JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Özet

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Giriş

Yaşayan hücreler yağ ve karbonhidrat şeklinde metabolik enerjiyi banka ve biyosentezi, membran taşıma ve hareket için bu enerjiyi kullanır. Bazı enerji glikoliz sırasında doğrudan ATP içine beslenme şekerlerin dönüşüm yoluyla sitosol içinde elde edilmektedir. Bununla birlikte, bir hücre ATP üretiminin başlıca kaynağı mitokondriyal solunum zincirinde 1 ile mitokondri içinde yararlanır. mitokondri yapısı, etkili ve verimli bir ATP üretimi için gerekli olan uzaysal yönlendirilmesini sağlar. Mitokondri bileşenleri bir zarlar arası boşluk ve birlikte matris içteki mitokondriyal bölme, ev ile ayrılmış bir çift zar sahip ve ATP üretimi dahil kimyasal reaksiyonları koordinat. iç zarı solunum zinciri gibi ATP sintaz, ATP oluşumu için bir araya ADP ve Pi getiren protein kompleksi ihtiva zara bağlı protein komplekslerinin bir dizi içerir. haner membran kristalı içine katlanmış ve elektronlar sitokrom-c, zarlar arası alanı içinde kompleksleri arasında hareket eden bir çözünür elektron taşıyıcı aracılığıyla solunum zinciri kompleksleri boyunca iletilir. Elektronlar hareket ettikçe, indirgeyici eşdeğerleri oksidasyon oluşur ve hidrojen iyonları zarlar arası boşluğa matristen pompalanır. Zarlar arası alanı içinde yüksek iyon konsantrasyonunun bir sonucu olarak, bir elektrokimyasal gradyan iç mitokondriyal zarın (Δψ) 2 üzerinde bir zar potansiyeli elde oluşturur. Oksijen elektron taşıma zincirinin son elektron alıcısı ve hidrojen iyonları matriks geri arası boşluğa ATP sentezler akan ve bunu doğrudan yaparken ATP oluşumuna neden olur. Bütünüyle tarif edildiği gibi bu işlem, oksidatif fosforilasyon gibi bilinmektedir. krista kıvrımlar maksimal elektron taşıma ve ATP üretimi içinde sağlayan, iç zarı yüzey alanını arttırmakHer mitokondri. proteinler, enzimler ve oksidatif fosforilasyon ile ilgili diğer moleküller, nükleer ve mitokondriyal genlerin elde edilir. Mitokondri 13 protein olarak tRNA'ların ve ATP üretimi için gerekli olan 3 mRNA için kendi dairesel DNA kodlama içerir. Bununla birlikte, çok daha fazla protein gereklidir ve böylece kodlanan nükleer bulunmaktadır. Bu, nükleer-şifrelenmiş proteinlerin çoğunluğu ön-madde proteininin N-terminalinde presequences kullanımı ile mitokondrial matris hedeflenir ve bunların alma Δψ 4,5 kısmen tahrik edilir.

Bir hücrenin Biyoenerjetiğin katkıda ötesinde, mitokondri, aynı zamanda, TCA ve beta-oksidasyon düzenleyen kalsiyum yoluyla hücresel sinyal, aynı zamanda apoptoz 6 önemli bir rol olarak önemli metabolik süreçleri de etkilemektedir. Özellikle, hücresel stres zamanlarında, üzerinde ikamet veya BCL-2 ailesi proteinleri mitokondriyal neden olabilir mitokondriyal dış membran etkileşimdış membran geçirgenliği (MOMP) 7,8. MOMP sırasında, sitokrom C ve diğer proteinlerin çeşitli sitosolik proteinler ile birlikte karmaşık bir apopitozom 9,10 adı oluşturan sitozolüne yayımlanan ve edilmektedir. apopitozom apoptoz yürütme aşamasında hücresel proteinler ve DNA parçalamak için gitmek kaspazlan harekete geçirir. MOMP meydana bitmez, ΔΨ çöktü ve ATP üretimi durdurdu. Bu nedenle, apoptoz gibi başlatılır mitokondriyal fonksiyonu ele geçirilmiş ve ΔΨ değişiklikler mitokondriyal ve hücre sağlık 12 ile korele edilebilir. Apoptoz da hastalık oluşmasından ve / veya ilerlemesi hakkında değerli bilgiler elde edebilirsiniz birçok hastalık modelleri, ΔΨ için mitokondriyal fonksiyon ve değişiklikler bir son nokta iken. Örneğin, mitokondriyal yapısal ve fonksiyonel değişiklikler nörodejeneratif hastalıkların 13,14 sırasında belgelenmiştir.

