Muestreo de suelos y aislamiento de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Resumen

Nematodos entomopatógenos son gusanos redondos habitan en el suelo que parasitan una amplia gama de insectos. Demostramos métodos de muestreo utilizados para el aislamiento de estos nematodos del suelo mediante dos técnicas: la de cebado de insectos y la trampa de Blanco modificada, para la recuperación de nematodos de muestras de suelo y cadáveres de insecto infectadas, respectivamente.

Resumen

Nematodos entomopatógenos (también conocido como EPN) representan un grupo de nematodos que habitan el suelo que parasitan una amplia gama de insectos. Estos nematodos pertenecen a dos familias: Steinernematidae y Heterorhabditidae. Hasta ahora, más de 70 especies han sido descritas en la Steinernematidae y hay cerca de 20 especies en el Heterorhabditidae. Los nematodos tienen una asociación mutualista con bacterias Enterobacteriaceae y juntos actúan como un complejo insecticida que mata a una amplia gama de especies de insectos.

Aquí, nos centramos en las técnicas más comunes que se consideran para la recogida de EPN del suelo. La segunda parte de esta presentación se centra en la técnica de los insectos-cebo, un enfoque ampliamente utilizado para el aislamiento de EPN a partir de muestras de suelo, y la técnica de trampa Blanco modificada que se utiliza para la recuperación de estos nematodos de los insectos infectados. Estos métodos y técnicas son pasos clave para el éxito del establecimiento de EPN cultodas en el laboratorio y también forman la base para otros bioensayos que consideran estos nematodos como organismos modelo para la investigación en otras disciplinas biológicas. Las técnicas mostradas en esta presentación corresponden a las realizadas y / o diseñado por los miembros de SP Stock de laboratorio, así como los descritos por diversos autores.

Introducción

Muchos nematodos están asociadas con los insectos, y sus interacciones huésped ser beneficiosos o perjudiciales. Aquí, nos centramos en un grupo de nematodos que son patógenos de insectos, también conocido como nematodos entomopatógenos (o EPN). Dos familias de nematodos pertenecen a este grupo de nematodos: Steinernematidae y Heterorhabditidae ^11,13. Su efecto patógeno es, de hecho, conferida por su interacción con las bacterias entéricas bacterias anaerobias facultativas (Xenorhabdus se asocian con steinernematids y bacterias Photorhabdus asociar con heterorhabditids) ^2. Las bacterias se vectored de un insecto huésped a otro por la única etapa de nematodos de vida libre, la infectivo juvenil de tercera etapa (también conocida como juvenil dauer, infectivo juvenil o IJ), que vive en el suelo. Una vez dentro del insecto, los nemátodos liberan las bacterias en la hemolinfa del insecto, que matan el insecto huésped por septicemia masiva. Las bacterias tambiéndegradar los tejidos del insecto y se convierten en fuente de alimento de los nematodos ', lo que les permite madurar y se multiplican. Por lo general, una o dos generaciones de nematodos adultos se producen dentro del cadáver del insecto. La progenie de los últimos reasocia generación adulto con unas pocas células bacterianas en un más especializarse de manera que su relación nutricional anterior, y cultivar estas células en sus intestinos a medida que se mueven hacia fuera de la carcasa de insectos en el suelo donde esperarán otro insecto para parasitar ^6,11,14 (Figura 1).

Desde su descubrimiento en 1927, EPN se han considerado alternativas valiosas a los plaguicidas químicos, ya que pueden parasitar una amplia gama de insectos que son plagas agrícolas ^3,4,5. Sin embargo, en las últimas dos décadas, estos nematodos y sus bacterias simbióticas se han reconocido como un sistema modelo para el estudio maleable aspectos biológicos, ecológicos y evolutivos de INTERACCIÓ host-microbions ^14.

El objetivo de esta presentación es mostrar los métodos y técnicas más comúnmente utilizadas para el muestreo de suelos y el aislamiento de EPN. Una variedad de herramientas está disponible y se puede utilizar para la recogida de muestras de suelo, incluyendo: corers suelo, paletas, excavadoras post-hole, sinfines, tubos de muestreo, palas de mano, entre otros (Figura 2).

Dependiendo del propósito del estudio, dos estrategias de muestreo pueden ser considerados: a) estratificado, b) el muestreo aleatorio (Figura 3). El muestreo estratificado se utiliza por lo general como parte de un estudio intensivo en un área específica o demarcada durante un período determinado de tiempo. En general, un transecto está demarcada y muestras de suelo se toman a intervalos estipulados en el transecto en un período de tiempo (Figura 3) ^15. El muestreo aleatorio se emplea generalmente cuando se centra en un área extensa. Esta estrategia de muestreo ha sido utilizado para el estudio de la diversidad de EPN fesde una gran área geográfica o región (Figura 3 B) ^12. Una serie de factores se puede considerar en función del objetivo del estudio que incluye una amplia gama de elevaciones, texturas de suelo y los hábitats (por ejemplo., Campos de cultivo, bosques, pastizales, parques, playas, áreas ribereñas, etc.)

Se demuestra la técnica de los insectos-cebo, que fue descrito originalmente por ropa de cama y Akhurst ¹ y representa una alternativa sencilla y selectiva para la recuperación de la EPN de muestras de suelo. Este es un procedimiento selectivo que se basa en la premisa de que los nematodos (estadio IJ) se sentirán atraídos por un huésped de insectos y parásitos de ella. Esta técnica también se puede considerar para el aislamiento de otros patógenos de insecto tales como hongos, bacterias y ^8,10.

También demuestran la técnica de trampa Blanco modificada que se utiliza para la recuperación de la progenie de nematodos a partir de huéspedes de insecto infectadas ^7,14. Este es un esfuerzo conocidohod que ofrece la ventaja de la recuperación de una "limpia" progenie de nematodos libres de residuos de los cadáveres de insectos degradantes.

Por último, las técnicas descritas y mostradas en este artículo corresponden a los concebidos y / o realizado en nuestro laboratorio, así como los descritos por diversos colegas y colaboradores.

Protocolo

1. Toma de Muestras de Suelos

1. Considere cubrir una superficie mínima de 2 a 4 m ² por cada sitio de muestreo.
2. Recoger muestras de suelo a una profundidad de al menos 15 cm (Figura 4).
3. Tomar por lo menos 5 muestras aleatorias dentro de esta área.
4. Tomar 3 submuestras por muestra. Dependiendo del objetivo del estudio, ya sea combinan las submuestras o mantenerlas separadas.
5. Colocar cada muestra en una bolsa de plástico. Considere la posibilidad de doble embolsado para evitar fugas de las muestras (Figura 4).
6. Muestras de la etiqueta con un marcador indeleble. Incluya la siguiente información de cada sitio de muestreo: Información del sitio (incluyendo localidad / área / nombre del sitio y el GPS las coordenadas información), la fecha, el hábitat, la vegetación asociada, temperatura, altitud, etc
   NOTA: Si es aplicable, obtener y / o registrar la presencia de insectos u otros invertebrados recolectados con la muestra para su posterior identificación. Pueden representar potencial naturhosts al EPN.
7. Herramientas de recogida Limpiar a fondo entre las muestras de lavado con agua y / o desinfección de ellos con etanol al 70% o una solución de cloro al 0,5%.
8. Mantener las muestras en un refrigerador (8-15 ° C) durante el transporte al laboratorio.
9. Tome una porción de la muestra de suelo para el análisis para obtener información sobre la composición del suelo, la textura, la humedad, conductividad eléctrica o de otros parámetros del suelo deseadas.

. 2 Aislamiento de nematodos de muestras de suelo: Insect-cebo Técnica

1. Elimine todos los residuos (es decir., Rocas, trozos de madera o la corteza, las hojas, etc.) Recogidos con sus muestras para evitar la contaminación con microorganismos saprobic.
2. Añadir agua para humedecer el suelo y facilitar la circulación de los nematodos.
   NOTA: Utilice una botella de spray para aumentar poco a poco el nivel de humedad del suelo.
3. Coloque aproximadamente 200 a 250 ml de suelo húmedo en un recipiente de plástico limpio con tapa.
4. Añadir cebos de insectos. Considere la posibilidad de 5 a 10 insectos a la superficie del suelo de cada muestra (Figura 5).
5. Cubra el recipiente con una tapa y voltee los contenedores que al revés.
6. Mantener los contenedores en la oscuridad y a temperatura ambiente (generalmente 22-25 ° C).
7. Compruebe contenedores cada 2 - 3 días y quitar los insectos muertos.
   NOTA: agregar insectos sanos adicionales para cada recipiente para su posterior cebo de la muestra de suelo.
8. Quite los insectos muertos de los contenedores. NOTA: Los cadáveres con un marrón o coloración ocre son generalmente parasitados por steinernematids, mientras que los de ladrillo rojo a púrpura oscuro cadáveres son parasitados por heterorhabditids.
9. Enjuague cadáveres en agua estéril.
10. Coloque cadáveres en una trampa Blanco modificada para la recuperación de la progenie nematodo (consulte el siguiente procedimiento).

. 3 Nematodo La recuperación de cadáveres infectados: Modificado Trampa Blanco

1. Coloque la parte superior de un diámetro de 50 (o 60) mm. Placa de Petri dentro de un plato más grande (100 mm).
2. Establecer un pecadopapel de filtro circular gle (Whatman # 1) en el interior del plato más pequeño.
3. Coloque los cadáveres sobre el papel de filtro del plato más pequeño asegurarse de que los cadáveres no se toquen entre sí para evitar cualquier contaminación.
4. Llene el exterior (grande) caja de Petri con ca. 20 ml de agua destilada estéril. No agregue agua en el plato que contiene los cadáveres.
5. Cubrir la placa de Petri grande y su contenido con la tapa (Figura 6).
6. Etiqueta de platos en consecuencia. Agregue la siguiente información: nombre del nematodo (especie / cepa), la fecha de la infección (infección se estableció la fecha) y la fecha de la trampa (esta es la fecha en que la trampa está configurado).
7. Mantenga trampa a TA hasta que se produce la emergencia de estados juveniles infectivos (IJs). Este proceso puede tardar entre 10 - 25 días, dependiendo de la especie y / o cepa considerada nematodos.
8. Cosecha de agua con JIs mediante la eliminación de la plato más grande de la trampa y vertido de agua con los nematodos en un vaso de precipitados.
9. Permitir nematodos decantar a la parte inferior de la bEAKER. Este proceso puede tardar unos minutos.
10. Verter el agua cuidadosamente, asegurándose de que los nematodos se mantienen en la parte inferior del vaso de precipitados.
11. Enjuague nematodos añadiendo más agua y permitiendo que los nematodos decantar. Este paso se puede repetir 2 - 3 veces hasta que el agua esté limpia.
12. Coloque suspensión de nematodos en un matraz de cultivo de tejidos (250 ml). Mantener la concentración de la suspensión a 1.000 - 3.000 nemátodos / ml.
13. Frasco tienda con suspensión de nematodos en una habitación fría o en incubadora entre 10 a 20 ° C.
    NOTA: compruebe frascos almacenados periódicamente a medida que la vida útil de EPN es variable. Por lo general steinernematids se pueden almacenar durante 6 - 12 meses, sin la necesidad de subcultivos, mientras que heterorhabditids pueden requerir más revisiones periódicas.

Resultados

Recogida de muestras de suelo

Tercera etapa juveniles infectivos de EPN son los únicos estadios de vida libre en el ciclo de vida de estos nematodos 'que se encuentran en el suelo (Figura 1). Por lo tanto, la recolección de muestras de suelo es un método muy eficiente para recuperarse de estos nematodos. Figura 4 muestra un perfil de suelo que indica la profundidad a la que se deben tomar las muestras. Preservar la humedad de una muestra es un factor ...

Discusión

Esta demostración es la primera de dos presentaciones que describen una serie de técnicas que se utilizan comúnmente para el estudio de la EPN y sus bacterias simbióticas. Estas técnicas representan pasos fundamentales para el establecimiento exitoso de las culturas EPN en el laboratorio y también constituyen la base para otros bioensayos que emplean EPN como organismos modelo para la investigación.

Varios estudios de suelos de EPN han demostrado que su abundancia y distribución pued...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	for insect baiting technique
Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose	Whatman/VWR	28450-048	infection chamber and White trap assembly
60 x 15 mm Petri Dishes	VWR	25384-092	infection chamber and White trap assembly
100 x 15 Petri Dishes	VWR	25384-088	infection chamber and White trap assembly
ZIPloc Plastic Bags	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Mechanical Pipettor P1000, P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	infection chamber and White trap assembly
pippetor tips 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	infection chamber and White trap assembly
Bleach	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
Sodium Hypochlorite	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
70% Ethyl alochol	AAPER	17212945	soil sampling , desisnfecting
Shovels	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Tubular soil sampler	Accuproducts	N/A	soil sampling
Soil Probe, long handle	Nupla	PRB4T 69401 Classic	soil sampling
Measuring tape	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Flagging tape, various colors	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
tissue culture flasks	VWR	Falcon, 29185-304	White trap, collection of EPN
wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth	VWR	16650-107	White trap, collection of EPN