JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

תאי חיים אנרגית בנק חילוף חומרים בצורה של שומנים ופחמימות ולהשתמש באנרגיה זו לביוסינתזה, תחבורת קרום ותנועה. אנרגיה מסוימת מתקבלת בcytosol באמצעות ההמרה של סוכרים תזונתיים ישירות לתוך ATP בגליקוליזה. עם זאת, המקור העיקרי לייצור ATP בתא הוא רתם בתוך המיטוכונדריה באמצעות שרשרת הנשימה במיטוכונדריה 1. הארכיטקטורה של המיטוכונדריה מספקת התמצאות במרחב הדרושה לייצור ATP אפקטיבי ויעיל. המיטוכונדריה יש קרום כפול מופרד על ידי שטח intermembrane ויחד עם המטריצה, תא המיטוכונדריה הפנימי ביותר, בית הרכיבים ולתאם את התגובות כימיות מעורבות בדור ATP. הקרום הפנימי מכיל סדרה של קומפלקסי חלבוני קרום נכנסים המרכיבים את שרשרת הנשימה, כמו גם את synthase ATP, החלבון מורכב שמביא ADP וPi יחד ליצירת ATP. הפונדקקרום אה מקופל לתוך cristae ואלקטרונים מועברים לאורך מתחמי שרשרת הנשימה דרך ציטוכרום C, מוביל אלקטרון מסיס הנע בין מתחמים במרחב intermembrane. כאלקטרונים לנוע, חמצון שווה הפחתה מתרחש ויוני המימן נשאבים מהמטריצה ​​למרחב intermembrane. כתוצאה מריכוז היון הגבוה בתוך החלל intermembrane, שיפוע אלקטרוכימיים בונה וכתוצאה מכך פוטנציאל קרום על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה (Δψ) 2. החמצן הוא מקבל אלקטרונים הסופיים של שרשרת הובלת אלקטרונים, ויונים מימן לזרום דרך synthases ATP ממרחב intermembrane חזרה למטריצה, ובכך לגרום להיווצרות ATP ישירות. תהליך זה כפי שתואר בשלמותו ידוע כזרחון חמצוני. קפלי cristae להגדיל את שטח הפנים של הקרום הפנימי, המאפשרים לתחבורה מקסימלי אלקטרון וייצור ATP בכל mitochondrion. החלבונים, האנזימים ומולקולות אחרות שהיו מעורבות בזרחון חמצוני נגזרים משני הגנים גרעיניים והמיטוכונדריה. המיטוכונדריה מכילה DNA המעגלי, הקידוד שלהם במשך 13 חלבונים כמו גם tRNAs וmRNAs ההכרחי לייצור ATP 3. עם זאת, רבים יותר חלבונים נדרשים ולכן הם מקודדים גרעיניים. רוב החלבונים המקודדים גרעיניים אלה ממוקדים למטריצת המיטוכונדריה על ידי השימוש בpresequences בN-הסופי של החלבון המבשר, והיבוא שלהם הוא מונע בחלקו על ידי Δψ 4,5.

מעבר לתרומה ליו-האנרגיה של תא, מיטוכונדריה גם להשפיע על תהליכי חילוף חומרים גדולים כמו TCA ובטא-חמצון, איתות תאית באמצעות סידן ויסות, כמו גם תפקיד מרכזי באפופטוזיס 6. באופן ספציפי, בזמנים של לחץ סלולארי, חלבוני Bcl-2 משפחה שמתגוררים באו אינטראקציה בקרום החיצוני של המיטוכונדריה יכול לגרום המיטוכונדריה7,8 חדירות קרום חיצוניות (MOMP). במהלך MOMP, ג ציטוכרום וחלבונים אחרים משתחררים לcytosol, ויחד עם כמה חלבוני cytosolic צורה מורכבת הנקרא apoptosome 9,10. Apoptosome מפעיל caspases שילך על לדבוק חלבונים ו- DNA של תאים בשלב הביצוע של אפופטוזיס. ברגע שMOMP מתרחש, ΔΨ הוא התמוטט וייצור ATP נעצר. פונקציה של המיטוכונדריה כך, כאפופטוזיס הוא יזם נפגעת ושינויים בΔΨ יכולים להיות מתואמים להמיטוכונדריה ותא בריאות 12. בעוד אפופטוזיס הוא נקודת סיום במודלים של מחלות רבות, מיטוכונדריה והשינויים ΔΨ גם יכול להניב מידע רב ערך על מקור מחלה ו / או התקדמות. לדוגמא, שינויים מבניים ותפקודיים של המיטוכונדריה תועדו במהלך מחלות ניווניות 13,14.

בחלקו הראשון של הפרוטוקול, isolation של המיטוכונדריה שלמה ששומרת ΔΨ מתואר. תאי HEK-293T נחשפו לריכוזים ושילובים של TNF-α רקומביננטי, IL1-β וIFN-γ שונים כדי לגרום לאפופטוזיס. ציטוקינים אלה נבחרו כי הם דיווחו להיות גבוהים בדגימות אנושיות עיקריות ספיגה 15 ומסלול החיצוני של אפופטוזיס יכול להיות מופעל על ידי אינטראקציה של TNF-α מחייב לקולטן שלו 6 בתדירות גבוהה. מאחר שיש וריאציות עדינות צורך לבודד המיטוכונדריה תפקודית מרקמות עיקריות בהשוואה לתאים בתרבית, וכי מחקרים רבים מנצל בעלי חיים, הפרוטוקול גם מתאר כיצד לבודד המיטוכונדריה מכבד וחוט שדרה של קדמי טרשת לרוחב מודל עכבר (ALS).

החלק השני של הפרוטוקול פותח כדי לפקח הפרעות לפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה באמצעות צבע ניאון פוטנציאל רגיש עם קורא צלחת ניאון. הבדלים בין מעמד הסלולרי (כלומר, בריא לעומת בריא) נבדל בquantitating הכוח של ΔΨ של מיטוכונדריה המבודדת בשיתוף עם סוכני תרה, מעכבי שרשרת נשימה, מעכבים ויונופורים מורכבים, אשר כולם לגרום לפיזור של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. המיטוכונדריה בריאה, גדול יותר את השינוי בΔΨ על טיפול במעכבי המיטוכונדריה, ולכן התגובה של המיטוכונדריה יכולה לשמש כמדד לתפקוד המיטוכונדריה (פרע).

שימוש במיטוכונדריה המבודדת ולא בהערכה באתרו של פונקציה מציעה ראיות מוחלטות שפתולוגיה או טיפול ישירות מודולציה שינויים אברון 16-18. אמנם יש שיטות בספרות לבודד את המיטוכונדריה מהתאים בתרבית, הם מעורפלים 17 ו / או להשתמש בציוד מיוחד 16. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את שיטת הבידוד ובקלות להתאמה לשורות תאים אחרות, כוללים ברקמה ותרבויות 13,14,19,20 עיקריות. מחקרי מיטוכונדריה מבודדים רבים לנצל את אותו uncouplers המיטוכונדריה ומעכבי שימוש בפרוטוקול זה, אבל עם אלקטרודה קלארק (21 היא דוגמא מייצגת של מאמרים רבים בספרות), ששוב היא פיסת הציוד מאוד ספציפית ומיוחדת. יתר על כן, לשיטה מסורתית זו יש מגבלות כגון תפוקה נמוכה וגבוהות מורכבות 22,23 ודורשת כמות משמעותית של המיטוכונדריה (~ 500 מיקרוגרם / תגובה). בפרוטוקול זה, TMRE הבדיקה ניאון חישת הקרום הפוטנציאלי להשתמש בשילוב עם קורא צלחת ניאון, שהוא מכונה סטנדרטי במעבדות רבות. TMRE נחשב מאז שהוא נכנס במהירות תאים ומיטוכונדריה מבודדת וניתן להשתמש בם בריכוזים נמוכים 24. יכולות להיות מוגדרות במהירות תגובות מרובות במקביל ויצוו נותחו באמצעות פרוטוקול זה. יתר על כן, התגובהs דורשת הרבה כמות קטנה של מיטוכונדריה המבודדת (~ 10 מיקרוגרם / תגובה). על ידי הדורשים פחות חומר, יכולות להיות מנוצלת דגימות רקמה או תרבית תאים קטנות יותר כנקודה מוצא לבידוד המיטוכונדריה, ניתן להגדיר יותר חזרות או תגובות למעלה, ובאופן פוטנציאלי מספיק חומר לניסויי מיטוכונדריה מבודדים אחרים, כגון ייצור ATP, צריכת חמצן, או יבוא מבחני אפשריים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים תאמו המכונים הלאומי לבריאות הנחיות ואושרו על ידי שרות יער אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. זוגות רבייה לSOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] מודל עכבר התקבלו מהמעבדה ג'קסון (Bar Harbor, ME). Nontransgenic wild-type נקבות (WT) וזכרי SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] גדל ליצור עכברי SOD1G93A והמלטת WT nontransgenic ששמשו בניסויים.

1. מודלים לחקירה

  1. תרבית תאים
    1. שמור על תאי כליה עובריים אנושיים (HEK-T293) תאי DMEM בתוספת סרום 10% חום מומת שור עוברי, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, ו -1% L- גלוטמין, על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
    2. לגדל תאים בצלוחיות T75 ולאפשר להם להגיע למפגש 90%.
    3. לבצע פיצול תא באמצעות trypsinization (0.25% טריפסין- EDTA) במשך 3-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 , איון של טריפסין עם נפח שווה של תקשורת סלולארי, וצנטריפוגה של תאים למשך 5 דקות ב 700 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. לשאוב את התקשורת וresuspend התא גלולה בתקשורת ובתרבות.
    5. תאי זרע בבקבוק או הצלחת המתאים 7 x 10 4 תאים לתוך T75 בקבוקון 48 שעות לפני ציטוקינים טיפול. זה אמור לתת לי ~ 70% צפיפות בזמן טיפול.
    6. תאים להרעיב סרום 24 שעות מאוחר יותר על ידי aspirating התקשורת והחלפתו באותו הנפח של סרום ללא מדיה (DMEM, סטרילי).
    7. הכן TNF-α, β-IL1, וIFN-γ, מאבקת lyophilized עם מים טהורים בריכוזים עבודה של 5 pg / μl, 10 ng / μl, ו -10 ng / μl, בהתאמה ולהוסיף אותם לבארות / צלוחיות.
    8. סרום לטיפול מורעב תאים על ידי התוספת של ציטוקינים solubilized ישירות לתקשורת תרבית תאים של צלוחיות מתאימות. טיפולים כללו ציטוקינים פרט, קוקטייל של כל 3 (המכונה "* 3"), או sterמים ile כביקורת (המכונים "0").
    9. דגירה תאים שטופלו במשך 24, 48 או 72 שעות לפני ההערכה וקציר.
  2. הערכת כדאיות תא
    1. הפוך פתרון 5 מ"ג / מיליליטר של 3 (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium (MTT) ב1x PBS.
    2. לצלחות 12-היטב, להוסיף לפתרון MTT 100 μl היטב כל אחד ועדינות מערבולת כדי להבטיח חלוקה שווה.
    3. דגירה צלחות במשך שעה 15 דקות-1 ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, ולבדוק תחת מיקרוסקופ לנוכחות של צבע סגול. אם לא סגול הוא הווה, לערבל שוב ולאפשר לתאי דגירה ב 5 דקות במרווחים עד סגול הוא ציין. כמות הזמן הנדרש צריכה להיקבע על ידי כל אחד מחוקרים.
    4. שימוש pipettor חוזר, להוסיף 700 μl של ממס MTT (NP40 4 מ"מ HCl ושל 0.1% בisopropanol) זה טוב ולטלטל את הצלחת (ים) בטמפרטורת חדר למשך 5-10 דקות, או עד שכל הצבע הסגול עזב את התאים . אם סגולהצבע לא יצא מתאים, להוסיף 200 μl נוסף של ממס וממשיך לערבל.
    5. לניתוח, לקחת מכל אחד 100 μl היטב ומניח לצלחת 96-היטב ולקרוא על קורא צלחת באמצעות 570 ננומטר ואורך גל של 630 ננומטר התייחסות, אולם 595 ננומטר הוא גם מקובל כל עוד קריאות נלקחות בהגדרות עקביות.
  3. מודל חיה של ALS
    1. כל הניסויים בבעלי החיים תאמו המכונים הלאומי לבריאות הנחיות ואושרו על ידי שרות יער אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. זוגות רבייה לSOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] מודל עכבר התקבלו מהמעבדה ג'קסון (Bar Harbor, ME). Nontransgenic wild-type נקבות (WT) וזכרי SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] גדל ליצור עכברי SOD1G93A והמלטת WT nontransgenic ששמשו בניסויים.
    2. בצע genotyping עם פריימרים סטנדרטיים נגד SOD1 מוטנטי 25.

2. בידוד של המיטוכונדריה

הערה: חשוב לעבוד במהירות ולשמור את הכל על קרח לאורך כל ההליך.

  1. הכנה של חיץ המיטוכונדריה בידוד (MIB), חיץ בידוד חוט השדרה (MIB SC) וחיץ ניסיוני (EB)
    1. הכן פתרונות המניות הבאים מבעוד מועד לMIB וEB.
    2. הפוך 1 M טריס / מגבים על ידי המסת 12.1 גרם של בסיס טריס בשנת 70 מיליליטר של H 2 O. להוסיף מגבים יבשים כדי לקבל pH 7.4. להתאים את עוצמת קול עד 100 מיליליטר סופי. סנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. הפוך 1 M Kphos על ידי ערבוב 80.2 מיליליטר של K 2 HPO 4 ו19.8 מיליליטר של KH 2 PO 4. אחסן בטמפרטורת חדר.
    4. הפוך 0.2 M EGTA / טריס על ידי הוספת 3.8 גרם של EGTA עד 10 מיליליטר של H 2 O. הוסף 1 M טריס / מגבים עד שהיא נמסה, ~ 30-40 מיליליטר. התאם 50 מיליליטר, סינון סטרילי ולאחסן בטמפרטורת חדר. שים לב שpH יהיה ~ 6.7.
    5. הפוך 1 M גלוטמט על ידי ביצוע 10 מיליליטר של1 M פתרון של חומצה גלוטמית. סנן לעקר ולאחסן 4 ° C.
    6. הפוך 1 M Malate על ידי ביצוע 10 מיליליטר של 1 M פתרון של חומצת מאלית. להוסיף טריס / מגבים 50 מ"מ. סנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    7. הפוך MIB בריכוז של 200 מ"מ סוכרוז, 10 מ"מ טריס / מגבים, pH 7.4, ו 1 מ"מ EGTA / טריס. סנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    8. הפוך MIB SC בריכוז של 250 מ"מ סוכרוז, 20 מ"מ HEPES KOH-pH 7.5, 10 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 מ"מ DTT, ומעכבי פרוטאז קוקטייל.
    9. הפוך EB בריכוז של 125 מ"מ KCl, 10 מ"מ טריס / מגבים, pH 7.4, 5 גלוטמט מ"מ, 2.5 מ"מ malate, 1 פוספט מ"מ K, pH 7.4, ו -10 מ"מ EGTA / טריס. סנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת ציוד לפני קצירת התאים.
    1. יש לשטוף את העלי כלי זכוכית ולתפעול קטן שלוש פעמים עם מים סטריליים ומניח על קרח.
    2. לאסוף פריטים דרושים כגון מקדח סטנדרטי, scra תאpers, 1.5 מיליליטר, 15 מיליליטר ו -50 מיליליטר צינורות ופתרונות.
  3. בידוד המיטוכונדריה
    1. תאים בתרבית
      1. לכל סוג מדגם, להשתמש בשתי צלוחיות T175 של תאים.
      2. ודא כי תאים ~ 90% ומחוברות ולהשתמש בניסויי שליטה, או צלחת ולטפל כפי שתואר לעיל בשלב 1.2.
      3. על גבי הספסל, תקשורת לשאוב ולשטוף את התאים חסיד פעמיים עם 15 מיליליטר של 1x PBS בכל פעם.
      4. לשאוב את החיץ ולגרד צלוחיות כדי להסיר תאים חסיד מתחתית הבקבוק.
      5. הוסף 15 מיליליטר של 1x PBS לכל בקבוק, מערבולת, ולהעביר עד 15 מיליליטר בודד צינורות ומקום חרוטי על קרח.
      6. ברגע שהגירוד נעשה, צנטריפוגה הצינורות במשך 5 דקות ב 700 XG, 4 ° C באמצעות צנטריפוגות בראש טבלה באמצעות הרוטור דלי מתנדנד.
      7. supernatants לשאוב ו resuspend כל גלולה ב 1 מיליליטר של MIB.
      8. לשלב את שני ההשעיות ולהעביר לכלי זכוכית קטנים לתפעול.
      9. להוסיף MIBלכלי השיט עד חיץ מגיע לקו הראשון. Homogenize תאים עם העלי המצורף לתרגיל במהירות בינונית במשך שלושה מעברים. ודא שהכלי הוא על קרח במהלך שלב זה, שלא להסיר את העלי מעל הנוזל ולהשתמש במהירות קבועה עם מסירות רצופות.
      10. מעביר את הפתרון הומוגני לצינור חרוטי 50 מיליליטר.
      11. צייר את הפתרון לתוך מזרק 3 מיליליטר באמצעות ½ 1 מחט אינץ '18 מד ולגרש אותו בחזרה לתוך צינור חרוטי על קרח עם 27 מד ½ מחט אינץ'. דואג לגרש את הפתרון על הקיר הפנימי של הצינור כלנצל כוח זה לשיבוש קרום תא.
      12. חזור על שלבי מזרק עבור הסכום כולל של חמש פעמים.
      13. מעביר את הפתרון לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 600 XG, 4 ° C בצנטריפוגה בראש טבלה באמצעות הרוטור דלי מתנדנד.
      14. מוציא בזהירות את supernatant ולהפיץ בין שלושה צינורות 1.5 מיליליטר.
        הערה: Mitochondria נמצא בsupernatant לאחר ספין במהירות נמוכה זה ראשון, ואילו קרומי תאים ותאים רצופים הם pelleted.
      15. צנטריפוגה צינורות בזווית הרוטור קבוע ב10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      16. supernatants לשאוב ולשלב את כדורים ב 100 μl MIB ומייד מניח על קרח.
        הערה: המיטוכונדריה הוא בגלולה אחרי ספין במהירות גבוהה זה. המיטוכונדריה בדרך כלל לשמור על פוטנציאל הממברנה שלהם ל~ יון 2-3 קרח לאחר בידוד והיציב ביותר כפתרון מניות מרוכז בMIB.
    2. בידוד המיטוכונדריה מרקמות עכבר
      1. להרדים את העכבר על פי פרוטוקול IACUC. הגדר מאדה על 5.0% לגרום להרדמה. אישר כי בעל החיים הוא מורדם על ידי חוסר רפלקס לקמצוץ רגל או רפלקס מצמוץ כאשר העין הוא התקרב או הקיש עם מקלון צמר גפן. שמור את העכבר בהרדמה לניתוח כולו על ידי שמירה על מאדה בין 1.5% ל 2.0%.
      2. EXCISE הכבד וחוט השדרה מכל חיה ומקום בנפרד בקרח קר 1x PBS - / - כדי לשטוף ממנו כל דם.
      3. עבור הכבד, להעביר את הרקמה לצלחת לשקול על קרח וקוצץ לחתיכות דקות באמצעות סכין גילוח טרי 1 דקות.
      4. להוסיף רקמה ומאגר מתאים (MIB עבור כבד או SC MIB לחוט השדרה) לכלי השיט עד חיץ מגיע לקו הראשון. Homogenize רקמות עם העלי ביד במשך חמש עובר. ודא שהכלי הוא על קרח במהלך שלב זה, שלא להסיר את העלי מעל הנוזל ולהשתמש במהירות קבועה עם מסירות רצופות.
      5. העבר את homogenates לנקות 15 מיליליטר צינורות.
      6. צנטריפוגה צינורות בזווית הרוטור קבוע ב 750 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      7. שמור את supernatants לתוך צינורות נקיים ומניח אותם על קרח.
        הערה: המיטוכונדריה הוא בsupernatant לאחר ספין במהירות נמוכה זה ראשון, ואילו קרומי תאים ותאים רצופים הם pelleted.
      8. להשעות מחדש את כדורי חוט השדרה in 500 μl של MIB SC.
      9. Re-homogenize כל שלוש פעמים, רק ממלא את מחצית דרך הספינה עם SC MIB הפעם.
      10. מעביר את homogenate החדש לצינור טרי.
      11. צנטריפוגה בהרוטור זווית קבועה ב 750 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      12. לשלב supernatants החדש אלה, המכילים יותר המיטוכונדריה, עם supernatant הראשון מכל מדגם.
      13. צנטריפוגה צינורות בזווית הרוטור קבוע ב10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      14. supernatants לשאוב וresuspend את כדורים הכבד ב 500 μl של MIB וכדורי חוט השדרה בMIB SC 50 μl ומייד מניח על קרח.
        הערה: המיטוכונדריה הוא בגלולה אחרי ספין במהירות גבוהה זה. המיטוכונדריה בדרך כלל לשמור על פוטנציאל הממברנה שלהם ל~ יון 2-3 קרח לאחר בידוד והיציב ביותר כפתרון מניות מרוכז בMIB.
      15. בצע assay ריכוז חלבון להעריך את הריכוז של המיטוכונדריה בפתרון. בצע את ההוראותים לשימוש בערכת Assay החלבון מסחרי או שיטה דומה 26. ריכוזים אופייניים של המיטוכונדריה הם: תשואות צלוחיות 2 T175 ~ 2 מ"ג / מיליליטר, כבד עכבר 1 ~ 3-5 מ"ג / מיליליטר, וחוט השדרה עכבר 1 ~ 1-3 מ"ג / מיליליטר.
  4. assay ג ציטוכרום באמצעות R & D של העכברוש / העכבר ציטוכרום C Quantikine ELISA Kit (מותאם מהפרוטוקול המסופק על ידי היצרן).
    1. מייד לפני הקמת התגובות, לדלל המיטוכונדריה 0.5 מ"ג / מיליליטר ריכוז עובד עם EB ולהפיץ המיטוכונדריה מדוללת בצינורות 1.5 מיליליטר לתגובות (בדרך כלל 30-50 μl של מיטוכונדריה לכל צינור).
    2. להוסיף או EB או DMSO, על 1% מהנפח הכולל, למיטוכונדריה מדוללת ודגירת התגובות על גבי הספסל במשך 7-10 דקות. תגובות אלה הן יציבים לתקופה של עד 30 דקות בטמפרטורת חדר, אם יש צורך בפרק זמן ארוך יותר.
    3. המיטוכונדריה גלולה על ידי צנטריפוגה בהרוטור זווית קבועה ב10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וזהירותly להפריד את supernatant ומניח כל אחד ב1.5 מיליליטר צינורות נפרדים.
      הערה: ניתן גם להקפיא צינורות ב -20 ° C לניתוח מאוחר יותר או להשתמש בו מייד.
    4. לקבוע שחרורו של ציטוכרום C על ידי השוואת הריכוז של ציטוכרום C בגלולה וsupernatant 27.
      1. הכן את הדגימות על ידי solubilizing כדורים בנפח המקורי של התגובה עם 0.5% TX-100 ב1x PBS.
      2. עבור כל דגימה, להכין 2 בארות על צלחת ELISA, אחד לגלולה עכשיו solubilized ואחד לsupernatant מהתגובה על ידי תוספת של של המצומד ציטוכרום C 100 μl (להשתמש ישר מבקבוק) בתוספת של 0.5% Tx- 100 μl 100 ב 1x PBS, ולאחר מכן כל המדגם גלולה או supernatant.
      3. בעדינות מערבולת צלחת הגדרה נמוכה (רמה 2-4) במשך 20 שניות כדי לערבב, לכסות ודגירה עבור שעה 1, 37 ° C.
      4. בשלב הבא, לשטוף את הצלחת ארבע פעמים עם חיץ לשטוף מדוללת לפי manufacturההוראות של אה. הסר את כל פתרון עודף על ידי הקשה על הבארות במגבת נייר.
      5. לאחר מכן, להוסיף 150 μl של 1: 1 פתרון פיתוח + B לזה היטב דגירה את הצלחת למשך 20-30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר.
      6. לבסוף, להוסיף 50 μl של פתרון להפסיק את כל טוב ולקחת קריאות הספיגה ב 540 ננומטר באמצעות קורא microplate. לחשב את הסכום של שחרור ציטוכרום C על ידי השוואת הסכום של ציטוכרום C בגלולה לעומת supernatant לכל תגובה.

3. הערכה של מיטוכונדריאלי פונקציה (פרע)

  1. מייד לפני התגובות מוגדרות, לדלל המיטוכונדריה 0.5 מ"ג / מיליליטר עובד ריכוז עם EB והניח בצינורות 1.5 מיליליטר לתגובות (בדרך כלל 30-50 μl של המיטוכונדריה משמש לכל צינור).
  2. טיפולי מיטוכונדריאלי
    1. להוסיף טיפולים מתאימים (שליטת EB, 1 מיקרומטר FCCP מעורבב עם 50 ננומטר Valinomycin, 10 מיקרומטר rotenone, 5 oligomycin מיקרומטר, 2 מ"מ KCN, או 200 מיקרומטר ADP, ריכוזים סופיים) כדי להפריד בין תגובות ב1/10 ה הנפח הכולל של המיטוכונדריה בדילול מלא. דגירה התגובות על גבי הספסל במשך 7 דקות.
      הערה: יש להקפיד בעת הטיפול בחומרים אלה כבליעה או ספיגה דרך העור מקרי יכול להיות מזיק.
    2. לדלל TMRE, מחדש במים סטריליים בריכוז עבודה של 100 מיקרומטר ומאוחסן ב -20 ° C, עד 2 מיקרומטר ולהוסיף נפח שווה להמיטוכונדריה נפח התגובה.
    3. דגירה התגובות על גבי הספסל במשך 7 דקות.
    4. המיטוכונדריה גלולה על ידי צנטריפוגה בהרוטור זווית קבועה ב10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    5. מחצית עומס של supernatant הנפח של כל דגימה על צלחת 396 היטב ולקרוא הקרינה.
      הערה: אורכי גל עירור ופליטה של ​​TMRE צריך להיות מותאם על פי הוראות יצרן באמצעות הנפח והצלחת שישמש לassay. שימוש בצלחת סטנדרטית 384 גם שחורה עם 25 μl של 1 מיקרומטר TMRE (ריכוז תגובה סופי) את האות החזק ביותר הושג באמצעות אורכי גל עירור / פליטה   485 nm / 535 ננומטר.
    6. לחשב את מתקפל ההבדל בקרינה בין השליטה (EB) וכל טיפול על ידי חלוקת השווי היחסי הקרינה (RFU) המתקבל מקורא הצלחת למדגם הניסיוני על ידי RFU ממדגם השליטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

טיפול בתאי HEK-293T עם 200 pg / TNF-α מיליליטר, 40 ng / ml IL1-β, ו- 75 ng / ml IFN-γ (* 3) במשך 24-48 שעות מובילים לכמויות הדרגתית של מוות של תאים (איור 1 א ). כדאיות תא הוערכו באמצעות מבחני MTT ועקביות מוכיחה כי יש ~ ירידה של 10% בכדאיויות תא עם טיפול 24 שעות וירידה של 20% ~ עם טיפול 48 שעות. תאים ש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

טיפול בתאי HEK-293T עם ציטוקינים רקומביננטי גורם כמויות מתונות של מוות של תאים מעל 48 שעות (איור 1). כמות המוות של תאים הנגרם על ידי טיפול TNF-alpha דומה למחקרים שדווחו בעבר 30 וכדאיויות תא פוחתות לאחר שיתוף ממשל של ציטוקינים מרובים כי הם יותר מ כמויות מסכמות עם כל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
L-glutamic acidSigmaG1251Can use the potassium salt instead.
malic acidSigmaM8304Can use the potassium salt instead.
KH2PO4SigmaP0662
K2HPO4SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma baseSigmaT6066
MOPSSigmaM3183
CCCPSigmaC2920Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
ValinomycinSigmaV0627Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucroseFisherS5-500
KCNMallinckrodt6379Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenoneSigmaR8875Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycinSigmaO4876Highly toxic. Made in ethanol.
ADPSigmaA2754
TMRESigma8717-25mgDilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEMGibco11965-0841x regular (high glucose).
Pen/StrepInvitrogen15140-155
L-glutamineFisherSH3002101Store aliquots at -20 °C
FBSLonza14-501FUS origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Protien Assay Dye (5x)Bio-Rad500-0006Any protein assay can substitute.
BSAFisherBP1600-100Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powderSigmaM2128Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)SigmaNP40S
Recombinant Human IL-1BGibcoPCH08014Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alphaGibcoPHC3015L
Recombinant Human IFN-gammaGibcoPHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kitR&D systemsDTC0Human for HEK-293T cells. 

References

  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
  2. Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
  3. Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
  4. Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
  5. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
  6. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  7. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714(2013).
  8. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404(2009).
  9. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
  10. Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
  11. Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
  12. Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
  14. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
  15. Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
  16. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
  17. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
  18. Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
  19. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
  20. Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
  21. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
  22. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
  23. Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
  24. Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  27. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
  28. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  29. Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
  30. Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493(2013).
  31. Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
  32. Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
  33. Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
  34. Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  35. Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
  36. Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
  37. Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
  38. Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97TMREALSHEK

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved