Toprak Örnekleme ve Entomopatojenik Nematodlar İzolasyonu (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Özet

Entomopatojenik nematodlar böcek geniş bir yelpazede parasitize toprakta yaşayan yuvarlak solucan bulunmaktadır. Sırasıyla toprak örneklerinin ve enfekte olmuş böcek kadavra, nematod geri kazanılması için böcek kızdırma ve modifiye edilmiş beyaz tuzak: iki teknikler kullanılarak topraktan bu nematod izolasyonu için kullanılan örnekleme yöntemlerini göstermektedir.

Özet

Entomopatojenik nematodlar (aka EPN) böceklerin geniş bir yelpazede parasitize toprakta yaşayan nematod bir grubu temsil eder. Steinernematidae ve Heterorhabditidae: Bu nematod iki aileye aittir. Şimdiye kadar, 70'in üzerinde tür Steinernematidae tarif edilmiştir ve yaklaşık 20 tür Heterorhabditidae de vardır. Nematodlar Enterobacteriaceae bakteri ile bir ortaklık mutualistik ve birlikte böcek türlerinin geniş bir yelpazede öldüren kuvvetli bir insektisid kompleksi olarak hareket ederler.

Bu yazıda, topraktan EPN toplamak için düşünülen en yaygın teknikler üzerinde durulacak. Bu sunumun ikinci bölümü böcek-kızdırma tekniği, toprak örneklerinden EPN izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, ve enfekte olmuş böcekler bu nematod kurtarma için kullanılan modifiye Beyaz tuzak tekniği üzerinde duruluyor. Bu yöntemler ve teknikler EPN kültünün başarılı kurulması için önemli adımlarLaboratuvarda ayrıca ures diğer biyolojik disiplinlerde araştırma için bir model organizma bu nematod dikkate diğer biyoanalizlere için temelini oluşturur. Bu sunumda gösterilen teknikler SP Stock laboratuar üyelerinin yanı sıra, çeşitli yazarlar tarafından tarif edilenler ile gerçekleştirilebilir ve / ya da tasarlanmış karşılık gelir.

Giriş

Birçok nematod böcekler ile ilişkili, ve ev sahibi ilişkileri yararlı gelen zararlı değişir edilir. Burada, aynı zamanda entomopatojenik nematod (veya EPN) olarak bilinen böcek patojen nematodlara, bir grup üzerinde odaklanır. Steinernematidae ve Heterorhabditidae ^11,13: İki nematod aile nematod bu gruba aittir. Onların patojenik etkisi fakültatif anaerobik enterik bakteriler (Wenorhabdus bakteri heterorhabditids ile ilişkilendirmek steinernematids ve Fotorhabdus bakteri ile ilişkilendirmek) ² ile etkileşimi tarafından kazandırılan aslında. Bakteri toprakta yaşayan tek serbest yaşayan nematod aşamasında, (ayrıca Dauer yavru, enfektif yavru veya IJ olarak da bilinir) üçüncü aşama enfektif yavru, tek böceğin diğerine vectored edilir. Bir kez böcek içinde, nematodlar büyük septisemi ile böcek ev sahibi öldüren, böceğin hemolimf içine bakteri bırakın. Ayrıca, bakterilerböceğin dokularını aşağılamak ve onları olgun ve çoğalmaya izin nematodların 'besin kaynağı olur. Genellikle, yetişkin nematod bir veya iki kuşak böcek kadavranın içinde üretilmektedir. Birkaç bakteri hücreleri ile son nesil yetişkin yeniden ilişkilendirir soy, daha önceki beslenme ilişki daha şekilde uzmanlaşmış ve onlar parasitize başka böcek bekleyecek toprağa böcek karkas dışarı hareket olarak bağırsaklarında bu hücreleri beslemek ^6,11,14 (Şekil 1).

Onlar tarım zararlıları ^3,4,5 olan böceklerin geniş bir yelpazede parasitize gibi 1927 yılında keşfedilmesinden bu yana, EPN'dir kimyasal pestisitlerin değerli alternatifleri kabul edilmiştir. Ancak, son iki yılda, bu nematodlar ve simbiyotik bakterilerin konak-mikrop ETKİLEŞİMİ biyolojik, ekolojik ve evrimsel yönlerini incelemek için uysal bir model sistem olarak kabul edilmiştirns ^14.

Bu sunumun amacı yöntemleri ve en yaygın toprak örneklemesi ve EPN izolasyonu için kullanılan teknikleri göstermektir. Çeşitli araçlar mevcuttur ve dahil olmak üzere toprak örnekleri toplamak için kullanılabilir: Toprak corers, mala, post-delik kazma, burgular, örnekleme tüpleri, el kürek, diğerleri arasında (Şekil 2).

Çalışmanın amacına bağlı olarak, iki örnekleme stratejileri olarak kabul edilebilir: a) tabakalı, b) rastgele örnekleme (Şekil 3). Tabakalı örnekleme genellikle belirli bir zaman süresi boyunca belirli bir ya da demarked alanda yoğun bir çalışmanın bir parçası olarak kullanılır. Genel olarak, bir transect demarked ve toprak örnekleri belirli bir süre (Şekil 3A) üzerinde ¹⁵ transect belirtilen aralıklarla alınır. Geniş bir alanda odaklanarak zaman rastgele örnekleme genellikle kullanılır. Bu numune alma stratejisi EPN f çeşitliliğini incelemek için kullanılmıştırgeniş bir coğrafi alana veya bölge (Şekil 3B) ¹² rom. Bir dizi faktör yüksekliklerde, toprak dokular ve habitatları (örn.., Ekili alanlar, ormanlar, meralar, parklar, kıyılarda, nehir kıyısı alanları, vb) çeşitli bir yelpazede de dahil olmak üzere çalışmanın odak bağlı olarak kabul edilebilir.

Başlangıçta yatak ve Akhurst ¹ tarafından tarif edildiği ve toprak numunelerinden EPN geri kazanılması için basit ve seçici bir alternatif temsil eder böcek yem tekniği göstermektedir. Bu nematod (IJ aşama) bir böceğin çekti ve onu parasitize olacağını öncül dayalı bir seçici işlemdir. Bu teknik aynı zamanda, diğer böcek mantar gibi patojenlerin ve bakterilerin izolasyonu için ^8,10 olarak kabul edilebilir.

Ayrıca enfekte olmuş böcek ana ^7,14 ikinci nematod döl almak için kullanılan modifiye edilmiş beyaz tuzak tekniği göstermektedir. Bu araya bir zahmetsizaşağılayıcı böcek kadavra enkaz ücretsiz 'temiz' bir nematod döl alma avantajı sunuyor hod.

Son olarak, tarif edilen ve bu makalede gösterilen teknikler tasarlanmış ve / veya laboratuarda yanı sıra çeşitli arkadaşları ve arkadaşları tarafından tarif edilenlere gerçekleştirilen edilenlere tekabül eder.

Protokol

1.. Toprak Örnek Toplama

1. Her örnekleme site için 4 m ² - 2 minimum alanı kapsayan düşünün.
2. En az 15 cm derinlikte (Şekil 4) de toprak örnekleri toplamak.
3. Bu alanda en az 5 rastgele numune almak.
4. Örnek başına 3 Alt-numûnelerin al. , Çalışmanın amacı bağlı numûnelerin birleştirmek veya onları ayrı tutmak ya.
5. Bir plastik torba içinde her örnek yerleştirin. Numunelerin sızmasını (Şekil 4) önlemek için çift torbalama düşünün.
6. Su geçirmez bir işaretleyici ile etiket örnekleri. Vb (yerellik / alan / site adı ve GPS koordinat bilgileri dahil) Site bilgileri, tarih, habitat, ilişkili bitki örtüsü, sıcaklık, yükseklik,: Her örnekleme sitesinden aşağıdaki bilgileri içerir
   NOT: Varsa, böcekler ya da sonraki tanımlama için numune toplanan diğer omurgasız varlığını toplamak ve / veya kaydedin. Bunlar potansiyel natur temsil edebilirarkadaşları EPN ana.
7. Bol su ile yıkama ve / veya% 70 etanol ya da% 0.5 'lik ağartıcı çözeltisi ile dezenfekte edilmesi ile örnekler arasında temiz toplama araçları.
8. Laboratuara taşınması sırasında - (15 ° C 8) bir soğutucu örnekleri tutun.
9. Toprak yapısı, doku, nem, elektrik iletkenliği veya diğer istenen toprak parametreleri hakkında bilgi elde etmek için analiz için toprak numunesinin bir kısmını al.

. Toprak Örneklerinin 2 Nematod İzolasyon: Böcek-kızdırma Tekniği

1. Herhangi bir enkaz kaldırmak (yani., Kayalar, vb ahşap veya ağaç kabuğu, yaprak, parçaları.) Saprobik mikroorganizma ile kirlenmesini önlemek için örnekleri ile toplanır.
2. Toprak nemlendirmek ve nematod hareketini kolaylaştırmak için su ilave edilir.
   Not: yavaşça toprağın nem seviyesini artırmak için bir sprey şişesi kullanın.
3. Bir kapak ile temiz bir plastik kap içinde nemli toprağın yaklaşık 200-250 ml yerleştirin.
4. Böcek yemler Ekle. Her bir numunenin toprak yüzeyine (Şekil 5) 5-10 böcekler düşünün.
5. Bir kapakla örtün ve kabı ters kapları çevirin.
6. (- 25 ° C, genellikle 22), karanlıkta ve oda sıcaklığında muhafaza kapları.
7. 3 gün ve ölü böcekler çıkarın - her 2 kapları atın.
   NOT: toprak numunesinin daha fazla kızdırma için her kaba ilave sağlıklı böcekleri ekleyin.
8. Kaplardan ölü böcekler çıkarın. NOT: Koyu mor kadavra kırmızı tuğla heterorhabditids tarafından parazitlenmiş oysa bir kahverengi ya da koyu sarı renk ile Cadavers genellikle steinernematids tarafından asalaklanmış edilir.
9. Steril su içinde kadavra durulayın.
10. (Aşağıdaki prosedüre bakınız) nematod döl yeniden elde edilmesi için bir modifiye edilmiş beyaz kapanında kadavra yerleştirin.

. Enfekte Disseksiyon 3 Nematod Kurtarma: Modifiye Beyaz Trap

1. 50 (veya 60) mm çap üst yerleştirin. Daha büyük bir tabak (100 mm) iç petri.
2. Bir günah Setküçük bir tabak içinde gle dairesel filtre kağıdı (Whatman # 1).
3. Emin kadavra yapma küçük çanak filtre kağıdının üzerine yerleştirin kadavra herhangi bir bulaşmayı önlemek için birbirlerine dokunmayın.
4. Ca ile dış (daha büyük) Petri çanağı doldurun. Steril damıtılmış su, 20 ml. Kadavra tutan çanak su katmayın.
5. Büyük Petri kabı ve kapağı ile içeriği (Şekil 6) kapsamaktadır.
6. Buna göre yemekler etiketleyin. Nematod adı (tür / izole), enfeksiyon tarih (tarih enfeksiyon kuruldu) ve tuzak tarih (bu tuzak kurmak tarihidir): Aşağıdaki bilgileri ekleyin.
7. Enfektif genç safhalardan (IJs) ortaya çıkışı oluşana kadar oda sıcaklığında tuzak tutun. Nematod türlerinin ve / veya kabul gerginlik bağlı olarak 25 gün - Bu işlem 10 arasında sürebilir.
8. Tuzak büyük çanak kaldırılması ve bir behere nematod ile su dökerek IJs ile hasat su.
9. Nematodlar b dibine süzün izin verEaker. Bu işlem birkaç dakika sürebilir.
10. Emin nematodlar beher dibinde kalacak yapma, dikkatli bir şekilde su dökün.
11. Daha fazla su ilave edilir ve nematod boşaltmak için izin vererek nematodları durulayın. Su temiz olana kadar 3 kez - Bu adım 2 tekrar edilebilir.
12. Bir doku kültür şişesine (250 mi) içinde süspansiyon nematod yerleştirin. 3000 nematod / ml - süspansiyonun konsantrasyonu 1.000 tutun.
13. C. ° 20 - soğuk bir odada veya inkübatör nematod süspansiyon ile mağaza şişesi 10 arasında
    NOT: EPN raf ömrü değişkendir periyodik olarak saklanan şişeler kontrol edin. Heterorhabditids daha periyodik olarak check-up gerektirebilir oysa, alt kültür gerek olmadan 12 ay - Ortalama steinernematids 6 saklanabilir.

Sonuçlar

Toprak Örnek Toplama

EPN Üçüncü aşama enfektif gençler toprakta (Şekil 1) ikamet bu Nematodlar 'yaşam döngüsü içinde sadece özgür yaşam evreleri vardır. Bu nedenle toprak örnekleri toplayarak bu nematod kurtarmak için çok etkili bir yöntemdir. 4 örnek alınması gereken hangi derinliğini gösteren bir toprak profili göstermektedir. Bir numunenin nem korunması nematodların hayatta kalmak için önemli bir faktör...

Tartışmalar

Bu gösteri genellikle EPN ve simbiyotik bakteri eğitim için kullanılan tekniklerin bir dizi tanımlamak iki sunumlar ilk. Bu teknikler laboratuvarda EPN kültürlerin başarılı kurulması için önemli adımlar temsil ve aynı zamanda araştırma için bir model organizma EPN kullanır diğer biyoanalizlere için temelini oluşturur.

EPN Çeşitli zemin etütleri onların bolluk ve dağıtım mevsim, habitatlar ve coğrafi bölgelere ^{4, 5,9,15} arasında farklılık olduğunu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	for insect baiting technique
Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose	Whatman/VWR	28450-048	infection chamber and White trap assembly
60 x 15 mm Petri Dishes	VWR	25384-092	infection chamber and White trap assembly
100 x 15 Petri Dishes	VWR	25384-088	infection chamber and White trap assembly
ZIPloc Plastic Bags	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Mechanical Pipettor P1000, P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	infection chamber and White trap assembly
pippetor tips 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	infection chamber and White trap assembly
Bleach	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
Sodium Hypochlorite	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
70% Ethyl alochol	AAPER	17212945	soil sampling , desisnfecting
Shovels	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Tubular soil sampler	Accuproducts	N/A	soil sampling
Soil Probe, long handle	Nupla	PRB4T 69401 Classic	soil sampling
Measuring tape	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Flagging tape, various colors	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
tissue culture flasks	VWR	Falcon, 29185-304	White trap, collection of EPN
wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth	VWR	16650-107	White trap, collection of EPN