أخذ العينات التربة والنيماتودا الممرضة للحشرات عزل (Steinernematidae، Heterorhabditidae)

Summary

النيماتودا الممرضة للحشرات هي الديدان الإسطوانية-تقطن التربة التي تتطفل مجموعة واسعة من الحشرات. ونحن لشرح طرق أخذ العينات المستخدمة لعزل هذه النيماتودا من التربة باستخدام اثنين من التقنيات: والاصطياد والحشرات فخ الأبيض تعديل، لاسترداد الديدان الخيطية من عينات التربة والحشرات الجثث المصابة، على التوالي.

Abstract

النيماتودا الممرضة للحشرات (الملقب EPN) تمثل مجموعة من الديدان الخيطية، التي تقطن التربة التي تتطفل مجموعة واسعة من الحشرات. هذه الديدان الخيطية تنتمي إلى عائلتين: Steinernematidae وHeterorhabditidae. حتى الآن، وقد وصفت أكثر من 70 نوعا في Steinernematidae وهناك حوالي 20 نوعا في Heterorhabditidae. النيماتودا دينا شراكة متبادلة مع البكتيريا المعوية ومعا بمثابة مجمع الحشرات القوية التي تقتل مجموعة واسعة من أنواع الحشرات.

هنا، ونحن نركز على تقنيات تعتبر الأكثر شيوعا لجمع EPN من التربة. الجزء الثاني من هذا العرض يركز على تقنية الاصطياد الحشرات، وهو النهج المتبع على نطاق واسع لعزل EPN من عينات التربة، وتعديل فخ الأبيض الأسلوب الذي يستخدم لاسترداد هذه الديدان الخيطية من الحشرات المصابة. هذه الأساليب والتقنيات هي الخطوات الرئيسية لإنشاء الناجح لEPN عبادةالقوام في المختبر وأيضا تشكل الأساس لاختبارات بيولوجية الأخرى التي تنظر في هذه النيماتودا كما الكائنات نموذج للبحوث في التخصصات البيولوجية الأخرى. التقنيات المعروضة في هذا العرض تتوافق مع تلك التي يؤديها و / أو تضعها أعضاء SP المختبر المالية فضلا عن تلك التي وصفها العديد من الكتاب.

Introduction

وترتبط العديد من الديدان الخيطية مع الحشرات، وتتراوح التفاعلات التي تستضيفهم من المفيد أن يضر. هنا، ونحن نركز على مجموعة من الديدان الخيطية التي هي مسببات الأمراض من الحشرات، المعروف أيضا باسم الديدان الخيطية الممرضة للحشرات (أو EPN). الديدان الخيطية عائلتين ينتمون إلى هذه المجموعة من الديدان الخيطية: Steinernematidae وHeterorhabditidae ^11،13. تأثير المسببة للأمراض التي هي في الواقع التي يمنحها تفاعلها مع البكتيريا اللاهوائية الاختيارية المعوي (البكتيريا Xenorhabdus اقترانه steinernematids والبكتيريا Photorhabdus اقترانه heterorhabditids) ^2. وتنقلها البكتيريا من المضيف الحشرات إلى آخر عن طريق المرحلة الخيطية حرة المعيشة فقط، والأحداث المعدية المرحلة الثالثة (المعروف أيضا باسم الأحداث داور، الأحداث المعدية أو IJ)، التي تعيش في التربة. مرة واحدة داخل الحشرة، والديدان الخيطية الافراج عن البكتيريا في الدملمف الحشرة التي تقتل الحشرات المضيف عن طريق تسمم الدم واسعة النطاق. البكتيريا أيضاتتحلل الأنسجة الحشرة وتصبح مصدر الغذاء النيماتودا "، والسماح لهم حتى تنضج وتتكاثر. عادة، يتم إنتاج واحد أو جيلين من الديدان الخيطية الكبار داخل جيفة الحشرات. ذرية من الجيل الكبار reassociates مشاركة مع عدد قليل من الخلايا البكتيرية في أكثر متخصصون بطريقة من العلاقة السابقة الغذائية الخاصة بهم، ورعاية هذه الخلايا في الأمعاء لأنها الخروج من الذبيحة الحشرات في التربة حيث أنها سوف تنتظر الحشرات آخر لتتطفل ^6،11،14 (الشكل 1).

منذ اكتشافه في عام 1927، وقد نظرت EPN بدائل المبيدات الكيميائية قيمة لأنها يمكن أن تتطفل مجموعة واسعة من الحشرات التي هي الآفات الزراعية ^3،4،5. ومع ذلك، على مدى العقدين الماضيين، وقد تم التعرف على هذه الديدان الخيطية والبكتيريا التكافلية التي كنظام نموذج مرن لدراسة الجوانب البيولوجية والإيكولوجية والتطورية المضيف ميكروب interactioنانوثانية ^14.

الهدف من هذا العرض هو إظهار الأساليب والتقنيات المستخدمة الأكثر شيوعا لعينات التربة وعزل EPN. مجموعة متنوعة من الأدوات متاحة ويمكن استخدامها لجمع عينات من التربة بما في ذلك: معدات استخراج عينات جوفية التربة، والمسجات، حفارات آخر ثقب، بريمة، وأنابيب أخذ العينات، معاول جهة، من بين أمور أخرى (الشكل 2).

اعتمادا على الغرض من الدراسة، واستراتيجيات أخذ العينات اثنين يمكن اعتبار: أ) الطبقية، ب) أخذ العينات العشوائية (الشكل 3). عادة ما يتم استخدام العينة الطبقية كجزء من دراسة مكثفة في منطقة معينة أو demarked على مدى فترة معينة من الزمن. بشكل عام، يتم demarked على القطع وتؤخذ عينات من التربة على فترات المنصوص عليها في القطع على مدى فترة من الزمن (الشكل 3A) ^15. واستخدمت العينة العشوائية عموما عندما تركز على منطقة واسعة. وقد استخدمت هذه الاستراتيجية أخذ العينات لدراسة تنوع EPN وROM منطقة جغرافية واسعة أو المنطقة (الشكل 3B) ^12. ويمكن النظر في عدد من العوامل اعتمادا على التركيز في الدراسة بما في ذلك مجموعة متنوعة من المرتفعات، والقوام التربة والموائل (مثل.، الحقول المزروعة والغابات والمراعي والحدائق، والشواطئ، والمناطق المتشاطئة، الخ).

نقدم لك مجموعة من تقنية الاصطياد الحشرات، التي وصفت في الأصل من قبل الفراش وAkhurst ¹ ويمثل بديلا بسيطة وانتقائية لاسترداد EPN من عينات التربة. هذا هو إجراء انتقائي يقوم على فرضية أن الديدان الخيطية (المرحلة IJ) سوف ينجذب إلى مضيف الحشرات وتتطفل عليه. ويمكن أيضا أن تعتبر هذه التقنية لعزل مسببات الأمراض الأخرى مثل الحشرات والفطريات، والبكتيريا ^8،10.

نحن أيضا تدليل على تعديل فخ الأبيض الأسلوب الذي يستخدم لاسترجاع الديدان الخيطية ذرية من المضيفين الحشرات المصابة ^7،14. هذا هو جهد التقىهود التي توفر ميزة استرجاع على 'نظيفة' الخيطية ذرية خالية من الحطام من جثث الحشرات المهينة.

وأخيرا، فإن التقنيات الموضحة والمبينة في هذه المادة تتوافق مع تلك تصور و / أو أجريت في مختبرنا وكذلك تلك التي وصفها العديد من الزملاء والمتعاونين.

Protocol

1. التربة جمع العينات

1. النظر تغطي مساحة لا تقل عن 2 - 4 م ² لكل موقع أخذ العينات.
2. جمع عينات من التربة على عمق لا يقل عن 15 سم (الشكل 4).
3. تأخذ ما لا يقل عن 5 عينات عشوائية داخل هذا المجال.
4. يستغرق 3 عينات فرعية لكل عينة. اعتمادا على الهدف من الدراسة، إما الجمع بين العينات الفرعية أو الاحتفاظ بها منفصلة.
5. وضع كل عينة في كيس من البلاستيك. النظر المزدوج التعبئة لتجنب تسريب عينات (الشكل 4).
6. عينات التسمية مع علامة للماء. وتشمل المعلومات التالية من كل موقع أخذ العينات: معلومات عن الموقع (بما في ذلك محلة / المنطقة / اسم الموقع GPS وتنسيق المعلومات)، وتاريخ، والموئل، والغطاء النباتي المرتبطة، ودرجة الحرارة، والارتفاع، الخ
   ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، وجمع و / أو تسجيل وجود الحشرات أو غيرها من اللافقاريات التي تم جمعها مع العينة لتحديد اللاحقة. قد يمثلونها الناطور المحتملةالمضيفين آل EPN.
7. أدوات جمع نظيفة بين العينات عن طريق غسل جيدا بالماء و / أو تطهير لهم مع الايثانول 70٪ أو 0.5٪ محلول التبييض.
8. الحفاظ على العينات في برودة (8-15 درجة مئوية) أثناء النقل إلى المختبر.
9. أخذ جزء من العينة التربة لتحليلها للحصول على معلومات عن تكوين التربة، والملمس، والرطوبة، والموصلية الكهربائية أو غيرها من المعلمات التربة المطلوب.

2 عزل النيماتودا من عينات التربة: الحشرات الاصطياد وتقنيات

1. إزالة أي حطام (أي. والصخور، وقطع من الخشب أو اللحاء والأوراق وغيرها) التي تم جمعها مع العينات الخاصة بك لتجنب التلوث مع الكائنات الحية الدقيقة saprobic.
2. إضافة الماء لترطيب التربة وتسهيل حركة الديدان الخيطية.
   ملاحظة: استخدام زجاجة رذاذ لزيادة ببطء مستوى الرطوبة في التربة.
3. وضع ما يقرب من 200-250 مل من التربة الرطبة في وعاء من البلاستيك نظيفة مع غطاء.
4. إضافة الطعوم الحشرات. تنظر 5-10 الحشرات على سطح التربة من كل عينة (الشكل 5).
5. تغطية الحاويات مع غطاء وتحويل الحاويات رأسا على عقب.
6. الحفاظ على الحاويات في الظلام وعلى RT (عادة 22-25 درجة مئوية).
7. تحقق حاويات كل 2 - 3 أيام وإزالة الحشرات الميتة.
   ملاحظة: إضافة الحشرات صحية إضافية إلى كل حاوية لمزيد من الاصطياد لعينة من التربة.
8. إزالة الحشرات الميتة من الحاويات. وعادة ما يتم مطفول الجثامين مع البني أو مغرة تلوين بواسطة steinernematids، بينما مطفول الطوب الأحمر إلى الأرجواني الداكن الجثث التي كتبها heterorhabditids: ملاحظة.
9. شطف الجثث في الماء المعقم.
10. وضع الجثث في فخ الأبيض تعديل لاسترداد الديدان الخيطية ذرية (انظر الإجراء أدناه).

3 النيماتودا الشفاء من الجثامين المصابة: تعديل فخ الأبيض

1. وضع الجزء العلوي من 50 (أو 60) ملم بقطر. طبق بتري داخل صحن أكبر (100 مم).
2. تعيين خطيئة واحدةغلي ورق الترشيح دائرية (WHATMAN رقم 1) داخل صحن أصغر.
3. مكان الجثث على ورقة الترشيح من طبق أصغر مما الجثث يقين لا تلمس بعضها البعض لتجنب أي تلوث.
4. ملء الخارجي (أكبر) طبق بتري مع كاليفورنيا. 20 مل من الماء المقطر العقيمة. لا تضيف الماء في الصحن الذي يحمل الجثث.
5. تغطية طبق بيتري كبيرة ومحتوياته مع غطاء (الشكل 6).
6. تسمية الأطباق وفقا لذلك. إضافة المعلومات التالية: اسم الديدان الخيطية (الأنواع / عزل)، تاريخ الإصابة (العدوى تم تعيين التاريخ) وتاريخ الفخ (هذا هو التاريخ الذي يقع في فخ متابعة).
7. تبقي فخ في RT حتى يحدث ظهور مراحل الأحداث المعدية (نقابة الصحفيين العراقيين). هذه العملية يمكن أن تستغرق ما بين 10 - 25 يوما تبعا للأنواع الديدان الخيطية و / أو سلالة النظر فيها.
8. حصاد المياه مع نقابة الصحفيين العراقيين عن طريق إزالة الطبق أكبر من فخ وسكب الماء مع الديدان الخيطية في كوب.
9. تسمح الديدان الخيطية إلى صب على الجزء السفلي من بايكر. قد تستغرق هذه العملية بضع دقائق.
10. صب الماء بعناية، مما يجعل التأكد من الديدان الخيطية تبقى في قاع الكأس.
11. شطف الديدان الخيطية من خلال إضافة المزيد من الماء والسماح لصب الديدان الخيطية. هذه الخطوة يمكن أن تتكرر 2-3 مرات حتى المياه غير النظيفة.
12. وضع الديدان الخيطية التعليق في قارورة زراعة الأنسجة (250 مل). الحفاظ على تركيز التعليق إلى 1،000 - 3،000 الديدان الخيطية / مل.
13. مخزن قارورة مع الديدان الخيطية التعليق في غرفة باردة أو في الحاضنة بين 10-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: تحقق من تخزين قوارير دوريا كما الصلاحية من EPN هو متغير. عادة steinernematids يمكن تخزينها ل6-12 أشهر دون الحاجة إلى subculturing، في حين قد تتطلب heterorhabditids أكثر الفحوصات الدورية.

النتائج

التربة جمع العينات

المرحلة الثالثة والأحداث المعدية من EPN هي مراحل المعيشة الحرة الوحيدة في دورة حياة هذه الديدان الخيطية "التي تتواجد في التربة (الشكل 1). لذا، وجمع عينات من التربة هي طريقة فعالة جدا لاسترداد هذه الدي?...

Discussion

هذه التظاهرة هي الأولى من عرضين التي تصف عددا من التقنيات التي تستخدم عادة لدراسة EPN والبكتيريا التكافلية بهم. هذه التقنيات تمثل الخطوات الرئيسية لإنشاء ناجحة الثقافات EPN في المختبر وتشكل أيضا الأساس لاختبارات بيولوجية أخرى التي توظف EPN كما الكائنات نموذج للبحوث.

<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	For insect baiting technique
Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose	Whatman/VWR	28450-048	Infection chamber and White trap assembly
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-092	Infection chamber and White trap assembly
100 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-088	Infection chamber and White trap assembly
ZIPloc plastic bags	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling
Mechanical pipettor P1000, P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	Infection chamber and White trap assembly
Pippetor tips 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	Infection chamber and White trap assembly
Bleach	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling , disinfecting
Sodium hypochlorite	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling , disinfecting
70% Ethyl alochol	AAPER	17212945	Soil sampling , disinfecting
Shovels	Ace Hardware or local hardware store	N/A	Soil sampling
Tubular soil sampler	Accuproducts		Soil sampling
Soil probe, long handle	Nupla	PRB4T 69401 Classic	Soil sampling
Measuring tape	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling
Flagging tape, various colors	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling
Tissue culture flasks	VWR	Falcon, 29185-304	White trap, collection of EPN
Wash bottles, polyethylene, wide mouth	VWR	16650-107	White trap, collection of EPN