JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

الخلايا الحية مصرف الطاقة الأيضية في شكل الدهون والكربوهيدرات وتستخدم هذه الطاقة لالحيوي والنقل الغشاء والحركة. يتم الحصول على بعض الطاقة في العصارة الخلوية من خلال تحويل السكريات الغذائية مباشرة إلى ATP خلال تحلل. ومع ذلك، يتم تسخير المصدر الرئيسي لإنتاج ATP في زنزانة داخل الميتوكوندريا عبر السلسلة التنفسية الميتوكوندريا 1. بنية الميتوكوندريا توفر التوجه المكاني الضروري لإنتاج ATP فعالية وكفاءة. الميتوكوندريا تمتلك غشاء مزدوج مفصولة مساحة intermembrane وجنبا إلى جنب مع المصفوفة، حجرة الميتوكوندريا أعمق، منزل مكونات وتنسيق التفاعلات الكيميائية تشارك في توليد ATP. يحتوي الغشاء الداخلي سلسلة من المجمعات بروتين محدد الغشاء الذي تتكون من السلسلة التنفسية وكذلك سينسيز اعبي التنس المحترفين، مجمع البروتين الذي يجلب ADP وبي معا لتشكيل ATP. نزليتم طي الغشاء إيه إلى أعراف ويتم تمرير الإلكترونات على طول سلسلة المجمعات الجهاز التنفسي عن طريق السيتوكروم ج، حاملة الإلكترون القابلة للذوبان والتي تتحرك بين المجمعات داخل الفضاء intermembrane. كما تتحرك الإلكترونات، والأكسدة للحد من حكمه يحدث ويتم ضخ أيونات الهيدروجين من المصفوفة إلى الفضاء intermembrane. ونتيجة لتركيز أيون عالية ضمن مساحة intermembrane، والتدرج الكهروكيميائية يبني مما أدى إلى غشاء المحتملة عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية (Δψ) 2. الأكسجين هو متقبل الإلكترون الأخير من سلسلة نقل الإلكترون، وتتدفق أيونات الهيدروجين من خلال synthases ATP من الفضاء intermembrane إلى المصفوفة، وبذلك مباشرة يسبب تشكيل ATP. وتعرف هذه العملية كما هو موضح في مجملها كما الفسفرة التأكسدية. طيات من أعراف زيادة المساحة السطحية للغشاء الداخلي، والسماح لنقل الإلكترون القصوى والإنتاج ATP داخلكل الحبيبات الخيطية. وتستمد البروتينات والإنزيمات والجزيئات الأخرى المشاركة في الفسفرة التأكسدية من كل من الجينات النووية والميتوكوندريا. الميتوكوندريا تحتوي الخاصة بهم DNA دائري، وترميز لمدة 13 البروتينات وكذلك tRNAs ومن mRNAs اللازمة لإنتاج ATP 3. ومع ذلك، هناك حاجة العديد من البروتينات، وبالتالي فهي النووية المشفرة. وتستهدف معظم هذه البروتينات المشفرة النووية إلى مصفوفة الميتوكوندريا عن طريق استخدام presequences في N-محطة من البروتين السلائف، ومدفوعة وارداتها في جزء من Δψ 4،5.

ما وراء المساهمة في الطاقة الحيوية من خلية، تؤثر الميتوكوندريا أيضا عمليات التمثيل الغذائي الكبرى مثل TCA وبيتا للأكسدة، مما يشير الخلوية من خلال تنظيم الكالسيوم، وكذلك دور رئيسي في موت الخلايا المبرمج 6. على وجه التحديد، اثناء اوقات التوتر الخلوي، البروتينات BCL-2 الأسرة الموجودة على أو تتفاعل في الغشاء الخارجي الميتوكوندريا يمكن أن يسبب الميتوكوندريانفاذية الغشاء الخارجي (MOMP) 7،8. خلال MOMP، يتم الإفراج السيتوكروم ج وبروتينات أخرى في العصارة الخلوية، وجنبا إلى جنب مع العديد من البروتينات عصاري خلوي تشكيل دعا مجمع للapoptosome 9،10. وapoptosome ينشط caspases التي تذهب إلى يلتصق البروتينات الخلوية وDNA خلال مرحلة التنفيذ من موت الخلايا المبرمج. في أقرب وقت كما يحدث MOMP، وانهارت ΔΨ وإنتاج ATP توقف. للخطر وهكذا، كما موت الخلايا المبرمج يبدأ ظيفة الميتوكوندريا والتغيرات في ΔΨ يمكن ربطها الميتوكوندريا وخلية الصحة 12. في حين موت الخلايا المبرمج هو نقطة النهاية في العديد من النماذج المرض، وظيفة الميتوكوندريا وتغييرات على ΔΨ يمكن أيضا أن تعطي معلومات قيمة عن نشأة المرض و / أو التقدم. على سبيل المثال، تم توثيق التغييرات الهيكلية والوظيفية الميتوكوندريا أثناء أمراض الاعصاب 13،14.

في الجزء الأول من البروتوكول، ISOيوصف lation من الميتوكوندريا سليمة التي تحتفظ ΔΨ بهم. تعرض خلايا HEK-293T لتركيزات ومجموعات من المؤتلف TNF-α، β-IL1 وIFN-γ مختلفة للحث على موت الخلايا المبرمج. وقد تم اختيار هذه السيتوكينات لأن ذكرت في كثير من الأحيان أن تكون عالية في الابتدائية عينات الصرف الصحي الإنسان (15) ومسار خارجي من موت الخلايا المبرمج يمكن أن يكون سببها تفاعل ملزمة لمستقبله 6 TNF-α. وبما أن هناك اختلافات دقيقة اللازمة لعزل الميتوكوندريا وظيفية من الأنسجة الابتدائية بالمقارنة مع الخلايا المستزرعة، ولأن الكثير من البحث ويستخدم الحيوانات، ويصف البروتوكول أيضا كيفية عزل الميتوكوندريا من الكبد والنخاع الشوكي من التصلب الجانبي الأمامي (ALS) نموذج الفأر.

وقد تم تطوير الجزء الثاني من بروتوكول لمراقبة الاضطرابات إلى إمكانية غشاء الميتوكوندريا باستخدام صبغة الفلورسنت حساسة إمكانات مع قارئ لوحة الفلورسنت. فرقوتختلف الصورة بين الحالة الخلوي (أي وصحية مقابل غير صحية) من خلال quantitating قوة ΔΨ الميتوكوندريا معزولة بالتعاون مع وكلاء فك ربط، وسلسلة مثبطات الجهاز التنفسي، ومثبطات معقدة وionophores، وكلها تسبب تبديد للإمكانات غشاء الميتوكوندريا. وصحة الميتوكوندريا، أكبر تغيير في ΔΨ على العلاج مع مثبطات الميتوكوندريا، وبالتالي فإن استجابة من الميتوكوندريا يمكن استخدام كمؤشر على الميتوكوندريا (DYS) وظيفة.

استخدام الميتوكوندريا المعزولة بدلا من التقييم في الموقع من وظيفة يقدم دليل قاطع على أن علم الأمراض أو علاج ينظم مباشرة تغييرات على عضية 16-18. في حين أن هناك أساليب في الأدب لعزل الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة، فهي غامضة 17 و / أو استخدام المعدات المتخصصة 16. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة العزل وغيرقابلة للتكيف بسهولة إلى خطوط الخلايا الأخرى، بما في ذلك الأنسجة والثقافات 13،14،19،20 الأولية. العديد من الدراسات الميتوكوندريا معزولة تستخدم نفس uncouplers ومثبطات الميتوكوندريا المستخدمة في هذا البروتوكول ولكن مع القطب كلارك (21 مثال تمثيلي من العديد من الأوراق في الأدب)، وهو مرة أخرى على قطعة محددة جدا ومتخصص من المعدات. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة التقليدية لديها قيود مثل انخفاض الإنتاجية وعالية التعقيد 22،23 ويتطلب كمية كبيرة من الميتوكوندريا (~ 500 ميكروغرام / رد فعل). في هذا البروتوكول، يتم استخدام الاستشعار الغشاء الفلورسنت المحتملين TMRE التحقيق بالاشتراك مع قارئ لوحة الفلورسنت، والذي هو آلة قياسية في العديد من المختبرات. ويعتبر على نطاق واسع منذ TMRE فإنه يدخل بسرعة الخلايا والميتوكوندريا معزولة، ويمكن استخدامها بتركيزات منخفضة 24. يمكن بسرعة ضبط ردود فعل متعددة تصل جنبا إلى جنب وتحليلها دفعة باستخدام هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، فإن رد الفعلالصورة تتطلب كمية صغيرة الكثير من الميتوكوندريا معزولة (~ 10 ميكروغرام / رد فعل). عن طريق اشتراط أقل من المواد والأنسجة أو ثقافة الخلية عينات أصغر يمكن أن تستخدم كنقطة انطلاق لالميتوكوندريا العزلة، ويمكن تعيين المزيد من مكررات أو ردود الفعل تصل، والمواد المحتمل أن يكفي لغيرها من التجارب الميتوكوندريا المعزولة مثل إنتاج ATP، واستهلاك الأكسجين، أو استيراد المقايسات ممكنة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تتفق جميع التجارب على الحيوانات إلى المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية وتمت الموافقة من قبل جامعة ويك فوريست رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. وقد تم الحصول على أزواج خصبة للSOD1G93A [B6SJL-تيراغرام نتروز (SOD1-G93A) 1Gur] نموذج الفأر من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME). البرية من نوع (WT) من الإناث والذكور SOD1G93A Nontransgenic [B6SJL-تيراغرام نتروز (SOD1-G93A) 1Gur] كانت ولدت لتوليد الفئران SOD1G93A وتتزاحم WT nontransgenic التي تم استخدامها في التجارب.

1. نماذج للتحقيق

  1. ثقافة الخلية
    1. الحفاظ على خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK-T293) الخلايا في DMEM تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل الجنين البقري، 1٪ البنسلين، الستربتومايسين، و 1٪ L-الجلوتامين، عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
    2. تنمو الخلايا في قوارير T75 والسماح لهم لتصل إلى 90٪ التقاء.
    3. تنفيذ تقسيم الخلية عن طريق trypsinization (0.25٪ التربسين-EDTA) لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ ، تثبيط التربسين مع حجم مساو من وسائل الاعلام الخلايا، والخلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 700 x ج في 4 ° C.
    4. نضح في وسائل الإعلام و resuspend بيليه خلية في وسائل الإعلام الثقافة.
    5. خلايا البذور في قارورة أو لوحة المناسبة 7 × 10 4 الخلايا في قارورة T75 48 ساعة قبل خلوى العلاج. هذا يجب أن تعطي ~ 70٪ الكثافة في وقت من العلاج.
    6. خلايا تجويع المصل بعد 24 ساعة بواسطة الشفط وسائل الإعلام واستبدالها مع نفس الحجم من المصل خالية وسائل الإعلام (DMEM، عقيم).
    7. إعداد TNF-α، β-IL1، وIFN-γ، من مسحوق مجفف بالتجميد بالماء نقي للغاية بتركيزات العمل من 5 خريج / ميكرولتر، 10 نانوغرام / ميكرولتر، و 10 نانوغرام / ميكرولتر، على التوالي وإضافتها إلى الآبار / قوارير.
    8. مصل علاج تجويع الخلايا عن طريق إضافة السيتوكينات تذوب مباشرة إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية قوارير المناسبة. وتألفت العلاجات السيتوكينات الفردية، وهي مزيج من كل 3 (المشار إليها باسم "* 3")، أو ster يسودالمياه إيل كعنصر تحكم (المشار إليها باسم "0").
    9. احتضان الخلايا المعالجة لمدة 24، 48 أو 72 ساعة قبل التقييم والحصاد.
  2. تقييم بقاء الخلية
    1. جعل حل 5 ملغ / مل من 3- (4،5-dimethylthiazol-2-يل) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium (MTT) في برنامج تلفزيوني 1X.
    2. لوحات 12-جيدا، إضافة 100 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر وبلطف دوامة لضمان التوزيع حتى.
    3. احتضان لوحات لمدة 15 دقيقة، 1 ساعة على 37 درجة مئوية في CO 2 5٪، وتحقق تحت المجهر لوجود تلوين الأرجواني. إذا لم يكن هناك الأرجواني موجود، عباب مرة أخرى وتسمح للخلايا لاحتضان في 5 فترات دقيقة حتى لوحظ الأرجواني. وينبغي تحديد مقدار الوقت اللازم من قبل كل محقق.
    4. عن طريق تكرار pipettor، إضافة 700 ميكرولتر من MTT المذيبات (4 ملم حمض الهيدروكلوريك و 0.1٪ NP40 في الأيزوبروبانول) إلى كل بئر والصخور لوحة (ق) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة، أو حتى عن اللون الأرجواني تركت الخلايا . إذا الأرجوانيلا يأتي لون من الخلايا، إضافة إلى 200 ميكرولتر إضافية من المذيبات والاستمرار في دوامة.
    5. للتحليل، واتخاذ 100 ميكرولتر من كل بئر ومكان في لوحة 96-جيدا وتقرأ على قارئ لوحة باستخدام 570 نانومتر، والطول الموجي إشارة من 630 نانومتر، ولكن 595 نانومتر هو أيضا مقبول طالما يتم أخذ قراءات في ضبط متسقة.
  3. نموذج حيواني من ALS
    1. تتفق جميع التجارب على الحيوانات إلى المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية وتمت الموافقة من قبل جامعة ويك فوريست رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. وقد تم الحصول على أزواج خصبة للSOD1G93A [B6SJL-تيراغرام نتروز (SOD1-G93A) 1Gur] نموذج الفأر من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME). البرية من نوع (WT) من الإناث والذكور SOD1G93A Nontransgenic [B6SJL-تيراغرام نتروز (SOD1-G93A) 1Gur] كانت ولدت لتوليد الفئران SOD1G93A وتتزاحم WT nontransgenic التي تم استخدامها في التجارب.
    2. أداء التنميط الجيني مع الاشعال القياسية ضد SOD1 متحولة 25.

2. عزل الميتوكوندريا

ملاحظة: من المهم أن تعمل بسرعة وإبقاء كل شيء على الجليد في جميع أنحاء الداخلي.

  1. إعداد الميتوكوندريا العزلة عازلة (MIB)، العمود الفقري عازلة عزل الحبل (SC MIB) وعازلة التجريبية (EB)
    1. إعداد الحلول الأسهم التالية قبل الموعد المحدد لMIB وEB.
    2. جعل 1 M تريس / اجتماعات الأطراف عن طريق إذابة 12.1 غرام من قاعدة تريس في 70 مل من H 2 O. إضافة اجتماعات الأطراف الجافة للحصول على درجة الحموضة إلى 7.4. ضبط مستوى الصوت إلى 100 مل نهائي. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
    3. جعل 1 M Kphos عن طريق خلط 80.2 مل من K 2 هبو 4 و 19.8 مل من KH 2 PO 4. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
    4. جعل 0.2 M EGTA / تريس عن طريق إضافة 3.8 غرام من EGTA إلى 10 مل من H 2 O. إضافة 1 M تريس / اجتماعات الأطراف حتى يذوب، ~ 30-40 مل. ضبط 50 مل، تصفية العقيمة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن الرقم الهيدروجيني سيكون ~ 6.7.
    5. جعل 1 M الغلوتامات بجعل 10 مل من1 M محلول حامض الجلوتاميك. فلتر تعقيم وتخزين 4 ° C.
    6. جعل 1 M مالات بجعل 10 مل من 1 M حل من حمض الماليك. إضافة تريس / اجتماعات الأطراف إلى 50 ملم. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
    7. جعل MIB بتركيز 200 ملي السكروز، 10 ملي تريس / اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.4، و 1 ملي EGTA / تريس. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
    8. جعل SC MIB بتركيز 250 ملي السكروز، 20 ملي HEPES KOH-7.5 درجة الحموضة، 10 ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl 2، 1 ملم EDTA، 1 ملم EGTA، 1 ملم DTT، ومثبط البروتياز كوكتيل.
    9. جعل EB بتركيز 125 ملي بوكل، 10 ملي تريس / اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.4، 5 ملي الغلوتامات، 2.5 ملي مالات، 1 ملم K الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4 و 10 ملي EGTA / تريس. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
  2. إعداد المعدات قبل حصاد الخلايا.
    1. شطف عاء زجاجي والتجانس صغيرة مدقة ثلاث مرات مع الماء المعقم ومكان على الجليد.
    2. جمع العناصر الضرورية مثل الحفر القياسية، SCRA خليةبيرس، 1.5 مل، 15 مل و 50 مل أنابيب والحلول.
  3. الميتوكوندريا العزلة
    1. الخلايا المستزرعة
      1. لكل نوع العينة، واستخدام اثنين من قوارير T175 من الخلايا.
      2. تأكد من أن الخلايا هي ~ 90٪ متموجة واستخدامها في التجارب السيطرة، أو لوحة وعلاج كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.2.
      3. على رأس مقاعد البدلاء، وسائل الإعلام نضح وغسل الخلايا الملتصقة مرتين مع 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X في كل مرة.
      4. نضح العازلة وكشط قوارير لإزالة الخلايا الملتصقة من قاع القارورة.
      5. إضافة 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل قارورة، دوامة، ونقل إلى الفردية 15 مل أنابيب مخروطية ومكان على الجليد.
      6. مرة واحدة ويتم كشط، أنابيب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 700 x ج، 4 ° C باستخدام أجهزة الطرد المركزي كبار الجدول باستخدام الدوار الدلو المتأرجح.
      7. supernatants نضح و resuspend كل بيليه في 1 مل من MIB.
      8. الجمع بين كل من المعلقات ونقل إلى وعاء زجاجي صغير لالتجانس.
      9. إضافة MIBإلى السفينة حتى يصل عازلة في السطر الأول. التجانس الخلايا مع مدقة تعلق على الحفر على سرعة متوسطة لمدة ثلاثة يمر. تأكد من أن السفينة على الجليد خلال هذه الخطوة، لا لإزالة مدقة فوق السائل واستخدام سرعة ثابتة مع يمر مستمرة.
      10. نقل الحل المتجانس إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
      11. رسم الحل في حقنة 3 مل باستخدام قياس 18 بوصة 1 ½ إبرة وطرد مرة أخرى في أنبوب مخروطي على الجليد مع قياس 27 بوصة ½ الإبرة. احرص على طرد الحل ضد الجدار الداخلي للأنبوب لاستخدام تلك القوة لتعطيل غشاء الخلية.
      12. كرر الخطوات حقنة ليصبح المجموع خمس مرات.
      13. نقل الحل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600 x ج، 4 ° C في كبار الطرد المركزي الجدول باستخدام الدوار الدلو المتأرجح.
      14. إزالة بعناية طاف وتوزيعها بين ثلاثة أنابيب 1.5 مل.
        ملاحظة: Mitochondria هي في طاف بعد هذا أولا، وسرعة منخفضة تدور، في حين مكعبات أغشية الخلايا والخلايا غير منقطعة.
      15. أنابيب الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 10،000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      16. supernatants نضح والجمع بين الكريات في 100 ميكرولتر MIB ووضع على الفور على الجليد.
        ملاحظة: الميتوكوندريا هي في بيليه بعد هذا فائق السرعة تدور. سوف الميتوكوندريا الحفاظ على عادة غشاء المحتملة من أجل ~ 2-3 أيون الجليد بعد العزلة وهي الأكثر استقرارا كحل الأسهم تتركز في MIB.
    2. الميتوكوندريا العزلة من الأنسجة الماوس
      1. تخدير الماوس وفقا لبروتوكول IACUC. تعيين المرذاذ عند 5.0٪ للحث على التخدير. وأكد أن هذا الحيوان هو تخدير بسبب عدم وجود رد فعل لقرصة القدم أو لا ارادي وميض عند اقترب من العين أو استغلالها مع مسحة القطن. الحفاظ على الماوس تحت التخدير لإجراء العمليات الجراحية بأكمله عن طريق الحفاظ على المرذاذ بين 1.5٪ و 2.0٪.
      2. مريض بالحبايسي الكبد والنخاع الشوكي من كل حيوان ومكان منفصل في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X - / - لشطف بعيدا أي دم.
      3. للكبد، ونقل الأنسجة إلى وزن الطبق على الجليد وختم الى قطع صغيرة باستخدام شفرة حلاقة جديدة لمدة 1 دقيقة.
      4. إضافة الأنسجة وعازلة المناسب (MIB للكبد أو SC MIB للالحبل الشوكي) إلى وعاء حتى يصل عازلة في السطر الأول. التجانس الأنسجة مع مدقة باليد لمدة خمس يمر. تأكد من أن السفينة على الجليد خلال هذه الخطوة، لا لإزالة مدقة فوق السائل واستخدام سرعة ثابتة مع يمر مستمرة.
      5. نقل الخليط لتنظيف 15 مل الأنابيب.
      6. أنابيب الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 750 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      7. حفظ supernatants في أنابيب نظيفة ووضعها على الجليد.
        ملاحظة: الميتوكوندريا هي في طاف بعد هذا أولا، وسرعة منخفضة تدور، في حين مكعبات أغشية الخلايا والخلايا غير منقطعة.
      8. اعادة تعليق الكريات الحبل الشوكي طن 500 ميكرولتر من SC MIB.
      9. إعادة التجانس كل ثلاث مرات، إلا ملء السفينة في منتصف الطريق مع SC MIB هذا الوقت.
      10. نقل جناسة جديد لأنبوب جديد.
      11. الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 750 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      12. الجمع بين هذه supernatants الجديدة، والتي تحتوي على أكثر الميتوكوندريا، مع طاف الأول من كل عينة.
      13. أنابيب الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 10،000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      14. supernatants نضح و resuspend الكريات الكبد في 500 ميكرولتر من MIB والكريات الحبل الشوكي في 50 ميكرولتر SC MIB ووضع على الفور على الجليد.
        ملاحظة: الميتوكوندريا هي في بيليه بعد هذا فائق السرعة تدور. سوف الميتوكوندريا الحفاظ على عادة غشاء المحتملة من أجل ~ 2-3 أيون الجليد بعد العزلة وهي الأكثر استقرارا كحل الأسهم تتركز في MIB.
      15. إجراء فحص تركيز البروتين لتقدير تركيز الميتوكوندريا في الحل. اتبع التعليماتالصورة للاستخدام التجاري كيت فحص البروتين أو طريقة مماثلة 26. تركيزات نموذجية من الميتوكوندريا هي: قوارير 2 T175 عوائد ~ 2 ملغ / مل، 1 كبد الفأر ~ 3-5 ملغ / مل، و 1 الماوس الحبل الشوكي ~ 1-3 ملغ / مل.
  4. السيتوكروم ج الفحص باستخدام R & D الجرذ / الماوس السيتوكروم ج Quantikine ELISA كيت (مقتبس من بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة).
    1. مباشرة قبل وضع ردود الفعل، وتمييع الميتوكوندريا إلى 0.5 ملغ / مل تركيز العمل مع EB وتوزيع الميتوكوندريا المخفف في 1.5 مل أنابيب لردود الفعل (عادة 30-50 ميكرولتر من الميتوكوندريا في أنبوب).
    2. إضافة إما EB أو DMSO، في 1٪ من إجمالي حجم، إلى الميتوكوندريا المخفف واحتضان ردود الفعل على أعلى مقاعد البدلاء لمدة 7-10 دقيقة. ردود الفعل هذه هي مستقرة لمدة تصل إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة إذا كانت هناك حاجة لإطار زمني أطول.
    3. الميتوكوندريا بيليه بواسطة الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 10،000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والحذرلاي فصل طاف ووضع كل في منفصلة 1.5 مل أنابيب.
      ملاحظة: أنابيب يمكن أن تكون إما المجمدة في -20 ° C لتحليلها فيما بعد أو استخدامها على الفور.
    4. تحديد الإفراج عن السيتوكروم ج من مقارنة تركيز السيتوكروم ج في بيليه وطاف 27.
      1. إعداد العينات بواسطة الانحلال الكريات في حجم الأصلي للتفاعل مع 0.5٪ TX-100 في برنامج تلفزيوني 1X.
      2. لكل عينة، وإعداد 2 الآبار على لوحة ELISA، واحدة لبيليه الآن يذوب واحد لطاف من رد فعل من جانب إضافة 100 ميكرولتر من السيتوكروم ج المترافقة (استخدام مباشرة من الزجاجة)، بالإضافة إلى 100 ​​ميكرولتر من 0.5٪ Tx- 100 في برنامج تلفزيوني 1X، وبعد ذلك كل من بيليه أو طاف العينة.
      3. دوامة بلطف لوحة إعداد منخفض (مستوى 2-4) لمدة 20 ثانية إلى المزيج، وغطاء واحتضان لمدة 1 ساعة، 37 ° C.
      4. التالي، وغسل لوحة أربع مرات مع العازلة غسل المخفف وفقا لإنتاج موادتعليمات إيه في. إزالة أي حل الزائد عن طريق التنصت على الآبار على منشفة ورقية.
      5. المقبل، إضافة 150 ميكرولتر من 1: 1 A + B حل النامية من كل بئر واحتضان لوحة لمدة 20-30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
      6. وأخيرا، إضافة 50 ميكرولتر من حل توقف إلى كل بئر وأخذ قراءات الامتصاصية في 540 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. حساب كمية السيتوكروم ج الافراج بمقارنة كمية السيتوكروم ج في بيليه مقابل طاف لكل رد فعل.

