Im Thymus Thymus-Stromazellen bilden eine einzigartige Mikroumgebung, die Signale für die verschiedenen T-Zell-Entwicklung Schicksale ^5,11,12. Einschließlich Rinden TECs (CTEC) und Mark TECs (mTEZ), dendritische Zellen, Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen, Neuralleiste stamm Perizyten und anderen mesenchymalen Zellen ^13-15 - Thymus-Stroma-Zellen von Thymus-Epithelzellen (TECs) besteht. Unter diesen sind TECs entscheidend auf den verschiedenen Stufen der T-Zell-Entwicklung ^1,2,16,17. Allerdings hat noch kein robuster Weg zu isolieren TEC ein umfassendes Verständnis ihrer Funktionen ¹⁶ behindert. Insbesondere CTEC, die eine dreidimensionale Netzwerk umgebenden Vorläuferzellen im Cortex zu bilden, sind für die positive Selektion ^13,18,19 aus Gründen, die nicht klar sind. Frühere Studien lieferten Hinweise auf die Heterogenität und die Rolle der TEC, meist unter Berufung auf morphologische und histologische Werkzeuge ¹³ . Vor kurzem hat die einzigartige Rolle der TEC Teilmengen wurden durch genetische Ansätze in Mausmodellen ^12,20 gerichtet. Eine robuste und reproduzierbare Weise zu isolieren TEC ist von grundlegender Bedeutung, um unvoreingenommene Charakterisierung von TEC Teilmengen, quantitative und qualitative Bewertung der TEC-Funktionen, und die Klärung der Mechanismen zu erreichen, wie CTEC unterstützt positive Selektion.

Aufgrund der Seltenheit von TECs im Thymus und den engen Wechselwirkungen sie im intakten Organ zu bilden, die Isolierung von TECs wurde schwierig. Das hier beschriebene Protokoll basiert auf früheren Entdeckungen, die derzeit erhältlichen Reagenzien, Techniken und Kenntnisse der Thymus Struktur und Stromazellen Zusammensetzung. Vor fast zwei Jahrzehnten wurden mehrere Verfahren berichtet, Thymus Gewebe ^21-27, in denen verschiedene Enzyme wurden während der Verdauung verwendet werden, einschließlich Trypsin, Collagenase und Dispase aufzuschlüsseln. Gray et al. verglichen diese Enzyme in ihrer precedure ²⁸ und berichtet eine verbesserte Method mit einem mehrstufigen Verdauung von Enzym-Cocktails, die ²⁹ wurde weit verbreitet ^20,30. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren eine lange Vorbereitungszeit und komplexe Schritte Verdauung und führt variable endgültige Zellzahlen und Mengenverhältnisse der TECs sogar in der gleichen Maus-Kohorte ^29,30. Vor einigen Jahren Liberase Research Grade Enzym enthält hoch gereinigte Kollagenase und neutraler Protease begonnen, in Thymus Gewebedissoziation ³⁰ verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Liberase Verdauung-basiertes Protokoll, mit optimierten mechanischen Trennverfahren, die eine hohe Anzahl von lebensfähigen TEC aus Maus-Thymus Gewebe ergibt. .

Dissoziiert Stromazellen zu bereichern, haben frühere Studien entweder Dichtegradienten oder Magnetkügelchen Trennung ^21,29 eingesetzt. , Verursachen jedoch beide Methoden schweren verloren bestimmter Populationen von Thymusstroma Zellen, insbesondere der Bevölkerung von ²⁹ CTEC. Zytotoxische Eliminierung und Panning-Techniken 31,32 sind weithin zur Abreicherung bzw. Abtrennung von Lymphozyten in dem immunologischen Gebiet ^12,31 verwendet. Nach dem Vergleich dieser Techniken haben wir die aktuellen Panning-Protokoll zur Anreicherung von TEC. Die sanfte Zustand während der Anreicherungsverfahren führt zu weniger Zelltod und unvoreingenommene und erhöhte TEC Erholung.

Die in Abschnitt 3 beschriebenen isolierten Thymus Zellsuspension kann direkt angewendet werden, um durchflusszytometrische Analyse fließen zur Identifizierung und Charakterisierung von TEC Teilmengen und dendritischen Zellen. Abschnitt 4 beschreibt eine einfache und nützliche Methode, um Untergruppen mit TEC Multi Durchflusszytometer zu identifizieren. Für Experimente, die gereinigt oder CTEC mTEZ, TEC Bereicherung und Zellsortierverfahren zu erhalten suchen, finden Sie in Kapitel 5 und 6 zu finden.

Protokoll

In dieser Studie Erwachsenen - wurden (6 8 Wochen) weibliche C57BL / 6 Mäuse verwendet. Mäuse wurden von der National Cancer Institute gekauft und unter spezifischen Pathogen freien Bedingungen gehalten. Die Universität von Minnesota Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt alle Tierversuche.

1. Vorbereitung der Instrumente und Puffer

1. Vorbereitung Enzymlösung (RPMI1640-Medium mit 0,05% [w / v] von Liberase TH und 100 U / ml DNase I), Albumin-reichen Puffer (1X PBS [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} -freiem] mit 0,5% Rinderserum Albumin und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]), FACS-Puffer (1 × PBS [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} -freiem], enthaltend 1% fötales Rinderserum [FBS] und 0,02% NaN _3), FACS Sortierpuffer (1X PBS [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} -freiem], enthaltend 2% FBS) und RP10 Medium (RPMI-1640-Medium mit 10% FBS zugeführt wird).
2. Bereiten Sie 10 Panning-Platten. Vorbereitung 40 ml Beschichtungslösung (0,01 mg / ml GHafer anti-Rat IgG in 0,1 M NaHCO _3-Puffer) und 4 ml Beschichtungslösung in jede 100 x 15 mm-Platte, Wirbel und Inkubation bei 4 ° CO / N. Abgießen Antikörperlösung und spülen Sie die Platte mit 5 ml 1x PBS für 2-fache, wirbeln kräftig zwischen Spülungen. Bewahren Sie die vorbereiteten Platten bei 4 ° C.

2. Ernte des Thymus Tissue

1. Einschläfern Maus in einem CO ₂ Kammer. Legen Sie das Tier auf dem Rücken auf einer Matte Dissektion, stecken Sie die Füße auf der Matte und nass das Fell durch Besprühen mit 70% Ethanol.
2. Machen Sie eine Mittellinienschnitt durch die Haut, ausgehend von dem oben Harnröhrenöffnung gerade nach oben, um den Unterkiefer mit Schere und erweitern den Schnitt nach unten bis zu den Knien auf beiden Seiten. Der Schnitt sieht aus wie ein umgedrehtes "Y". Ziehen Sie die lose Haut wieder an den Seiten, und stecken Sie es in die Dissektion Matte.
3. Punktion der Membran von dem Schwertfortsatz, schneiden Sie die Rippen auf jeder Seite bis zu dem Schlüsselbein, dann heben Sie die Rippen mitPinzette und stecken Sie es in die Dissektion Matte. Der Thymus ist nur unter den Rippen, und sieht aus wie zwei dünnen weißen Lappen, die über dem Herzen (Abbildung 1). Trennen Bindegewebe rund um den Thymus, ziehen Sie vorsichtig und entfernen Sie das Paar Thymus Lappen mit gebogenen Pinzette Wellenschliff. Ort Thymus Lappen in eine 6-Well-Platte mit 5 ml RPMI-1640.

3. Vorbereitung der Thymusstroma Cells

1. Trim umgebenden Fett-und Bindegewebe und übertragen Sie die Thymus Lappen zu einem neuen Brunnen der 6-Well-Platte mit 5 ml frisch zubereiten Enzymlösung. Machen kleine Schnitte in den Thymus Lappen mit einer feinen Schere, und Inkubation der Platte bei 37 ° C für 20 min.
2. Vorsichtig pipettieren verdauen Thymusgewebes oben und unten 2 - 3 mal mit 5 ml Pipette für Gewebedissoziation. Sammeln Standsfraktion in einer 50-ml-Röhrchen mit 10 ml kaltem albuminreichen Puffer, Enzyme zu neutralisieren. Halten Sie den Sammelröhrchen auf Eis. 2.5 hinzufügenml Enzymlösung zu der verbleibenden Gewebes und Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 15 min.
3. Führen sanfte mechanische Bewegung mit einem 3-ml-Spritze und 18 G-Nadel, um Aggregate aufzubrechen. Pool Überstand in das Sammelrohr. Hinzufügen von 2,5 ml Enzymlösung zu der verbleibenden Gewebes und Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 15 min.
4. Wiederholen sanfte mechanische Bewegung mit einem 3-ml-Spritze und einer 25 G-Nadel, und Inkubation der Platte zusätzliche 5 - 10 min.
5. Nach der vollständigen Verdauung, bündeln den Überstand in das Sammelrohr. Zentrifuge wird das Sammelrohr bei 400 × g, 4 ° C für 8 Minuten, um die Zellen zu sammeln. Saugen Sie die Flüssigkeit und die pelletierten Zellen in 10 ml auszusetzen Albumin-reiche Puffer und Filter die Probe durch 100 mm Maschen. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Führen Sie dann Fluss cytometic Analyse (Abschnitt 4) oder TEC Bereicherung (§ 5).

4. Identifizierung von TEC mittels Durchflusszytometrie

1. Vorbereitung der Zellen bis zu einer Endkonzentration von 4 x 10 ⁶ Zellen pro 100 ul in FACS-Puffer für die Färbung in einer 96-Well-Rundboden-Testplatte und halten die Platte auf Eis. Mit 20 ul Fc Blocklösung (anti-CD16 / CD32-Antikörper bei 10 ug / ml in FACS-Puffer) zu den Zellen und Inkubieren der Zellen für 10 min auf Eis. Drehen Sie die Platte bei 400 g, 4 ° C für 3 min. Verwerfen Flüssigkeit aus Brunnen durch Schwenken der Platte nach unten in ein Waschbecken.
2. Suspendieren die pelletierten Zellen in 100 ul Antikörper-Cocktail (anti-CD45, -EpCAM, -MHC Klasse II, und -Ly51 Antikörper und die UEA-1-Lektin mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen an Hersteller gekennzeichnet empfohlen oder getestet optimalen Konzentrationen jedes Antikörpers in FACS-Puffer ) und Inkubation der Zellen auf Eis für 20 Minuten im Dunkeln. Zur Kompensation Fleck 1 x 10 ⁶ Zellen, die mit jedem einzelnen Fluorochrom.
3. 100 l FACS-Puffer in jede Vertiefung und drehen Sie die Platte bei 400 g, 4 ° C für 3 min. Wiederholen Sie den Waschschritt einZeit, und dann Zellen in 100 ul FACS-Puffer. Übertragung der Zellen auf eine 12 x 15 mm-Rund FACS-Röhrchen mit 300 ul FACS-Puffer gefüllt. Erwerben Proben auf Durchflusszytometer und Daten mit Hilfe der FACS-Analyse-Software zu analysieren. TEC Gating-Strategie ist in Abbildung 2 dargestellt.

5. Anreicherung von TEC durch Schwenken

1. Spin-Down der Thymus-Zellen (in Abschnitt 3 hergestellt) bei 400 g, 4 ° C für 5 min. Aspirieren der Flüssigkeit und der pelletierten Zellen in FACS-Sortierpuffer auszusetzen bei einer Konzentration von 2 x 10 ⁸ Zellen pro ml in einem 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen. Fügen Anti CD90.2-Antikörpers (Klon 30-H12) (oder anti-CD45) bei einer Endkonzentration von 2,5 ug / ml Zellsuspension und inkubieren Zellen vorsichtig auf einem Rotationsmischer bei 4 ° C für 30 min. Nach der Inkubation, Waschen mit einer 5 - 10-fach Volumen von RP10 Medium und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g, 4 ° C für 5 min.
2. Saugen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren pelletierten Zellen inRP10-Medium bei einer Konzentration von 1 x 10 ⁷ pro ml. 5 ml Zellsuspension auf jeden beschichteten Schwenkplatte (in Schritt 1.3 vorbereitet), Wirbel und Inkubation für 30 min bei RT. Wirbeln kräftig; die Überstände wurden in einem konischen Rohr. Spülen Sie die Platte zweimal mit RP10 Medium und den Pool des Überstände in das Sammelrohr.
3. Zentrifugieren Sie das Sammelrohr bei 400 × g, 4 ° C für 5 min. Saugen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren pelletierten Zellen in 5 ml Medium RP10. Fügen Sie die Zellsuspension auf eine neue Platte Panning, schwenken und Inkubation für 30 min bei RT. Sammeln die Zellen spülen Sie die Platte und bündeln sie zu einem konischen Rohr. Sobald TEC angereichert sind, Spin-Down der Zellen bei 400 g, 4 ° C für 5 min und Suspend-Zellen in 5 ml FACS-Sortierpuffer.

6. Reinigung von TEC durch Zellsortierung

1. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bereiten Zellsuspension mit einer Konzentration von 4 x 10 ⁷ Zellen in FACS-Sortierpuffers. Antikörper des hinzufügencribed in Abschnitt 4.4 in Zell-Lösung und Inkubation Zellen vorsichtig auf einem Rotationsmischer bei 4 ° C für 30 min. Nach der Färbung, Wäsche und Zellen zu suspendieren, um eine Konzentration von 10 x 10 ⁶ Zellen pro ml FACS-Sortierpuffers.
2. Sortier TEC Teilmengen durch ein 100 uM Düse mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung. Sortiert Zelle werden in 30% (v / v) FBS in RPMI-1640) gesammelt. Sobald Zellsortierung wird, Zentrifuge Zellen durchgeführt bei 400 g, 4 ° C für 5 min und die Vorbereitungen für Downstream-Analyse.

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll wurde ein Thymus Organ von einer erwachsenen Maus (Abschnitt 2) und einer Thymus-Zellsuspension entfernt wurde, wie in Abschnitt 3 skizzierten Die erhaltene Zellsuspension bestand aus Thymozyten hämatopoetischen abgeleiteten Stromazellen und nicht-hämatopoetischen Stromazellen. CD45 ist ein hämatopoetischer pan-Marker exprimiert auf beiden Thymozyten und hämatopoetische stromale Zellen, wie Makrophagen und dendritischen Zellen. Im Gegensatz dazu sind TECs nicht hämatopoetischen Ursprungs und ni...

Diskussion

In dem Protokoll sind wichtige Schritte der Zubereitung des Thymus Stromazellen (Abschnitt 3) und die Anreicherung von TEC (Abschnitt 4). Es wird empfohlen, dass frische Enzymlösung wird jeweils hergestellt, und das Gewebe wird so bald wie möglich behandelt. Für gepoolt Thymi Optimierung des Volumens der Enzymlösung wird in Abhängigkeit von der Anzahl der Thymi erforderlich. Wenn eine Gewebereste nach der Verarbeitung zurückbleiben, zu Hinzufügen von mehr Enzymlösung und Verlängerung der Inkubationszeit Zellaus...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
Anti-mouse MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
Anti-mouse Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Flow cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa
Flow cell sorter	BD Biosciences	FACSAria
FACS tubes	BD Biosciences	352052
Flow cytometry analysis software	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.