Protokol, iso ilk bölümündeonların ΔΨ muhafaza sağlam mitokondri lation tarif edilmektedir. HEK-293T hücreleri apoptozisini sağlamak için farklı konsantrasyonlarda ve yeniden birleştirici TNF-α, IL1-β ve IFN-γ kombinasyonlarına maruz bırakıldı. Sık sık kendi reseptörüne bağlanmasının 6, TNF-α etkileşimi tarafından tetiklenebilir primer insan septik örnekleri 15 ve apoptoz harici yolunun yüksek olduğu rapor edilmiştir, çünkü bu sitokinler seçilmiştir. Kültürlenmiş hücreler ile karşılaştırıldığında, primer dokulardan işlevsel mitokondria izole etmek için gerekli ince varyasyonlar olduğundan çok fazla araştırma hayvanları kullandığı için, ve protokol, aynı zamanda, karaciğer ve lateral skleroz (ALS) fare modeli ön omurilik ile ilgili mitokondri izole açıklamaktadır.

protokolü ikinci bölümü bir flüoresan plaka okuyucusu ile potansiyel duyarlı fluoresan boya kullanılarak mitokondriyal membran potansiyeli düzensizlikler izlemek için geliştirilmiştir. FarkHücresel durumu (sağlıksız vs yani, sağlıklı) arasındaki ın mitokondrial membran potansiyelinin dağılımı neden bütün bunlar ayrılması ajanlar, solunum zinciri inhibitörleri, karmaşık inhibitörleri ve iyonoforlar ile birlikte izole mitokondri ΔΨ gücünü nicelleştirilmesiyle ayırt edilir. Bu nedenle mitokondri tepki mitokondriyal (dis) fonksiyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir mitokondriyal inhibitörleri ile tedavi üzerine ΔΨ değişimi geniş, mitokondri sağlıklı.

Yerine fonksiyonunun yerinde değerlendirilmesi daha izole mitokondri kullanımı patoloji veya tedavi doğrudan organele 16-18 değişiklikleri modüle kesin kanıt sunmaktadır. Kültürlü hücrelerden mitokondri izole etmek literatürde yöntemler varken, bunlar belirsizdir 17 ve / veya özel ekipman 16 kullanmaktadır. Bu protokol detaylı izolasyon yöntem açıklanır ve birbirincil doku ve kültürler 13,14,19,20 dahil olmak üzere diğer hücre çizgileri, kolayca uyarlanabilir. Birçok izole mitokondri çalışmaları bu protokolde ama Clark elektrodu ile kullanılan aynı mitokondriyal eşleşmeyenler ve inhibitörleri tekrar ekipman çok özel ve özel parça, (21 literatürde birçok kağıtları temsili bir örnektir) kullanmaktadır. Ayrıca, bu, geleneksel bir yöntem, düşük verim ve yüksek bir karmaşıklık 22,23 gibi sınırlılıklara sahiptir ve mitokondri önemli miktarda (~ 500 ug / reaksiyon) gerektirir. Bu protokol, floresan zara algılama potansiyel sistemi TMRE standart makine birçok laboratuvarda bir floresan plaka okuyucu ile birlikte kullanılır. Bu hızlı bir şekilde hücreler ve izole mitokondri girer ve düşük konsantrasyonlarda 24 kullanılabilir çünkü TMRE yaygın olarak kabul edilmektedir. Çoklu reaksiyonlar hızla tandem kurulabilir ve toplu bu protokolü kullanılarak analiz. Ayrıca, reaksiyonin izole edilmiş bir mitokondri (~ / reaksiyon, 10 ug) 'in bir çok küçük bir miktar gerekmektedir. Daha az malzeme gerektiren, daha küçük doku ya da hücre kültürü numuneleri mitokondri izolasyonu için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir, daha çok kez tekrarlandı ve reaksiyon kurmak ve ATP üretimi, oksijen tüketimi, ithal gibi izole edilmiş bir mitokondri deneyleri için potansiyel olarak yeterince malzeme olabilir tahliller yapılabilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes uymakta ve Wake Forest Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fare modeli için üreyen Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) elde edilmiştir. Vahşi tip (WT) kadın, SOD1G93A erkek transjenik olmayan [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A fareler ve deneylerde kullanılan transjenik olmayan WT yavruları oluşturmak için üretildi.

Soruşturma için 1. Modelleri

  1. Hücre kültürü
    1. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de, insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-T293),% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM içinde hücreler, muhafaza edin.
    2. T75 matara hücreleri büyümek ve onları% 90 izdiham ulaşmak için bekleyin.
    3. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca, tripsinizasyon (% 0.25 Tripsin-EDTA) vasıtasıyla hücre bölme yapın 700 x g de 4 ° C 'de, 5 dakika için bir hücre aynı hücre ortamı hacmi, ve santrifüj ile tripsin inaktivasyonu.
    4. Medya aspire ve kültür ortamında hücre pelletini.
    5. 7 x 10 4 hücreleri T75 içinde uygun bir şişe ya da levha tohum hücreleri tedavi sitokin önce 48 saat şişe. Bu tedavi sırasında% 70 ~ yoğunluğu vermelidir.
    6. Serum açlıktan ölüyor hücreleri, 24 saat sonra ortam aspire edilmesiyle ve serumsuz ortam, aynı hacimde (DMEM, steril) ile değiştirerek.
    7. 5 ug / ul, 10 ng / ul çalışma konsantrasyonlarda ultra saf su ile liyofilize edilmiş toz, TNF-α, IL1-β ve IFN-γ, hazırlama, ve 10 ng / ml, sırasıyla ve çukurlara eklemek / matara.
    8. Tedavi, serum, doğrudan uygun şişe hücre kültür ortamına çözünür sitokinlerin ilave edilerek hücreler aç. Tedaviler, tek tek sitokinlerin her bir 3 kokteyl oluşuyordu (şekilde "* 3" olarak anılacaktır) ya da sterBir kontrol olarak Ile su ("0" olarak anılacaktır).
    9. Değerlendirme ve hasattan önce 24, 48 ya da 72 saat tedavi hücreleri inkübe.
  2. Hücre canlılığı değerlendirmesi
    1. 1x PBS içinde 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 'in bir 5 mg / ml solüsyon -2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) konur.
    2. 12 oyuklu plakalar için, her bir göze MTT çözeltisi 100 ul ve hafifçe eşit dağılımını sağlamak için girdap.
    3. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de 15 dakika ila 1 saat boyunca inkübe edin ve mor renk değişikliği için bir mikroskop altında bakın. Mor bir mevcut ise, yeniden girdap ve mor gözlenene kadar, hücreler 5 dakika aralıklarla inkübasyona izin verin. Gerekli olan zaman miktan, her bir araştırmacı tarafından belirlenmelidir.
    4. Tüm mor renk hücreleri bıraktığı kadar tekrar pipet kullanarak, her bir MTT çözücü (izopropanol içinde 4 mM HCl ve% 0.1 NP-40), 700 ul ve 5-10 dakika boyunca, oda sıcaklığında bir plaka (lar) kaya ya da . Mor iserenk, hücre çıkan çözücü ilave 200 ul ve girdap devam etmez.
    5. Kaynaklar tutarlı ayarlar alındığı gibi, ancak 595 nm sürece, aynı zamanda kabul edilebilir olduğu, analiz için, her bir gözden 100 ul alır ve bir 96-çukurlu plaka içine koyun ve 570 nm kullanılarak bir plaka okuyucusu ile 630 nm'lik bir referans dalga boyu ile oku.
  3. ALS Hayvan Modeli
    1. Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes uymakta ve Wake Forest Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fare modeli için üreyen Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) elde edilmiştir. Vahşi tip (WT) kadın, SOD1G93A erkek transjenik olmayan [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A fareler ve deneylerde kullanılan transjenik olmayan WT yavruları oluşturmak için üretildi.
    2. Mutant SOD1 25 karşı standart primerler ile genotiplendirmesi gerçekleştirin.

Mitokondri 2. izolasyonu

NOT: Bu hızlı çalışır ve işlem boyunca buz üzerinde her şeyi tutmak için önemlidir.

  1. Mitokondriyal yalıtım tamponu (MIB), omurilik yalıtım tamponu (SC MIB) ve deney tampon hazırlanması (EB)
    1. Öncesinde MIB ve EB için zaman aşağıdaki stok çözümleri hazırlayın.
    2. H2O, 70 ml Tris baz, 12.1 g çözülmesiyle 1 M Tris / MOPS yapmak 7.4 pH almak için kuru MOPS ekleyin. 100 ml finale ses seviyesini ayarlayın. 4 ° C'de sterilize Filtresi ve mağaza.
    3. 80.2 K 2 HPO 4 ml ve KH 2 PO 4 19.8 ml karıştırarak 1 M Kphos olun. Oda sıcaklığında saklayınız.
    4. H2O ile 10 ml EGTA, 3.8 g eklenmesi ile 0.2 M EGTA / Tris yapmak Çözülmüş, ~ 30-40 ml kadar 1 M Tris / MOPS ekleyin. 50 ml oda sıcaklığında steril filtre ve saklamak için ayarlayın. PH ~ 6.7 olacağını unutmayın.
    5. 10 ml yaparak, 1 M Glutamat yapmakGlutamik asit 1 M çözelti. Filtre sterilize ve mağaza 4 ° C.
    6. Malik asit, 1 M solüsyon, 10 ml yaparak, 1 M MAlate'I sağlayın. 50 mM Tris / MOPS ekleyin. 4 ° C'de sterilize Filtresi ve mağaza.
    7. 200 mM sükroz, 10 mM Tris / MOPS, pH 7.4, 1 mM EGTA / Tris bir konsantrasyonda MIB sağlayın. 4 ° C'de sterilize Filtresi ve mağaza.
    8. 250 mM sükroz, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT ve proteaz inhibitörü kokteyli bir konsantrasyonda SC MIB olun.
    9. 125 mM KCl bir konsantrasyonda EB yapmak, 10 mM Tris / MOPS, pH 7.4, 5 mM glutamat, 2.5 mM malat, 1 mM K fosfat, pH 7.4 ve 10 mM EGTA / Tris yer alır. 4 ° C'de sterilize Filtresi ve mağaza.
  2. Hücrelerin hasat öncesinde Ekipmanları hazırlık.
    1. Küçük bir cam kap ve homojenleştirme havaneli steril su ile üç kez durulanır ve buz üzerine yerleştirin.
    2. Böyle bir standart matkap, hücre scra gerekli öğeleri toplayınpers, 1.5 mi, 15 ml ve 50 ml tüpler ve çözeltiler.
  3. Mitokondri İzolasyon
    1. Kültür Hücreler
      1. Her bir numune tipi için, hücreler iki T175 şişelerde.
      2. Hücrelerdir ~% 90 konfluent sağlanması ve kontrol deneyi, ya da levha olarak kullanmak ve adım 1.2, yukarıda tarif edildiği gibi tedavi etmek.
      3. Ve tezgah üstüne, aspirat ortam üzerinde 1x PBS ve her seferinde 15 ml iki kez yapışkan hücreleri yıkayın.
      4. Tampon aspire ve şişenin tabanından yapışmayan hücreler giderilmiş şişeler kazıyın.
      5. Her bir şişeye, girdap 1x PBS 15 ml ilave edilir, ve buz üzerinde tek tek 15 ml konik tüp ve yer aktarın.
      6. Kazıma bir sallanan kepçeli rotor kullanılarak bir masa üstü santrifüj kullanılarak 700 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj tüpleri yapıldıktan sonra.
      7. Aspire süpernatantlar ve MIB 1 ml her pelletini.
      8. Her iki süspansiyonlar birleştirin ve homojenizasyon için, küçük bir cam kabına transfer edilir.
      9. MIB Eklegeminin tampon ilk satırı ulaşana kadar. Üç kez geçirilerek orta hızda bir uçlu havan tokmağı ile homojenize hücreleri. Damar sıvının üzerinde tokmağı kaldırmak ve sürekli paslar ile bir sabit hız kullanmak için değil, bu adımı sırasında buz üzerinde olduğundan emin olun.
      10. 50 ml'lik bir konik tüp homojenleştirilir çözeltisini.
      11. 18 gauge 1 ½ inç iğne kullanılarak bir 3 ml'lik enjektöre çözüm çizin ve bir 27 ölçü ½ inç iğne ile buz üzerinde tekrar konik tüp içine sınırdışı. Hücre zarı bozulması için o gücü kullanmak için tüpün iç duvarına karşı çözüm sınırdışı etmeye özen gösterin.
      12. Beş kez toplam şırınga adımları tekrarlayın.
      13. Sallanan kovalı rotor kullanılarak bir masa üstü santrifüjü içinde 600 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüje çözeltisini.
      14. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve üç 1.5 ml tüpler arasında dağıtmak.
        NOT: Mitochohücre zarları ve kesintisiz hücreleri topaklanır ise ndria, bu birinci, düşük hızlı bir dönüş sonra süpernatan içinde bulunmaktadır.
      15. 10.000 x g'de 5 dakika 4 ° C 'de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri.
      16. Aspire süpernatanları 100 ul MIB pelet birleştirmek ve hemen buz üzerine yerleştirin ve.
        Not: Mitokondri bu yüksek hızlı bir dönüş sonra pelet içindedir. Mitokondri tipik olarak izole edildikten sonra 2-3 iyon buz ~ onların membran potansiyeline sahiptirler ve MIB içinde konsantre edilmiş bir stok çözeltisi olarak en kararlı olacaktır.
    2. Fare dokularından Mitokondri izolasyon
      1. IACUC protokole göre fare anestezisi. Anestezi ikna etmek için% 5,0 bir buharlaştırıcı ayarlayın. Göz yaklaştı veya bir pamuklu çubukla vurdu zaman hayvan ayak tutam veya kırpma refleksinin için refleksi eksikliği ile anestezi olduğunu doğruladı. % 1.5 ile% 2.0 arasında Buharlaştırıcı'yı tutarak tüm cerrahi prosedür için anestezi altında fare tutun.
      2. Hariçimkb PBS 1x buz soğuk ayrı ayrı hayvan ve yerden karaciğer ve spinal kord - / - herhangi bir kan uzakta durulayın.
      3. Karaciğer için, buz üzerinde bir ağırlık çanak doku transferi ve 1 dakika boyunca taze jilet kullanarak ince parçalar halinde doğrayın.
      4. Tampon ilk satırı ulaşıncaya kadar kaba doku ve (omurilik için karaciğer ya da SC MIB için MIB) uygun tampon ekleyin. Beş geçer elle havan ile doku homojenize. Damar sıvının üzerinde tokmağı kaldırmak ve sürekli paslar ile bir sabit hız kullanmak için değil, bu adımı sırasında buz üzerinde olduğundan emin olun.
      5. Homojenatlar 15 ml tüpler temizlemek için aktarın.
      6. 750 x g'de, 10 dakika süre ile 4 ° C 'de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri.
      7. Temiz tüpler içine Süpernatantlar kaydedin ve buz üzerine koyun.
        Not: hücre zarları ve kesintisiz hücreleri topaklanır ise mitokondri, bu birinci, düşük hızlı bir dönüş sonra süpernatan içinde bulunmaktadır.
      8. Omurilik pelet yeniden askıya in SC MIB 500 ul.
      9. Sadece SC MIB ile damar yarım bu kez dolum, her üç kez yeniden homojenize.
      10. Taze tüp yeni Homojenat aktarın.
      11. Santrifüj 750 x g'de, 10 dakika süre ile 4 ° C 'de sabit açılı rotor.
      12. Her örnekten ilk süpernatant ile, daha fazla mitokondri içeren bu yeni süpernatanlan, birleştirin.
