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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Zusammenfassung

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Einleitung

Lebende Zellen Bank Stoffwechselenergie in Form von Fetten und Kohlenhydraten und die Nutzung dieser Energie für Biosynthese, Membrantransport und Bewegung. Etwas Energie wird in das Cytosol durch die Umwandlung von diätetischen Zuckern direkt in ATP während Glykolyse erhalten. Jedoch ist die Hauptquelle für die ATP-Produktion in einer Zelle, in die Mitochondrien über das mitochondriale Atmungskette 1 genutzt. Die Architektur der Mitochondrien liefert die notwendige räumliche Orientierung für die effektive und effiziente Produktion von ATP. Mitochondrien besitzen ein Doppelmembran von einem Intermembranraum und zusammen mit der Matrix, dem innersten mitochondrialen Raum, Haus der Komponenten getrennt und zu koordinieren, die chemischen Reaktionen in ATP-Generation beteiligt. Die innere Membran enthält eine Reihe von membrangebundenen Proteinkomplexe der Atmungskette als auch die ATP-Synthase, den Proteinkomplex, ADP und Pi für die Bildung von ATP vereint umfassen. Das Gasthauser Membran in Cristae gefaltet und Elektronen entlang der Atmungskette Komplexe durch das Cytochrom c, einem löslichen Elektronenüberträger, die zwischen Komplexen im Intermembranraum bewegt sich übergeben. Elektronen bewegen, Oxidation von Reduktionsäquivalenten eintritt und Wasserstoffionen werden aus der Matrix in den Intermembranraum gepumpt. Als Folge der hohen Ionenkonzentration innerhalb des Intermembranraum, baut sich ein elektrochemischer Gradient was zu einem Membranpotential über die innere Mitochondrienmembran (Δψ) 2. Sauerstoff ist das endgültige Elektronenakzeptor der Elektronentransportkette, und Wasserstoffionen strömen durch die ATP-Synthase aus dem Intermembranraum zurück in die Matrix und in so direkt tun ATP-Bildung führen. Das Verfahren in seiner Gesamtheit beschrieben wird als oxidative Phosphorylierung bekannt. Die Falten der Cristae vergrößern die Oberfläche der inneren Membran, so dass für maximale Elektronentransport und die ATP-Produktion imjedes Mitochondrium. Die Proteine, Enzyme und andere Moleküle in der oxidativen Phosphorylierung beteiligt sind sowohl aus Kern- und mitochondrialen Genen abgeleitet. Mitochondrien ihre eigene kreisförmige DNA, kodierend für 13 Proteine ​​sowie tRNAs und mRNAs für die ATP-Produktion 3 notwendig. Jedoch sind viele andere Proteine ​​erforderlich ist, und somit sind nukleär kodierten. Die meisten dieser kerncodierte Proteine ​​an der mitochondrialen Matrix durch Verwendung Präsequenzen am N-Terminus des Vorläuferproteins gezielt und deren Import wird teilweise durch Δψ 4,5 angetrieben.

Über die zur Erreichung der bioenergetischen einer Zelle, Mitochondrien beeinflussen ebenfalls wichtige Wechselprozessen wie TCA und beta-Oxidation, zelluläre Signalwege, durch Regulieren Calcium, sowie eine zentrale Rolle bei der Apoptose. 6 Insbesondere in Zeiten der zellulären Stress, BCL-2-Familie Proteine, die am Wohnsitz oder die Interaktion an der mitochondrialen Außenmembran der Mitochondrien verursachenPermeabilität der äußeren Membran (MOMP) 7,8. Während MOMP sind Cytochrom c und anderen Proteinen in das Cytosol mit mehreren cytosolischen Proteine ​​freigesetzt, und bilden zusammen einen Komplex genannt apoptosome 9,10. Die Apoptosom aktiviert Caspasen, die gehen an zelluläre Proteine ​​und DNA während der Ausführungsphase der Apoptose zu spalten. Sobald MOMP auftritt, ΔΨ ist zusammengebrochen und die ATP-Produktion gestoppt. Somit ist, wie die Apoptose ausgelöst wird die Funktion der Mitochondrien beeinträchtigt und Veränderungen in ΔΨ können mitochondriale und Zellgesundheit 12 korreliert werden. Während die Apoptose ist ein Endpunkt in vielen Krankheitsmodelle, die Funktion der Mitochondrien und Änderungen ΔΨ können auch wertvolle Informationen über die Krankheit Entstehung und / oder Progression ergeben. Zum Beispiel haben die mitochondriale strukturelle und funktionelle Veränderungen im Verlauf von neurodegenerativen Erkrankungen 13,14 dokumentiert.

Im ersten Teil des Protokolls, isonung intakter Mitochondrien, die ihre ΔΨ behalten beschrieben. HEK-293T-Zellen wurden verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen von rekombinanten TNF-α, IL1-β und IFN-γ ausgesetzt, um die Apoptose zu induzieren. Diese Zytokine wurden ausgewählt, weil sie häufig berichteten hohen in primären humanen septischen Proben 15 und dem extrinsischen Weg der Apoptose kann durch die Wechselwirkung von TNF-α-Bindung an seinen Rezeptor 6 ausgelöst werden. Da es subtile Variationen notwendig funktionelle Mitochondrien aus primären Geweben zu isolieren, verglichen mit kultivierten Zellen und weil viel Forschung verwendet Tieren, beschreibt das Protokoll auch, wie Mitochondrien aus Leber und Rückenmark von anteriore laterale Sklerose (ALS) Mausmodell zu isolieren.

Der zweite Teil des Protokolls wurde entwickelt, um Störungen des mitochondrialen Membranpotenzials überwacht unter Verwendung eines potentialsensitiven Fluoreszenzfarbstoffes mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät. Unterschieds zwischen zellulären Status (dh gesunden vs. ungesunden) durch Quantifizieren der Stärke der ΔΨ von isolierten Mitochondrien in Verbindung mit Trennmitteln, die Atmungsketteninhibitoren, Komplex Inhibitoren und Ionophore, die alle Abfuhr des mitochondrialen Membranpotentials verursachen differenziert. Desto gesünder die Mitochondrien, je größer die Änderung ΔΨ bei Behandlung mit mitochondrialen Inhibitoren, damit die Reaktion von Mitochondrien kann als Indikator für die mitochondriale (Dysfunktionen) Funktion verwendet werden.

Die Verwendung von isolierten Mitochondrien statt in situ Einschätzung Funktion bietet endgültigen Beweise dafür, dass eine Pathologie oder Behandlung Änderungen an der Organelle 16-18 direkt moduliert. Es gibt zwar Methoden, die in der Literatur zu den Mitochondrien aus kultivierten Zellen zu isolieren, vage sind sie 17 ab und / oder Spezialausrüstung 16. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Isolierungsmethode undleicht an andere Zelllinien, einschließlich der Primärgewebe und Kulturen 13,14,19,20. Viele isolierte Mitochondrien Untersuchungen verwenden die gleichen mitochondrialen Entkuppler und Inhibitoren in diesem Protokoll, jedoch mit einer Clark-Elektrode verwendet wird (21 ist ein repräsentatives Beispiel für viele Arbeiten in der Literatur), die wiederum eine sehr spezifische und Spezialmaschine. Darüber hinaus hat diese traditionelle Methode Einschränkungen wie geringe Durchsatz und hohe Komplexität 22,23 und erfordert eine erhebliche Menge an Mitochondrien (~ 500 ug / Reaktion). In diesem Protokoll wird die Leuchtstoffmembran-Sensing-Potentialsonde TMRE in Verbindung mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät, das eine Standardmaschine in vielen Labors ist eingesetzt. TMRE ist weithin angesehen, da es schnell geht Zellen und Mitochondrien isoliert und kann bei niedrigen Konzentrationen 24 verwendet werden. Mehrere Umsetzungen können schnell hintereinander gesetzt werden und Batch analysiert mit diesem Protokoll. Weiterhin wird die Reaktions erfordern eine wesentlich geringe Menge an isolierten Mitochondrien (~ 10 & mgr; g / Reaktion). Um weniger Material erfordern können kleinere Gewebe- oder Zellkulturproben als Ausgangspunkt für Mitochondrien Isolierung verwendet werden, mehrere Wiederholungen oder Reaktionen können möglicherweise genügend Material für die anderen isolierten Mitochondrien Experimente wie die ATP-Produktion, der Sauerstoffverbrauch oder Importieren eingestellt werden, und Assays sind möglich.

Protokoll

Alle Tierversuchen entsprach National Institutes of Health Leitlinien und wurden von der Wake Forest University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Brutpaare für SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] Maus-Modell wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Nicht-transgenen Wildtyp (WT) Frauen und Männer SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] wurden gezüchtet, um SOD1G93A Mäusen und nicht transgenen WT Geschwistern, die in den Experimenten verwendet wurden zu generieren.

1. Modelle zur Untersuchung

  1. Zellkultur
    1. Pflege der menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-T293) Zellen in DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% L-Glutamin ergänzt, bei 37 ° C in 5% CO 2.
    2. Wachsen Zellen in T75-Flaschen und lassen Sie sie 90% Konfluenz erreichen.
    3. Durchführung Zellteilung über Trypsinisierung (0,25% Trypsin-EDTA) für 3-5 Minuten bei 37 ° C in 5% CO 2 Inaktivierung von Trypsin mit gleichen Volumen von Zellmedium und Zentrifugation der Zellen 5 min bei 700 × g bei 4 ° C.
    4. Saugen Sie die Medien und Zellpellet in Kulturmedien.
    5. Samenzellen in der entsprechenden Kolben oder der Platte 7 × 10 4 Zellen in einer T75-Flasche 48 Stunden vor der Behandlung Zytokin. Dies sollte bei der Behandlung zu geben ~ 70% Dichte.
    6. Serum verhungern Zellen 24 h später durch Ansaugen der Medien und mit dem gleichen Volumen von Serum-freien Medien (DMEM, steril) ersetzen.
    7. Bereiten TNF-α, IL1-β und IFN-γ aus lyophilisierten Pulvers mit ultrareinem Wasser bei Arbeitskonzentrationen von 5 pg / ul, 10 ng / & mgr; l, und 10 ng / ul, jeweils und sie in die Vertiefungen / Kolben.
    8. Treat Serum ausgehungert Zellen durch die Zugabe von solubilisiertem Cytokine direkt an den Zellkulturmedien der entsprechenden Kolben. Die Behandlungen bestanden aus einzelnen Cytokine, einen Cocktail aus allen 3 (bezeichnet als "* 3") oder sterile Wasser als Kontrolle (als "0" bezeichnet).
    9. Vor Beurteilung und Ernte inkubieren behandelten Zellen für 24, 48 oder 72 Std.
  2. Die Lebensfähigkeit der Zellen Bewertung
    1. Eine 5 mg / ml Lösung von 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) in 1x PBS.
    2. Für 12-Well-Platten, fügen Sie 100 ul der MTT-Lösung in jede Vertiefung und leicht schwenken, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
    3. Platten für 15 min-1 h bei 37 ° C in 5% CO 2, und prüfen unter einem Mikroskop auf die Anwesenheit von Purpurfärbung. Wenn keine vorhanden ist lila, wirbeln wieder und erlauben Zellen in 5-Minuten-Intervallen inkubieren, bis lila beobachtet. Die Menge an Zeit, die notwendig ist, indem jeder Untersuchenden bestimmt werden.
    4. Mit einem Wiederholungspipette 700 ul der MTT Lösungsmittel (4 mM HCl und 0,1% NP40 in Isopropanol) in jede Vertiefung und Rock die Platte (n) bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten, oder bis alle lila Farbe hatten die Zellen links . Wenn lilaFarbe nicht aus den Zellen kommen, fügen Sie zusätzliche 200 ul des Lösungsmittels und weiter zu wirbeln.
    5. Für die Analyse nehmen 100 ul aus jeder Vertiefung und in einen 96-Lochplatte und auf einem Plattenlesegerät mit 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm, 595 nm jedoch auch so lange akzeptabel, da Messwerte werden auf konsistente Einstellungen übernommen.
  3. Tiermodell der ALS
    1. Alle Tierversuchen entsprach National Institutes of Health Leitlinien und wurden von der Wake Forest University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Brutpaare für SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] Maus-Modell wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Nicht-transgenen Wildtyp (WT) Frauen und Männer SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] wurden gezüchtet, um SOD1G93A Mäusen und nicht transgenen WT Geschwistern, die in den Experimenten verwendet wurden zu generieren.
    2. Führen Sie die Genotypisierung mit Standard Primer gegen mutierte SOD1 25.

2. Isolierung von Mitochondrien

HINWEIS: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles auf Eis zu halten während des gesamten Verfahrens.

  1. Vorbereitung der mitochondrialen Isolierungspuffer (MIB), Rückenmark Isolierungspuffer (SC MIB) und experimentellen Puffer (EB)
    1. Die folgenden Stammlösungen vorbereitet vor der Zeit für MIB und EB.
    2. Auffüllen auf 1 M Tris / MOPS durch Lösen 12,1 g Tris-Base in 70 ml H 2 O. In trockenen MOPS pH 7,4 erhalten. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 ml endgültig. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
    3. Auffüllen auf 1 M Kphos durch Mischen von 80,2 ml der K 2 HPO 4 und 19,8 ml KH 2 PO 4. Lagerung bei Raumtemperatur.
    4. Make 0,2 M EGTA / Tris durch Zugabe von 3,8 g von EGTA zu 10 ml H 2 O. 1 M Tris / MOPS bis gelöst, ~ 30-40 ml. Passen Sie bis 50 ml, Sterilfilter und bei Raumtemperatur lagern. Man beachte, dass der pH-Wert wird ~ 6,7.
    5. Stellen Sie 1 M Glutamat, indem 10 ml1 M Lösung von Glutaminsäure. Filter zu sterilisieren und zu speichern 4 ° C.
    6. Auffüllen auf 1 M Malate, indem 10 ml einer 1 M Lösung von Äpfelsäure. Hinzufügen Tris / MOPS 50 mM. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
    7. Make MIB in einer Konzentration von 200 mM Saccharose, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, und 1 mM EGTA / Tris. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
    8. Make SC MIB in einer Konzentration von 250 mM Saccharose, 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT und Proteaseinhibitor-Cocktail.
    9. Make EB in einer Konzentration von 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM Glutamat, 2,5 mM Malat, 1 mM K-Phosphat, pH 7,4, und 10 mM EGTA / Tris. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
  2. Ausrüstung Vorbereitung vor der Ernten der Zellen.
    1. Spülen Sie ein kleines Glasgefäß und Homogenisierung Stößel dreimal mit sterilem Wasser und setzen auf Eis.
    2. Gather notwendigen Gegenstände wie ein Standard-Bohrmaschine, Zell scraPersonen, 1,5 ml, 15 ml und 50 ml-Röhrchen und Lösungen.
  3. Mitochondrien Isolation
    1. Kultivierten Zellen
      1. Für jeden Probentyp, verwenden Sie zwei T175-Flaschen von Zellen.
      2. Sicherzustellen, dass die Zelle in ~ 90% konfluent und Verwendung in Kontrollversuchen oder Platte und zu behandeln, wie oben in Schritt 1.2 beschrieben.
      3. Auf der Tischplatte, absaugen Medien und waschen Sie die anhaftenden Zellen zweimal mit 15 ml 1x PBS jeder Zeit.
      4. Saugt den Puffer und schaben Kolben die anhaftenden Zellen vom Boden des Kolbens zu entfernen.
      5. 15 ml 1x PBS in jeden Kolben, Wirbel, und übertragen auf einzelne 15 ml konische Röhrchen und auf Eis.
      6. Sobald Kratzen wird, Zentrifuge die Röhrchen für 5 Minuten bei 700 × g, 4 ° C durchgeführt unter Verwendung einer Tischzentrifuge mit einem Schwingbecher-Rotor.
      7. Aspirat Ständen und Resuspendieren jedes Pellet in 1 ml MIB.
      8. Kombinieren Sie beide Suspensionen und Transfer zu einem kleinen Glasgefäß zur Homogenisierung.
      9. Fügen MIBzu dem Behälter, bis Puffer erreicht die erste Zeile. Homogenisieren Zellen mit den Stößel auf einen Bohrer bei mittlerer Geschwindigkeit für drei Durchgänge verbunden ist. Sicherzustellen, dass der Behälter auf Eis während diesem Schritt nicht die Stößel über der Flüssigkeit zu entfernen und um eine konstante Geschwindigkeit mit kontinuierlichen Durchläufen zu verwenden.
      10. Übertragen der homogenisierten Lösung zu einem 50 ml konischen Röhrchen.
      11. Zeichnen Sie die Lösung in eine 3-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-1 ½-Zoll-Nadel und vertreiben sie zurück in die konische Röhrchen auf Eis mit einer 27 G ½-Zoll-Nadel. Kümmern, um die Lösung an der Innenwand des Rohrs auszustoßen, um diese Kraft für Zellmembran Unterbrechungen zu nutzen.
      12. Wiederholen der Spritzenschritte für insgesamt fünfmal.
      13. Wird die Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 600 × g, 4 ° C in einer Tischzentrifuge mit einem Schwingbecher-Rotor.
      14. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und verteilt auf drei 1,5-ml-Röhrchen.
        HINWEIS: Mitochondria sind in dem Überstand nach dieser ersten Niedergeschwindigkeits Spin, während Zellmembranen und aufgebrochene Zellen pelletiert werden.
      15. Zentrifugenröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min.
      16. Saugen Sie die Überstände und kombinieren Sie die Pellets in 100 ul MIB und sofort auf Eis legen.
        HINWEIS: Mitochondrien sind im Pellet nach dieser Hochgeschwindigkeits-Spin. Mitochondrien werden in der Regel behalten ihre Membranpotential für ~ 2-3 Ionen Eis nach der Isolierung und stabilsten als konzentrierte Stammlösung in MIB.
    2. Mitochondrien isoliert von Mausgewebe
      1. Betäuben die Maus nach IACUC Protokoll. Legen Sie einen Verdampfer bei 5,0% auf die Anästhesie zu induzieren. Bestätigt, dass das Tier durch einen Mangel an Reflex Fuß Prise oder Blinkreflex betäubt, wenn das Auge nähert oder mit einem Wattestäbchen erschlossen. Halten Sie die Maus unter Narkose für den gesamten chirurgischen Eingriff, indem der Verdampfer zwischen 1,5% und 2,0%.
      2. Excise die Leber und des Rückenmarks von jedem Tier und Ort separat in eiskaltem 1x PBS - / -, um wegspülen kein Blut.
      3. Für die Leber, übertragen das Gewebe zu einer Wiegeschale auf Eis und hacken in feine Stücke mit einer frischen Rasierklinge für 1 min.
      4. Fügen Sie Gewebe und geeigneten Puffer (MIB für Leber oder SC MIB für das Rückenmark) von der Behälterpuffer bis die erste Zeile erreicht. Homogenisieren Gewebe mit dem Stößel mit der Hand für fünf Durchgängen. Sicherzustellen, dass der Behälter auf Eis während diesem Schritt nicht die Stößel über der Flüssigkeit zu entfernen und um eine konstante Geschwindigkeit mit kontinuierlichen Durchläufen zu verwenden.
      5. Übertragen Sie die Homogenate zu reinigen 15 ml Tuben.
      6. Zentrifugenröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 750 × g, 4 ° C für 10 min.
      7. Speichern Sie die Überstände in saubere Rohre und legen Sie sie auf Eis.
        HINWEIS: Die Mitochondrien befinden sich im Überstand nach dieser ersten Niedergeschwindigkeits Spin, während Zellmembranen und aufgebrochene Zellen pelletiert werden.
      8. Re-suspendieren die Rückenmarks Pellets in 500 ul SC MIB.
      9. Re-homogenisieren je dreimal, nur Befüllen des Behälters zur Hälfte mit SC MIB diesmal.
      10. Übertragen Sie die neue Homogenat in ein frisches Röhrchen.
      11. Zentrifuge die in einem Festwinkelrotor bei 750 × g, 4 ° C für 10 min.
      12. Kombinieren dieser neuen Überstände, die mehr Mitochondrien enthalten, wobei der erste Überstand von jeder Probe.
      13. Zentrifugenröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min.
      14. Saugen Sie die Überstände und Resuspendieren der Leber Pellets in 500 ul MIB und der Rückenmarks Pellets in 50 ul SC MIB und sofort auf Eis legen.
        HINWEIS: Mitochondrien sind im Pellet nach dieser Hochgeschwindigkeits-Spin. Mitochondrien werden in der Regel behalten ihre Membranpotential für ~ 2-3 Ionen Eis nach der Isolierung und stabilsten als konzentrierte Stammlösung in MIB.
      15. Durchführen einer Proteinkonzentration Assay, um die Konzentration von Mitochondrien in Lösung zu schätzen. Befolgen Sie die Anweisungens für die Verwendung eines kommerziellen Protein Assay Kit oder ähnliche Verfahren 26. Typische Konzentrationen von Mitochondrien sind: 2 T175-Flaschen Ausbeuten ~ 2 mg / ml, 1 Mausleber ~ 3-5 mg / ml und 1 Rückenmark der Maus ~ 1-3 mg / ml.
  4. Cytochrom-c-Assay mit einem F & E-Ratte / Maus Cytochrom c Quantikine ELISA Kit (aus dem Protokoll des Herstellers angepasst).
    1. Unmittelbar vor der Einrichtung der Reaktionen, verdünnte Mitochondrien zu 0,5 mg / ml Arbeitskonzentration mit EB und zu verteilen verdünnt Mitochondrien in 1,5-ml-Röhrchen für die Reaktionen (in der Regel 30 bis 50 & mgr; l der Mitochondrien pro Röhrchen).
    2. Fügen Sie entweder EB oder DMSO, bei 1% des Gesamtvolumens, dem verwässerten Mitochondrien und bebrüten die Reaktionen auf der Tischplatte für 7-10 min. Diese Reaktionen sind bei Raumtemperatur für bis zu 30 Minuten stabil ist, wenn ein längerer Zeitraum erforderlich ist.
    3. Pellet Mitochondrien durch Zentrifugation in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min und sorgfältigely trennen Sie den Überstand und legen Sie jeweils in einem separaten 1,5 ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Die Schläuche können entweder bei -20 ° C für die spätere Analyse eingefroren oder sofort verwendet werden.
    4. Bestimmen Freisetzung von Cytochrom c durch ein Vergleichen der Konzentration an Cytochrom c im Pellet und der Überstand 27.
      1. Vorbereitung der Proben, die durch Solubilisierung der Pellets in dem ursprünglichen Volumen der Reaktion mit 0,5% TX-100 in 1 × PBS.
      2. Für jede Probe wurden 2 Vertiefungen Vorbereitung auf die ELISA-Platte, eines für die jetzt solubilisierten Pellets und einer für den Überstand aus der Reaktion durch Zugabe von 100 ul von Cytochrom c-Konjugat (verwenden gerade aus Flasche) plus 100 ul 0,5% Tx- 100 in 1x PBS, und dann alle der Pellets oder Überstandsprobe.
      3. Vortexen Sie vorsichtig die Platte eine niedrige Einstellung (Stufe 2-4) für 20 Sekunden zu mischen, abdecken und inkubieren für 1 h, 37 ° C.
      4. Anschließend waschen Sie die Platte viermal mit Waschpuffer nach dem HerAnweisungen Witwer. Entfernen Sie das überschüssige Lösung durch Antippen der Brunnen auf Papiertuch.
      5. Als Nächstes fügen Sie 150 ul von 1: 1 A + B Entwicklerlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 20 bis 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
      6. Schließlich, fügen Sie 50 ul Stopplösung in jede Vertiefung geben und nehmen Absorptionswerte bei 540 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Berechnen der Menge an Cytochrom c-Freisetzung durch den Vergleich der Menge an Cytochrom c in der Pellet vs. Stand für jede Reaktion.

3. Bewertung der Mitochondrien (Dys) Funktion

  1. Unmittelbar vor Reaktionen eingerichtet sind, zu verdünnen Mitochondrien zu 0,5 mg / ml Arbeitskonzentration mit EB und in 1,5 ml Röhrchen für Reaktionen gelegt (in der Regel 30 bis 50 & mgr; l der Mitochondrien pro Röhrchen verwendet wird).
  2. Mitochondriale Behandlungen
    1. In geeigneten Behandlungen (EB Kontrolle, 1 uM FCCP mit 50 nM Valinomycin gemischt, 10 uM Rotenon, 5 & mgr; M Oligomycin, 2 mM KCN oder 200 uM ADP, Endkonzentrationen) Reaktionen bei 1/10 trennen th des Gesamtvolumens des verdünnten Mitochondrien. Die Reaktionen auf der Bank oben inkubieren 7 min.
      HINWEIS: Vorsicht beim Umgang mit diesen Stoffen als versehentlicher Einnahme oder Absorption durch die Haut schädlich sein könnte entnommen werden.
    2. Verdünne TMRE, in sterilem Wasser in einer Arbeitskonzentration von 100 & mgr; M und bei -20 ° C gelagert, bis 2 & mgr; M und fügen ein Volumen gleich der mitochondrialen Reaktionsvolumen.
    3. Die Reaktionen auf der Bank oben inkubieren 7 min.
    4. Pellet Mitochondrien durch Zentrifugation in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min.
    5. Laden Sie die Hälfte der überstehenden Volumen jeder Probe auf eine 396-Well-Platte und lesen Fluoreszenz.
      HINWEIS: Anregungs- und Emissionswellenlängen des TMRE sollte nach den Anweisungen des Herstellers mit dem Volumen und Platte, die verwendet werden soll optimiert werdenAssays. Mit einem Standard-384-Well-schwarze Platte mit 25 ul von 1 uM TMRE (endgültige Reaktionskonzentration) das stärkste Signal erhalten wurde unter Verwendung von Anregungs- / Emissionswellenlängen   485 nm / 535 nm.
    6. Berechnen der Wand Differenz in der Fluoreszenz zwischen Kontrolle (EB) und jede Behandlung durch Dividieren der relativen Fluoreszenzwert (RFU) aus dem Plattenleser für die Versuchsprobe von der RFU von der Kontrollprobe erhalten.

Ergebnisse

Behandlung von HEK-293T-Zellen, die mit 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, und 75 ng / ml IFN-γ (* 3) für 24-48 h führt zu einer fort Mengen von Zelltod (1A ). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit MTT-Assays untersucht und durchgängig zeigt, daß es ~ 10% ige Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen bei 24 Stunden Behandlung und ~ 20% ige Abnahme bei 48 Stunden Behandlung. Zellen, die mit ähnlichen Konzentrationen (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, und 75 ng / ml IFN-γ) zu ergeben ...

Diskussion

Behandlung von HEK-293T-Zellen, die mit rekombinanten Cytokinen verursacht moderate Mengen von Zelltod über 48 h (Figur 1). Die Menge an Zelltod, der durch TNF-alpha-Behandlung induziert wird, ist ähnlich wie die zuvor beschriebenen Studien 30 und die Lebensfähigkeit der Zellen sinkt nach gleichzeitiger Verabreichung von mehreren Cytokinen, die größer als summativen Mengen mit jedem Cytokin allein ist auch im Einklang mit der Literatur 31,32. Die Möglichkeit, die Mengen und A...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
L-glutamic acidSigmaG1251Can use the potassium salt instead.
malic acidSigmaM8304Can use the potassium salt instead.
KH2PO4SigmaP0662
K2HPO4SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma baseSigmaT6066
MOPSSigmaM3183
CCCPSigmaC2920Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
ValinomycinSigmaV0627Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucroseFisherS5-500
KCNMallinckrodt6379Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenoneSigmaR8875Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycinSigmaO4876Highly toxic. Made in ethanol.
ADPSigmaA2754
TMRESigma8717-25mgDilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEMGibco11965-0841x regular (high glucose).
Pen/StrepInvitrogen15140-155
L-glutamineFisherSH3002101Store aliquots at -20 °C
FBSLonza14-501FUS origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Protien Assay Dye (5x)Bio-Rad500-0006Any protein assay can substitute.
BSAFisherBP1600-100Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powderSigmaM2128Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)SigmaNP40S
Recombinant Human IL-1BGibcoPCH08014Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alphaGibcoPHC3015L
Recombinant Human IFN-gammaGibcoPHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kitR&D systemsDTC0Human for HEK-293T cells. 

Referenzen

  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
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