3. تقييم الميتوكوندريا (DYS) وظيفة

  1. على الفور قبل أن يتم تحديد ردود الفعل تصل، وتمييع الميتوكوندريا إلى 0.5 ملغ / مل تركيز العمل مع EB ووضعها في 1.5 مل أنابيب لردود الفعل (تستخدم عادة 30-50 ميكرولتر من الميتوكوندريا في أنبوب).
  2. العلاجات الميتوكوندريا
    1. إضافة العلاجات المناسبة (EB السيطرة، 1 ميكرومتر FCCP مختلطة مع 50 نانومتر Valinomycin، 10 ميكرومتر روتينونو 5 ميكرومتر أوليغوميسين، 2 مم KCN، أو 200 ميكرومتر ADP، وتركيزات النهائية) للفصل بين ردود الفعل على 1/10 عشر إجمالي حجم الميتوكوندريا المخفف. احتضان ردود الفعل على أعلى مقاعد البدلاء لمدة 7 دقائق.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند التعامل مع هذه المواد كما تناول عرضي أو الامتصاص عن طريق الجلد يمكن أن تكون ضارة.
    2. تمييع TMRE، أعيد في الماء المعقم عند تركيز عمل 100 ميكرومتر وتخزينها في -20 ° C، إلى 2 ميكرومتر وإضافة حجم مساو لحجم رد الفعل الميتوكوندريا.
    3. احتضان ردود الفعل على أعلى مقاعد البدلاء لمدة 7 دقائق.
    4. الميتوكوندريا بيليه بواسطة الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 10،000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. تحميل نصف حجم طاف من كل عينة على طبق من ذهب 396 جيدا وقراءة مضان.
      ملاحظة: يجب أن يكون الأمثل الإثارة وانبعاث موجات من TMRE وفقا لتعليمات الشركة الصانعة باستخدام لوحة حجم والتي سيتم استخدامها لالفحص. استخدام معيار 384-جيدا لوحة سوداء مع 25 ميكرولتر من 1 ميكرومتر TMRE (تركيز رد الفعل النهائي) تم الحصول على أقوى إشارة باستخدام موجات الإثارة / الانبعاثات   485 نانومتر / 535 نانومتر.
    6. حساب فارق أضعاف في مضان بين التحكم (EB) وكل معاملة بقسمة قيمة مضان النسبية (RFU) تم الحصول عليها من قارئ لوحة للعينة التجريبية التي RFU من العينة الضابطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

علاج الخلايا HEK-293T مع 200 جزء من الغرام / مل TNF-α، 40 نانوغرام / مل IL1-β، و 75 نانوغرام / مل IFN-γ (* 3) لمدة 24-48 ساعة يؤدي إلى كميات التدريجي للموت الخلايا (الشكل 1A ). تم تقييم بقاء الخلية باستخدام المقايسات MTT ويوضح باستمرار أن هناك ~ انخفاض بنسبة 10٪ في بقاء الخلية مع العلا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

علاج الخلايا HEK-293T مع السيتوكينات المؤتلف تسبب كميات معتدلة من موت الخلايا خلال 48 ساعة (الشكل 1). كمية من موت الخلايا الناجم عن العلاج TNF-ألفا مشابه لدراسات نشرت سابقا 30 وتنخفض بقاء الخلية بعد المشاركة في إدارة السيتوكينات المتعددة التي هي أكبر من كميات ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
L-glutamic acidSigmaG1251Can use the potassium salt instead.
malic acidSigmaM8304Can use the potassium salt instead.
KH2PO4SigmaP0662
K2HPO4SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma baseSigmaT6066
MOPSSigmaM3183
CCCPSigmaC2920Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
ValinomycinSigmaV0627Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucroseFisherS5-500
KCNMallinckrodt6379Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenoneSigmaR8875Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycinSigmaO4876Highly toxic. Made in ethanol.
ADPSigmaA2754
TMRESigma8717-25mgDilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEMGibco11965-0841x regular (high glucose).
Pen/StrepInvitrogen15140-155
L-glutamineFisherSH3002101Store aliquots at -20 °C
FBSLonza14-501FUS origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Protien Assay Dye (5x)Bio-Rad500-0006Any protein assay can substitute.
BSAFisherBP1600-100Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powderSigmaM2128Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)SigmaNP40S
Recombinant Human IL-1BGibcoPCH08014Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alphaGibcoPHC3015L
Recombinant Human IFN-gammaGibcoPHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kitR&D systemsDTC0Human for HEK-293T cells. 

References

  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
  2. Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
  3. Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
  4. Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
  5. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
  6. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  7. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714(2013).
  8. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404(2009).
  9. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
  10. Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
  11. Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
  12. Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
  14. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
  15. Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
  16. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
  17. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
  18. Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
  19. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
  20. Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
  21. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
  22. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
  23. Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
  24. Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  27. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
  28. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  29. Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
  30. Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493(2013).
  31. Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
  32. Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
  33. Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
  34. Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  35. Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
  36. Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
  37. Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
  38. Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97 TMRE ALS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved