Campionamento e Isolamento di Nematodi entomopatogeni Suolo (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Riepilogo

Nematodi entomopatogeni sono nematodi del suolo abitare che parassitano una vasta gamma di insetti. Dimostriamo metodi di campionamento utilizzati per l'isolamento di questi nematodi dal terreno utilizzando due tecniche: l'adescamento insetto e la trappola bianco modificato, per il recupero dei nematodi dai campioni di suolo e cadaveri insetti infetti, rispettivamente.

Abstract

Nematodi entomopatogeni (aka EPN) rappresentano un gruppo di nematodi del suolo abitare che parassitano una vasta gamma di insetti. Questi nematodi appartengono a due famiglie: Steinernematidae e Heterorhabditidae. Fino ad oggi, più di 70 specie sono state descritte nel Steinernematidae e ci sono circa 20 specie in Heterorhabditidae. I nematodi hanno una collaborazione mutualistica con i batteri Enterobacteriaceae e insieme agiscono come un complesso potente insetticida che uccide una vasta gamma di specie di insetti.

Qui, ci concentriamo sulle tecniche più comuni considerati per la raccolta EPN dal suolo. La seconda parte di questa presentazione si concentra sulla tecnica insetti adescamento, un approccio ampiamente utilizzato per l'isolamento di EPN dai campioni di suolo, e la tecnica trappola bianco modificato che viene utilizzato per il recupero di questi nematodi da insetti infetti. Questi metodi e le tecniche sono passaggi fondamentali per la creazione di successo di culto EPNUres in laboratorio e anche la base per altri testi biologici che considerano questi nematodi come organismi modello per la ricerca in altre discipline biologiche. Le tecniche mostrate in questa presentazione corrispondono a quelle eseguite e / o creazione di membri della SP Archivio laboratorio così come quelli descritti da vari autori.

Introduzione

Molti nematodi sono associati con gli insetti, e le loro interazioni ospite variano da vantaggioso per dannosa. Qui, ci concentriamo su un gruppo di nematodi che sono patogeni di insetti, noto anche come nematodi entomopatogeni (o EPN). Due famiglie di nematodi appartengono a questo gruppo di nematodi: Steinernematidae e Heterorhabditidae ^11,13. Il loro effetto patogeno è infatti conferita dalla loro interazione con anaerobi facoltativi batteri enterici (batteri Xenorhabdus associano con steinernematids e batteri Photorhabdus associare a heterorhabditids) ^2. I batteri sono vectored da un host ad un altro insetto da parte l'unica tappa libero nematode vita, il giovane infettivo terzo stadio (noto anche come dauer giovanile, giovanile infettiva o IJ), che vive nel terreno. Una volta dentro l'insetto, i nematodi rilasciano i batteri nella emolinfa dell'insetto, che uccidono l'insetto ospite da una massiccia setticemia. I batteri anchedegradare i tessuti dell'insetto e diventano fonte di cibo dei nematodi ', consentendo loro di maturare e moltiplicarsi. Di solito, una o due generazioni di nematodi adulti sono prodotte all'interno del cadavere insetto. La progenie degli ultimi riassocia generazione adulta con poche cellule batteriche in più specializzarsi modo che il loro precedente rapporto nutrizionale, e coltivare queste cellule nei loro intestini mentre si muovono fuori dalla carcassa insetti nel terreno dove potranno attendere un altro insetto di parassitare ^6,11,14 (Figura 1).

Sin dalla loro scoperta nel 1927, EPN sono stati considerati importanti alternative ai pesticidi chimici in quanto possono parassitare una vasta gamma di insetti che sono parassiti agricoli ^3,4,5. Tuttavia, negli ultimi due decenni, questi nematodi e dei loro batteri simbionti sono stati riconosciuti come sistema modello malleabile per studiare aspetti biologici, ecologici ed evolutivi di ospite-microbo interactions ^14.

L'obiettivo di questa presentazione è quello di mostrare i metodi e le tecniche più comunemente utilizzate per il campionamento del suolo e l'isolamento di EPN. Una varietà di strumenti è disponibile e può essere utilizzato per raccogliere campioni di terreno, tra cui: defittonatrici suolo, cazzuole, trivelle, trivelle, tubi di campionamento, pale a mano, tra gli altri (Figura 2).

A seconda dello scopo dello studio, due strategie di campionamento possono essere considerati: a) stratificato, b) campionamento casuale (Figura 3). Il campionamento stratificato è solitamente utilizzato come parte di uno studio intensivo in una zona specifica o demarked in un determinato periodo di tempo. In generale, un transetto è demarked e campioni di suolo sono presi a intervalli stabiliti nel transetto per un periodo di tempo (Figura 3A) ^15. Il campionamento casuale viene generalmente impiegato quando concentrandosi su una vasta area. Questa strategia di campionamento è stato utilizzato per studiare la diversità di EPN fROM una vasta area geografica o regione (Figura 3B) ^12. Una serie di fattori può essere considerato in funzione del focus dello studio tra cui una vasta gamma di altezze, texture del suolo e degli habitat (ad es., Campi coltivati, boschi, pascoli, parchi, spiagge, aree ripariali, ecc.)

Mostriamo la tecnica dell'insetto adescamento, che è stato originariamente descritto da biancheria da letto e Akhurst ¹ e rappresenta un semplice e selettivo alternativa per il recupero EPN da campioni di suolo. Questa è una procedura selettiva che si basa sul presupposto che i nematodi (fase IJ) saranno attratti a un host insetto e parassitano esso. Questa tecnica può anche essere considerato per l'isolamento di altri patogeni insetti quali funghi e batteri ^8,10.

Abbiamo anche dimostrare la tecnica trappola bianco modificato, che viene utilizzato per il recupero nematode progenie di insetti infetti padroni di casa ^7,14. Si tratta di un sforzo incontratohod che offre il vantaggio di recuperare un 'clean' nematode progenie priva di detriti dai cadaveri di insetti degradanti.

Infine, le tecniche descritte ed illustrate in questo articolo corrispondono a quelli concepiti e / o eseguite nel nostro laboratorio così come quelli descritti da vari colleghi e collaboratori.

Protocollo

1. Soil Sample Collection

1. Si consideri che copre una superficie minima di 2-4 m ² per ogni sito di campionamento.
2. Raccogliere campioni di terreno a una profondità di almeno 15 cm (Figura 4).
3. Prendere almeno 5 campioni casuali all'interno di questa area.
4. Prendere 3 sottocampioni per campione. Seconda dell'obiettivo dello studio, sia combinare sottocampioni o mantenerli separati.
5. Collocare ogni campione in un sacchetto di plastica. Considerare doppio insaccamento per evitare perdite di campioni (Figura 4).
6. Campioni etichetta con un pennarello indelebile. Includere le seguenti informazioni da ogni sito di campionamento: Informazioni sul sito (compresi località / zona / nome e GPS informazioni coordinare posto), la data, l'habitat, la vegetazione associata, temperatura, altitudine, ecc
   NOTA: Se necessario, raccogliere e / o registrare la presenza di insetti o altri invertebrati raccolti con il campione per la successiva identificazione. Essi possono rappresentare potenziali naturpadroni di casa al EPN.
7. Strumenti di raccolta Pulire accuratamente tra i campioni di lavaggio con acqua e / o disinfezione con il 70% di etanolo o soluzione di candeggina allo 0,5%.
8. I campioni in un dispositivo di raffreddamento (8 - 15 ° C) durante il trasporto al laboratorio.
9. Prendete una porzione del campione di suolo per l'analisi per ottenere informazioni sulla composizione del suolo, tessitura, umidità, conducibilità elettrica o di altri parametri pedologici desiderati.

. 2 Isolamento Nematode da campioni di suolo: Tecnica Insect-baiting

1. Rimuovere eventuali detriti (per esempio., Pietre, pezzi di legno o di corteccia, foglie, ecc.) Raccolti con i vostri campioni per evitare la contaminazione con microrganismi saprobico.
2. Aggiungere acqua per inumidire il terreno e agevolare la circolazione dei nematodi.
   NOTA: Utilizzare un flacone spray per aumentare lentamente il livello di umidità del suolo.
3. Posizionare circa 200 a 250 ml di terreno umido in un contenitore di plastica pulito con un coperchio.
4. Aggiungi esche insetti. Considerare 5 a 10 insetti alla superficie del suolo di ciascun campione (Figura 5).
5. Coprire il contenitore con un coperchio e girare contenitori a testa in giù.
6. Mantenere contenitori in un luogo buio a RT (solito, la 22 - 25 ° C).
7. Controllare contenitori ogni 2-3 giorni, e rimuovere gli insetti morti.
   NOTA: aggiungere altri insetti sani per ogni contenitore per un ulteriore adescamento del campione di terreno.
8. Rimuovere gli insetti morti dai contenitori. NOTA: Cadavers con un marrone o ocra colorazione di solito sono parassitati da steinernematids, mentre il rosso di cadaveri viola scuro mattoni sono parassitato da heterorhabditids.
9. Sciacquare cadaveri in acqua sterile.
10. Mettere cadaveri in una trappola bianco modificato per il recupero del nematode progenie (vedi procedura riportata di seguito).

3. Nematode Recovery da cadaveri infetti: Modificato Trappola bianca

1. Posizionare la parte superiore di un diametro di 50 (o 60) mm. Capsula Petri all'interno di una parabola più grande (100 mm).
2. Impostare un peccatocarta da filtro circolare gle (Whatman # 1) all'interno del piatto più piccolo.
3. Posizionare cadaveri sulla carta da filtro del piatto più piccolo assicurandosi cadaveri non si toccano a vicenda per evitare qualsiasi contaminazione.
4. Riempire l'esterno (grande) Scatola di Petri con ca. 20 ml di acqua distillata sterile. Non aggiungere acqua nel piatto che contiene i cadaveri.
5. Coprire il grande piatto Petri e il suo contenuto con il coperchio (Figura 6).
6. Etichettare i piatti di conseguenza. Aggiungere le seguenti informazioni: nome Nematode (specie / isolato), la data di infezione (infezione data è stata fissata) e quella trappola (questa è la data della trappola è impostato).
7. Tenere trappola a RT finché non si verifica emergere di stadi giovanili infettive (IJ). Questo processo può richiedere tra i 10 - 25 giorni a seconda delle specie e / o varietà considerata nematodi.
8. Acqua raccolta con IJs rimuovendo il più grande piatto della trappola e versando acqua con nematodi in un bicchiere.
9. Consentire nematodi decantare sul fondo della bEaker. Questo processo può richiedere alcuni minuti.
10. Versare acqua accuratamente, assicurandosi nematodi rimangono nel fondo del bicchiere.
11. Risciacquare nematodi con l'aggiunta di più acqua e permettendo nematodi a decantare. Questa fase può essere ripetuta 2 - 3 volte finché l'acqua è pulita.
12. Posizionare sospensione nematode in un pallone di coltura tissutale (250 ml). Mantenere la concentrazione della sospensione di 1.000 - 3.000 nematodi / ml.
13. Boccetta Store con sospensione nematode in una stanza fredda o in incubatrice tra i 10 - 20 ° C.
    NOTA: controllare boccette memorizzati periodicamente durata di EPN è variabile. Di solito steinernematids possono essere conservati per 6-12 mesi senza il bisogno di subcoltura, che heterorhabditids possono richiedere più controlli periodici.

Risultati

Soil Sample Collection

Terza fase larve infettive di EPN sono le uniche fasi di vita liberi nel ciclo di vita di questi nematodi ', che risiedono nel terreno (Figura 1). Pertanto, la raccolta di campioni di suolo è un metodo molto efficace per il recupero di questi nematodi. Figura 4 mostra un profilo del terreno che indica la profondità alla quale devono essere prelevati campioni. Preservare l'umidità di un campione è un fattore chiave per la so...

Discussione

Questa manifestazione è la prima delle due presentazioni che descrivono una serie di tecniche che sono comunemente usati per lo studio EPN e dei loro batteri simbionti. Queste tecniche rappresentano passaggi fondamentali per la creazione di successo delle culture EPN in laboratorio e costituiscono anche la base per altri biotest che impiegano EPN come organismi modello per la ricerca.

Vari sondaggi del terreno di EPN hanno dimostrato che la loro abbondanza e la distribuzione può variare tr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	for insect baiting technique
Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose	Whatman/VWR	28450-048	infection chamber and White trap assembly
60 x 15 mm Petri Dishes	VWR	25384-092	infection chamber and White trap assembly
100 x 15 Petri Dishes	VWR	25384-088	infection chamber and White trap assembly
ZIPloc Plastic Bags	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Mechanical Pipettor P1000, P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	infection chamber and White trap assembly
pippetor tips 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	infection chamber and White trap assembly
Bleach	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
Sodium Hypochlorite	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
70% Ethyl alochol	AAPER	17212945	soil sampling , desisnfecting
Shovels	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Tubular soil sampler	Accuproducts	N/A	soil sampling
Soil Probe, long handle	Nupla	PRB4T 69401 Classic	soil sampling
Measuring tape	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Flagging tape, various colors	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
tissue culture flasks	VWR	Falcon, 29185-304	White trap, collection of EPN
wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth	VWR	16650-107	White trap, collection of EPN