Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Resumo

Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.

Resumo

Nematóides entomopatogênicos (aka EPN) representam um grupo de nematóides que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Esses nematóides pertencem a duas famílias: Steinernematidae e Heterorhabditidae. Até agora, mais de 70 espécies já foram descritas no Steinernematidae e existem cerca de 20 espécies no Heterorhabditidae. Os nematóides têm uma parceria de mutualismo com bactérias Enterobacteriaceae e, juntos, eles agem como um complexo potente inseticida que mata uma grande variedade de espécies de insetos.

Aqui, vamos nos concentrar nas técnicas mais comuns considerados para a recolha de EPN do solo. A segunda parte desta apresentação centra-se na técnica de atracção de insectos, uma abordagem amplamente utilizada para o isolamento de EPN de amostras de solo, e a técnica de armadilha branco modificado, que é utilizado para a recuperação destes nematóides de insectos infectadas. Estes métodos e técnicas são passos fundamentais para o sucesso da criação EPN cultUres em laboratório e também servir de base para outros bioensaios que consideram estes nematóides como organismos modelo para a pesquisa em outras disciplinas biológicas. As técnicas indicadas nesta apresentação correspondem às realizadas e / ou concebida por membros da SP laboratório, bem como os descritos por vários autores.

Introdução

Muitos nematóides estão associados com insetos, e suas interações hospedeiro variam de benéfico para prejudicial. Aqui, vamos nos concentrar em um grupo de nematóides que são patógenos de insetos, também conhecido como nematóides entomopatogênicos (ou EPN). Duas famílias de nematóides pertencem a este grupo de nematóides: Steinernematidae e Heterorhabditidae ^11,13. O seu efeito patogênico é de fato conferida pela sua interação com anaeróbios facultativos bactérias entéricas (bactérias Xenorhabdus associar steinernematids e bactérias Photorhabdus associar heterorhabditids) ^2. As bactérias são vetorizado de um hospedeiro a outro por insetos a única fase livre nematóide de vida, a terceira fase juvenil infecciosa (também conhecida como juvenil Dauer, juvenil infecciosa ou IJ), que vive no solo. Uma vez dentro do inseto, os nematóides liberar as bactérias na hemolinfa do inseto, que matam o inseto hospedeiro por septicemia maciça. As bactérias tambémdegradam os tecidos do insecto e se tornar fonte de alimento dos nematóides, permitindo-lhes a amadurecer e multiplicar. Normalmente, uma ou duas gerações de nematóides adultos são produzidos dentro do cadáver do inseto. A progênie dos últimos reassociates geração de adultos com algumas células bacterianas em um mais especializar maneira que sua relação nutricional anterior e cultivar essas células em seus intestinos que se deslocam para fora do inseto carcaça no solo onde irão aguardar outro inseto parasitar ^6,11,14 (Figura 1).

Desde sua descoberta em 1927, EPN foram consideradas alternativas valiosas para pesticidas químicos como eles podem parasitar uma grande variedade de insetos que são pragas agrícolas ^3,4,5. No entanto, ao longo das últimas duas décadas, esses nematóides e suas bactérias simbióticas ter sido reconhecido como um sistema modelo para o estudo de aspectos maleável biológicos, ecológicos e evolutivos de host-micróbio interactions ^14.

O objetivo desta apresentação é mostrar os métodos e técnicas mais comumente utilizadas para a amostragem do solo e isolamento de EPN. Uma variedade de ferramentas está disponível e pode ser usado para a coleta de amostras de solo, incluindo: corers solo, espátulas, escavadoras pós-buracos, brocas, tubos de amostragem, pás de mão, entre outros (Figura 2).

Dependendo do objectivo do estudo, duas estratégias de amostragem pode ser considerada: a) estratificado, b) amostragem (Figura 3). A amostragem estratificada é normalmente usado como parte de um estudo intensivo de uma área específica ou demarcada sobre um dado período de tempo. Em geral, uma seção transversal é demarcado e amostras de solo são tomadas a intervalos previstos na transecção ao longo de um período de tempo (Figura 3A) ^15. A amostragem aleatória é geralmente empregada quando o foco em uma área extensa. Esta estratégia de amostragem foi usado para estudar a diversidade de EPN fesde uma grande área geográfica ou região (Figura 3B) ^12. Uma série de fatores podem ser considerados, dependendo do foco do estudo, incluindo uma grande variedade de elevações, texturas de solo e habitats (por exemplo., Campos cultivados, florestas, pastos, parques, praias, matas ciliares, etc.)

Mostramos a técnica de atracção de insectos, que foi originalmente descrito por Bedding e Akhurst ¹ e representa uma alternativa simples e selectiva para a recuperação a partir de amostras de solo de EPN. Este é um processo selectiva que é baseado na premissa de que os nemátodos (estádio IJ) será atraído para uma série de insectos e que parasitam. Esta técnica também pode ser considerada para o isolamento de outros agentes patogénicos de insectos, tais como fungos, bactérias e ^8,10.

Também demonstramos a técnica armadilha branco modificado que é utilizado para a recuperação de nemátodo progenitura de hospedeiros infectados insectos ^7,14. Este é um esforço method que oferece a vantagem de recuperar uma "limpa" nematóide progênie livre de restos de cadáveres de insetos degradantes.

Finalmente, as técnicas descritas e mostradas neste artigo correspondem aos concebido e / ou realizados no nosso laboratório, bem como os descritos por vários colegas e colaboradores.

Protocolo

1. Coleta de Amostras de solo

1. Considere que cobre uma área mínima de 2 - 4 m ² para cada local de amostragem.
2. Recolha de amostras de solo a uma profundidade de pelo menos 15 cm (Figura 4).
3. Tome pelo menos 5 amostras aleatórias dentro desta área.
4. Tome 3 subamostras por amostra. Dependendo do objetivo do estudo, ou combinar as subamostras ou mantê-los separados.
5. Coloque cada amostra em um saco plástico. Considere duplo ensacamento para evitar vazamento de amostras (Figura 4).
6. Amostras de etiquetas com um marcador à prova d'água. Inclua as seguintes informações de cada local de amostragem: informações do site (incluindo localidade / área / nome do site e GPS coordenar informações), data, habitat, a vegetação associada, temperatura, altitude, etc
   NOTA: Se for o caso, recolher e / ou registrar a presença de insetos e outros invertebrados coletados com a amostra para posterior identificação. Eles podem representar potencial naturhospedeiros al EPN.
7. Ferramentas de recolha limpos entre as amostras mediante a lavagem com água e / ou desinfectar as com etanol a 70% ou solução de lixívia a 0,5%.
8. Manter as amostras em um refrigerador (8 - 15 ° C) durante o transporte para o laboratório.
9. Pegue uma porção da amostra de solo para análise para obter informações sobre a composição do solo, textura, umidade, condutividade elétrica ou outros parâmetros do solo desejados.

. 2 Isolamento Nematóides de amostras de solo: Técnica do Inseto-baiting

1. Remova todos os detritos (ie., Rochas, pedaços de madeira ou casca, folhas, etc.), Coletados com suas amostras para evitar a contaminação com microorganismos saprobic.
2. Adicionar água para umedecer o solo e facilitar a circulação de nematóides.
   NOTA: Use um frasco de spray para aumentar lentamente o nível de umidade do solo.
3. Colocar aproximadamente 200 a 250 ml de solo húmido num recipiente de plástico limpo com uma tampa.
4. Adicionar iscas de insetos. Considere 5 a 10 insectos para a superfície do solo de cada amostra (Figura 5).
5. Cobrir o recipiente com tampa e ligar recipientes de cabeça para baixo.
6. Manter recipientes no escuro e à temperatura ambiente (normalmente 22-25 ° C).
7. Verifique os recipientes a cada 2 - 3 dias, e remover insetos mortos.
   NOTA: adicionar insetos saudáveis ​​adicionais para cada recipiente para posterior baiting da amostra de solo.
8. Remover insetos mortos dos recipientes. NOTA: Cadáveres com um marrom ou ocre coloração geralmente são parasitados por steinernematids, enquanto tijolo vermelho para cadáveres roxo escuro são parasitados por heterorhabditids.
9. Enxágüe cadáveres em água estéril.
10. Coloque cadáveres em uma armadilha Branco modificado para recuperação de nematóide progênie (ver procedimento abaixo).

. 3 Nematode recuperação de cadáveres infectados: Modificado Armadilha Branco

1. Coloque a parte superior de um diâmetro 50 (ou 60) mm. Placa de Petri dentro de um prato grande (100 mm).
2. Definir um pecadopapel de filtro circular gle (Whatman # 1) no interior do prato menor.
3. Coloque cadáveres sobre o papel de filtro do prato menor certificando-se de cadáveres não se tocam para evitar qualquer contaminação.
4. Encha o exterior (maior) placa de Petri com ca. 20 ml de água destilada estéril. Não adicionar água no prato que contém os cadáveres.
5. Cobrir a grande placa de Petri e seu conteúdo, com a tampa (Figura 6).
6. Rotular pratos de acordo. Adicione as seguintes informações: Nome do Nemátodo (espécie / isolado), a data de infecção (infecção data foi definida) e data armadilha (esta é a data em que a armadilha está configurado).
7. Mantenha a armadilha RT até a emergência dos estágios juvenis infectantes (IJS) ocorre. Este processo pode levar entre 10 - 25 dias, dependendo da espécie e / ou tensão considerado nematóides.
8. Colheita de água com IJs removendo o maior prato da armadilha e despejar água com nematóides para um copo.
9. Permitir nemátodos decantar para a parte inferior da bEaker. Este processo pode demorar alguns minutos.
10. Despeje água cuidadosamente, certificando-se de nematóides permanecem no fundo do copo.
11. Lavar nematóides, adicionando mais água e permitindo que os nemátodos para decantar. Este passo pode ser repetido 2-3 vezes, até que a água é limpa.
12. Colocar a suspensão de nemátodos num balão de cultura de tecidos (250 ml). Manter a concentração da suspensão a 1.000 - 3.000 nemátodos / ml.
13. Frasco loja com suspensão de nematóides em uma sala fria ou em estufa entre 10-20 ° C.
    NOTA: verifique frascos armazenados periodicamente como a vida de prateleira de EPN é variável. Normalmente steinernematids pode ser armazenado por 6-12 meses, sem a necessidade de subcultura, enquanto heterorhabditids pode exigir mais check-ups periódicos.

Resultados

Coleta de Amostras de solo

Em estágio Terceiro juvenis infectantes de EPN são os únicos estágios gratuitos de vida no ciclo de vida desses nematóides que residem no solo (Figura 1). Portanto, a recolha de amostras de solo é um método muito eficiente para recuperar estes nemátodos. Figura 4 mostra um perfil de solo que indica a profundidade a que devem ser recolhidas amostras. Preservar a umidade de uma amostra é um fator chave para a sobrevivência ...

Discussão

Esta demonstração é a primeira de duas apresentações que descrevem um número de técnicas que são comummente usados ​​para estudar EPN e suas bactérias simbióticas. Estas técnicas representam passos fundamentais para o sucesso da criação culturas EPN em laboratório e também servir de base para outros bioensaios que empregam EPN como organismos modelo para a pesquisa.

Vários levantamentos de solos de EPN têm mostrado que a sua abundância e distribuição pode variar entre...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	for insect baiting technique
Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose	Whatman/VWR	28450-048	infection chamber and White trap assembly
60 x 15 mm Petri Dishes	VWR	25384-092	infection chamber and White trap assembly
100 x 15 Petri Dishes	VWR	25384-088	infection chamber and White trap assembly
ZIPloc Plastic Bags	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Mechanical Pipettor P1000, P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	infection chamber and White trap assembly
pippetor tips 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	infection chamber and White trap assembly
Bleach	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
Sodium Hypochlorite	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
70% Ethyl alochol	AAPER	17212945	soil sampling , desisnfecting
Shovels	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Tubular soil sampler	Accuproducts	N/A	soil sampling
Soil Probe, long handle	Nupla	PRB4T 69401 Classic	soil sampling
Measuring tape	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Flagging tape, various colors	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
tissue culture flasks	VWR	Falcon, 29185-304	White trap, collection of EPN
wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth	VWR	16650-107	White trap, collection of EPN