      13. 10.000 x g'de 5 dakika 4 ° C 'de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri.
      14. Aspire süpernatanları 500 MIB ul ve 50 ul SC MIB omurilik peletler karaciğer pelet tekrar süspansiyon ve hemen buz üzerine yerleştirin.
        Not: Mitokondri bu yüksek hızlı bir dönüş sonra pelet içindedir. Mitokondri tipik olarak izole edildikten sonra 2-3 iyon buz ~ onların membran potansiyeline sahiptirler ve MIB içinde konsantre edilmiş bir stok çözeltisi olarak en kararlı olacaktır.
      15. Çözelti içinde mitokondri konsantrasyonunu tahmin etmek için bir protein konsantrasyonu analizi gerçekleştirir. Talimatı uygulayınticari bir Protein Deney Kiti veya benzer bir yöntemle 26 ile s. Mitokondri tipik konsantrasyonlar şunlardır: 2 T175 şişesi verim ~ 2 mg / ml, 1 fare karaciğer ~ 3-5 mg / ml ve 1 fare omurilik ~ 1-3 mg / ml olmuştur.
  4. (Üretici tarafından sağlanan protokol uyarlanmış) Quantikine ELISA Kit c bir Ar-Ge Sıçan / Fare Sitokrom kullanarak sitokrom-c tahlil.
    1. Hemen tepkileri kurmadan önce, EB ile 0.5 mg / ml çalışma konsantrasyonu mitokondri sulandırarak reaksiyonları (tüp başına mitokondri tipik haliyle 30-50 ul) 1.5 ml tüpler içinde seyreltilmiştir mitokondri dağıtın.
    2. Seyreltilmiş mitokondri, toplam hacminin% 1, EB veya DMSO ya ekleyin ve 7-10 dakika tezgah üstünde tepkileri kuluçkaya yatmaktadır. Daha uzun bir zaman diliminde gerekli olup olmadığını Bu reaksiyonlar, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca stabildir.
    3. 10.000 x g'de 5 dakika ve dikkatli bir 4 ° C 'de sabit açılı rotor içinde santrifüjlemek suretiyle pelet mitokondrily süpernatant ayrı ve ayrı bir 1.5 ml tüpler her koyun.
      Not: tüpler her iki sonraki analiz için -20 ° C'de donduruldu ya da hemen kullanılabilir.
    4. Bir pelet ve süpernatan 27 sitokrom c konsantrasyonunun karşılaştırarak sitokrom c salınmasını belirler.
      1. 1x PBS içinde% 0.5 TX-100 ile reaksiyonun orijinal hacminin pelet çözündürülmesi ile örnekleri hazırlanır.
      2. Her numune için, ELISA plakasına 2 kuyu, hemen çözündürülmüş pelet için bir sitokrom C bitişik 100 ul ilave edilerek tepkime üstte yüzen madde için bir hazırlama (şişeden doğrudan kullanımı) artı% 0.5 Tx 100 ul 1x PBS içinde 100 ve daha sonra, tüm topak ya da süpernatan numunesi arasında.
      3. Yavaşça, Kapağı karıştırın ve 1 saat, 37 ° C inkübe 20 saniye plaka düşük ayar (seviye 2-4) girdap.
      4. Daha sonra, üretici göre plaka seyreltilmiş yıkama tamponu ile dört kez yıkayıner talimatları. Kağıt havlu üzerine kuyu dokunarak herhangi bir aşırı çözüm çıkarın.
      5. Her bir çukura 1 A + B geliştirme çözeltisi ve karanlıkta, oda sıcaklığında 20-30 dakika süre ile plaka inkübe: Daha sonra, 1 150 ul ilave edin.
      6. Son olarak, her bir durdurma çözeltisi 50 ul ve bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak 540 nm de absorbans okumaları alır. Her reaksiyon için yüzer genel peletindeki sitokrom c değeri ile karşılaştırılması suretiyle sitokrom C salınımı miktarını hesaplayın.

Mitokondriyal (Dys) fonksiyonu 3. Değerlendirme

  1. Reaksiyonları ayarlanır hemen önce, 0.5 mg mitokondri seyreltik / ml EB konsantrasyonu çalışma ve (mitokondri tipik haliyle 30-50 ul tüp başına kullanılır) reaksiyonlar için 1.5 ml'lik tüplere yerleştirildi.
  2. Mitokondriyal tedaviler
    1. 50 nM Valinomycin ile karıştırılır FCCP uygun tedavinin ekleyin (EB kontrol, 1 uM, 10 uM rotenon, 5 uM oligomycin, 2 mM KCN ya da 200 uM ATP, nihai konsantrasyon) ile seyreltildi mitokondri toplam hacmine inci 10/01 reaksiyonu da ayırmak için. 7 dakika tezgah üstünde reaksiyonları inkübe.
      NOT: zararlı olabilir deri yoluyla kazara yutulması veya emilim gibi bu maddeleri kullanırken dikkatli alınmalıdır.
    2. 100 uM'lik bir çalışma konsantrasyonunda steril su içinde yeniden teşekkül ettirilmiş ve 2 uM, -20 ° C'de saklandı, TMRE seyreltin ve mitokondriyal reaksiyon hacmine eşit bir hacim ilave edin.
    3. 7 dakika tezgah üstünde reaksiyonları inkübe.
    4. 10.000 x g'de 5 dakika 4 ° C 'de sabit açılı rotor içinde santrifüjlemek suretiyle pelet mitokondri.
    5. Yük, bir 396-kuyulu bir levha üzerine, her numune süpernatanı hacminin yarısı floresan okuyun.
      NOT: TMRE uyarma ve emisyon dalga boyları için kullanılacak hacim ve plaka kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak optimize edilmelidirdeneyi. Uyarım / emisyon dalga boyları kullanılarak 1 uM TMRE 25 ul standart 384 oyuklu siyah plaka (nihai reaksiyon konsantrasyon) ve en yüksek sinyal elde edildi kullanılarak   485 nm / 535 nm.
    6. Kontrol (EB) ve kontrol örneğinden RFU deneysel örnek için plaka okuyucu elde edilen göreceli floresan değerini (RFU) bölünmesi ile her tedavi arasında floresan kat-farkını hesaplayın.

Sonuçlar

200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng / ml IFN-γ ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi (x 3), 24-48 saat boyunca hücre ölümü aşamalı miktarlarda (Şekil 1A yol açar ). Hücre canlılığı MTT denemesi kullanarak değerlendirilmiştir ve sürekli olarak ~ 24 saat, tedaviden hücre canlılığını% 10 azalma ve 48 saat tedavi ile ~% 20'lik bir düşüş olduğunu göstermektedir edildi. Bireysel sitokinler ile benzer konsantrasyonlarda (100 ug / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng...

Tartışmalar

Rekombinant sitokinler ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi 48 saat (Şekil 1) üzerine hücre ölümü orta miktarda neden olur. TNF-alfa, muamele ile uyarılan hücre ölümünün miktarı önceki çalışmalara 30 benzer ve hücre canlılığı, tek başına de literatürde 31,32 ile uyumlu olan herhangi bir sitokin olan belirleyici miktarda daha büyük olan çok sayıda sitokin birlikte uygulanmasından sonra azalır. miktarları ve sitokin tedavileri türleri yanı sıra birey...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
L-glutamic acidSigmaG1251Can use the potassium salt instead.
malic acidSigmaM8304Can use the potassium salt instead.
KH2PO4SigmaP0662
K2HPO4SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma baseSigmaT6066
MOPSSigmaM3183
CCCPSigmaC2920Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
ValinomycinSigmaV0627Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucroseFisherS5-500
KCNMallinckrodt6379Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenoneSigmaR8875Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycinSigmaO4876Highly toxic. Made in ethanol.
ADPSigmaA2754
TMRESigma8717-25mgDilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEMGibco11965-0841x regular (high glucose).
Pen/StrepInvitrogen15140-155
L-glutamineFisherSH3002101Store aliquots at -20 °C
FBSLonza14-501FUS origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Protien Assay Dye (5x)Bio-Rad500-0006Any protein assay can substitute.
BSAFisherBP1600-100Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powderSigmaM2128Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)SigmaNP40S
Recombinant Human IL-1BGibcoPCH08014Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alphaGibcoPHC3015L
Recombinant Human IFN-gammaGibcoPHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kitR&D systemsDTC0Human for HEK-293T cells. 

Referanslar

  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
  2. Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
  3. Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
  4. Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
  5. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
  6. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  7. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
  8. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
  9. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
  10. Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
  11. Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
  12. Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
  14. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
  15. Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
  16. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
  17. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
  18. Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
  19. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
  20. Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
  21. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
  22. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
  23. Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
  24. Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  27. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
  28. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  29. Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
  30. Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
  31. Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
  32. Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
  33. Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
  34. Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  35. Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
  36. Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
  37. Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
  38. Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel BiyolojiSay 97MitokondriTMREsitokinlerALSHEK h crelerifloresanmitokondriyal disfonksiyonmitokondriyal membran potansiyelisitokrom C

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır