الفئران اللفائفي القولوني استئصال الأمعاء مع التحام الابتدائي

Summary

Ileocolic resection is commonly performed in several human diseases; however, little is known regarding the impact of intestinal resection on surgical illnesses. This article provides instruction on executing the procedure in mice with high success, providing a means to study the effects of ileocolic resection in models of disease.

Abstract

Intestinal resections are frequently required for treatment of diseases involving the gastrointestinal tract, with Crohn’s disease and colon cancer being two common examples. Despite the frequency of these procedures, a significant knowledge gap remains in describing the inherent effects of intestinal resection on host physiology and disease pathophysiology. This article provides detailed instructions for an ileocolic resection with primary end-to-end anastomosis in mice, as well as essential aspects of peri-operative care to maximize post-operative success. When followed closely, this procedure yields a 95% long-term survival rate, no failure to thrive, and minimizes post-operative complications of bowel obstruction and anastomotic leak. The technical challenges of performing the procedure in mice are a barrier to its wide spread use in research. The skills described in this article can be acquired without previous surgical experience. Once mastered, the murine ileocolic resection procedure will provide a reproducible tool for studying the effects of intestinal resection in models of human disease.

Introduction

Ileocolic resection (ICR) is a common procedure performed in both emergent and elective situations for a variety of illnesses. Crohn’s disease and colon cancers are the two most common indications for ICR. In both illnesses, recurrence in the bowel at the site of surgery represents a major clinical problem. Local recurrence rates for colon cancer remain an issue even with the most aggressive resections¹. Following ICR in Crohn’s disease, the disease most frequently (in up to 80%) recurs in the neo-terminal ileum at 1 year after surgery². Given the impact of these two illnesses and their recurrence after surgery, it is important to understand local intestinal factors after ICR, which may have intrinsic influences on the natural history of these diseases. Further, it is also important to consider anastomotic healing after ICR. In the early post-operative period, anastomotic leaks can have devastating consequences for patients resulting in repeat surgeries, stoma creations, significant morbidity, and even mortality³. Despite the importance of this topic, our current understanding of anastomotic healing remains in its infancy as a subject of research. Animal models of ICR, in particular mice, are an excellent platform for studying the intestinal and anastomotic healing following surgery.

A mouse model of ICR was initially developed by Helmrath et al. to be used as a model of short gut syndrome⁴. The authors experimented with various diet regiments and suture sizes to optimize animal survival following ICR. They concluded that feeding with liquid diet in the perioperative period and using 9-0 monofilament sutures resulted in an optimal post-operative survival of 88%. Since this initial publication, ICR in mice removing 50% of the small bowel has been used in several studies to explore the dynamics of massive small bowel resection and the adaptive growth response in attempt to develop new therapies for short gut syndrome^5,6.

The first application of the ICR mouse model to Crohn’s disease used the IL-10^-/- mouse model, which spontaneously develops colitis⁷. The authors found that after ICR these animals developed inflammation in the neo-terminal ileum similar to that seen in post-operative Crohn’s disease patients, and that this inflammation was dependent on the presence of bacteria⁷. More recently, this model was used to explore bacterial changes induced by ICR. In Crohn’s disease there is an associated dysbiosis with relative decreases in bacteria known to have anti-inflammatory properties and increases in invasive species of bacteria^8,9. The association holds true in cases of post-operative recurrence¹⁰. Two studies sought to identify microbial changes resulting from ICR. The first used IL-10 null mice, and performed denaturing gel electrophoresis to compare bacterial similarity between the small bowel and colon after ICR¹¹. This study demonstrated that bacterial populations became similar in the small intestine and colon following ICR. A subsequent study used wild type mice and 16s pyrosequencing for phylogenetic classification of bacterial species post-operatively. This study demonstrated a marked shift in bacterial species resulting from surgery alone with Clostridium species becoming dominant as well as an increase in ϒ-proteobacteria. The results also confirmed the findings of the previous study with similar populations found in the small bowel and colon after ICR¹².

ICR is a common procedure for patients with colon cancer involving the cecum and ascending colon, and it is becoming increasingly recognized that the host-response to surgery likely contributes to both local and distant tumor recurrence¹³. Despite this observation, models of ICR have not been utilized for the study of colorectal cancer and post-operative recurrence. Understanding both the systemic and local immunologic changes resulting from ICR will be important in investigating future therapies. Potential pathways involved in cancer recurrence post ICR include up regulation of growth factors, which may rescue cells from apoptosis and stimulate proliferation, mechanical tumor disruption with cell shedding, and loss of immune surveillance through post-operative immunosuppression^13,14.

Mouse models of ICR have the potential to be a powerful tool for the investigation of short bowel syndrome, Crohn’s disease, and colon cancer. They may also provide lessons on how to prevent early post-operative anastomotic complications by further defining the cellular and biochemical pathways involved in healing the newly constructed anastomosis. A major barrier in utilizing the murine ICR model is the technical difficulty. The intestinal anastomosis requires the use of 8-0 or 9-0 suture, an operating microscope, and training in microsurgical techniques. The goal of this article is to provide clear instructions on how to perform ICR in mice with the goal of utilizing this procedure in models of disease.

Protocol

وتمت الموافقة على البروتوكولات استخدام الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام العلوم الصحية في جامعة ألبرتا.

1. إعداد الآلات، الحيوانات والإعداد المنطوق

1. نقل الحيوانات إلى جديد، نظيف غائبة قفص من جميع المواد الغذائية الصلبة 24 ساعة قبل الإجراء. قد تكون لديهم حرية الوصول إلى المياه، والنظام الغذائي السائل ليب الإعلانية حتى وقت الإجراء.
2. الأوتوكلاف جميع الأدوات اللازمة لإجراء العملية. تنظيف سطح التشغيل ومخروط الأنف مخدر مع الايثانول 70٪.
3. إعداد سطح التشغيل مع مجهر التشغيل، آلة التخدير واللوازم بطريقة غير مريحة للجراح التشغيل. وينبغي أن يسمح المرفقين الجراح للراحة مريح على طاولة العمليات، مع اليدين والذراعين دون عائق من قبل الأجهزة. يجب وضع الصكوك، والخيوط الجراحية، ومسحات القطن، وحقنة 10 مل في موقع يسمح بسهولة أثناء العملية.
4. نصبمصابيح الحرارة العلوية لتوفير الدفء سواء للحيوان أثناء الإجراء والضوء لسطح التشغيل.
5. ملء أنبوب مخروطي 50 مل مع 0.9٪ محلول ملحي، وأنبوب 1.5 مل مع الفازلين ومكان بالقرب من سطح التشغيل.
   ملاحظة: تعقيم جميع الأدوات الجراحية. لأنه مقطوع الأمعاء، الإجراء في حد ذاته ليس العقيمة. يعتبر نظيفة الملوثة. اتخاذ التدابير اللازمة لتجنب إدخال مصادر خارجية للعدوى.

2. استئصال اللفائفي القولوني مع التحام

1. تحريض التخدير عن طريق إعطاء 4٪ الأيزوفلورين مع معدل تدفق الأوكسجين من 2 لتر / دقيقة عن طريق مخروط الأنف من المرذاذ الأيزوفلورين حتى يبطئ الحيوانات معدل التنفس إلى ما يقرب من 30-40 الأنفاس / دقيقة. ممارسة الضغط المعتدل في القدم الخلفية من الماوس لضمان عدم وجود استجابة الألم قبل البدء في الإجراء. عند هذه النقطة، رفض الأيزوفلورين إلى 2٪، وتدفق الأكسجين إلى 0.5 لتر / دقيقة. بشكل متقطعتحقق استجابة الألم أثناء العملية وضبط معدل تدفق الأيزوفلورين وفقا لذلك.
2. تطبيق الفازلين على العينين لمنع جفاف أثناء الجراحة، ولشل حركة الماوس في موقف ضعيف مع أطرافه المضمون باستخدام الشريط الشفاف.
3. تنظيف البطن بمحلول povodine / اليود، وتغيير في قفازات معقمة جديدة.
4. جعل شق الجلد 1.5 سم في خط الوسط العلوي من البطن باستخدام مقص تشريح نقطة حادة لفضح اللفافة والغشاء البريتوني. فتح طبقة فافي / البريتوني بطريقة مماثلة خلال ألبا الخط لكشف محتويات البريتوني.
5. وعلى النقيض من البشر، وعادة ما وجد الأعور الماوس في الربع العلوي الأيسر من البطن. وبمجرد تحديدها، فهم بلطف الأعور مع ملقط وتسليمها من خلال شق. استخدام قطعة قطن مبللة لمروحة من حوالي 3 سم من محطة الدقاق تمتد من الأعور على شاش معقم رايات على السطح البطني (الشكل 1A).ضمان أن يظل الأمعاء تتعرض رطبة مع 0.9٪ المالحة خلال مجمل العملية.
6. تحديد الشريان اللفائفية المتفرعة من الشريان المساريقي العلوي على طول القولون (الشكل 1A) باستخدام مجهر التشغيل. تشريح الأنسجة من اوعائي المجاورة للشريان اللفائفية، وتطويق الشريان ligate بالتعادل 5-0 الحرير. المقبل، وتحديد وصول الدم الإقليمي لمحطة الدقاق واختيار نقطة transection 1.5-2 سم الأقرب إلى تقاطع اللفائفية. Ligate فروع هذا القسم من الدقاق على النحو الوارد أعلاه. تقسم الشرايين الصغيرة مع مقص تشريح.
7. تقسيم الأجزاء الدماغية من اللفائفي والقولون ضمان عدم وصول الدم الكافي للانتهاء مقطوع (الشكل 1B). غالبا ما يكون من المفيد أن يستلوق؛ يمزج بالملوق الدقاق بتقسيمه بزاوية 30 درجة لزيادة قطر التجويف بحيث يتوافق بشكل وثيق القولون. مرة واحدة تمت إزالة جزء من الأمعاء اللفائفية، محاذاةيتم محاذاة نهايات مقطوع من اللفائفي والقولون على الشاش، وضمان حدود كل المساريقي.
8. بناء مفاغرة عن طريق تقريب نهاية مقطوع من الدقاق إلى نهاية مقطوع من القولون باستخدام توقف 8-0 خيوط البولي بروبلين (الشكل 1C). يتم وضع غرزة الأول على الحدود المساريقي، مع الغرز اللاحقة وضعت كل 0.5 مم حتى مفاغرة اللفائفي القولوني هو ماء. عند تمرير إبرة خياطة من خلال الدقاق والقولون، تأكد من أن قطع الحافة لا تدحرجت، ولدغ إبرة هم 0.5 ملم من قطع حواف الأمعاء. وهناك مفاغرة نموذجية يتطلب 14 إلى 16 الغرز توقف. اختبار سلامة والمباح من مفاغرة عند الانتهاء من قبل المتداول الداني إلى القاصي مسحة القطن على الدقاق لإجبار محتويات من خلال مفاغرة. يجب أن محتويات الأمعاء الصغيرة تمر بحرية في القولون دون تسرب توصيلي.
9. شطف الأمعاء يتعرض مع 3-4 مل من المياه المالحة 0.9٪ من حقنة 10 ملليغسل البراز من سطح الأمعاء، وتقديم الأمعاء مرة أخرى في التجويف البريتوني. باستخدام 2 مل من 0.9٪ المالحة مسح التجويف البريتوني، ومن ثم استنزاف هذا السائل من خلال تطبيق ضغط لطيف على جدار البطن أفقيا.
10. إغلاق شق مع 3-0 خياطة الحرير التوالي، ووقف تدفق الأيزوفلورين. إدارة 0.1 ملغ / كغ من الأفيون طويل المفعول -buprenorphine- تحت الجلد للسيطرة على الألم بعد العمليات الجراحية.
11. مراقبة الحيوانات تحت مصباح الحرارة حتى أنهم المحمول ثم نقلها إلى قفص تحسنت باستمرار.

العناية والمراقبة 3. مرحلة ما بعد المنطوق

1. مراقبة الحيوانات في قفص تحسنت باستمرار بحثا عن علامات الضيق للفترة المتبقية من اليوم. نقل الحيوانات إلى مرفق رعاية الحيوان في قفص معقم جديد مع الوصول إلى النظام الغذائي السائل وعفوي المياه. ويمكن إيواء الحيوانات في مجموعات من 3-4.
2. إجراء فحص على الحيوانات بعد العملية في صباح اليوم التالي،ضمان لا تظهر حيوانات في محنة. تغذية حمية سائلة الوحيد. إذا كانت تبدو غير مريحة (أي الموقف منحنية أو الحد الأدنى من النشاط) إدارة جرعة إضافية من البوبرينورفين تحت الجلد. اطمئنان على الحيوانات مرة أخرى في فترة ما بعد الظهر في يوم 1 بعد العمليات الجراحية.
3. في صباح يوم 2 بعد العملية يجب أن تظهر الحيوانات تعافى تماما. الأدلة على استهلاك الأغذية وstooling دلائل إيجابية على الانتعاش. الآن، واستئناف اتباع نظام غذائي طعام صلبة للحيوانات.
   ملاحظة: تشمل علامات الضائقة الموقف منحنية، قلة النظافة، والحد الأدنى من النشاط. إذا علامات الضائقة بارزة يجب أن يتم التخلص من الحيوانات.
4. الموت ببطء الحيوانات عن طريق إحداث التخدير العميق مع 4٪ الأيزوفلورين بمعدل تدفق O ₂ من 2 لتر / دقيقة حتى الحيوانات لا تستجيب لضغط القدم. أداء خلع عنق الرحم، ومراعاة لعلامات euthanization السليم.
5. المبادئ التوجيهية تختلف، لذلك الرجوع إلى توصيات المؤسسات بشأن مؤشراتلوالأساليب المناسبة لeuthanization في الفئران.

النتائج

معدلات الوفيات وتغير الوزن بعد العملية.
معدلات وفيات التالية النواب في 129S1 الفئران النوع البري عموما ~ 5٪. السبب الأكثر شيوعا للأخلاق هو انسداد الأمعاء في مفاغرة. وتشمل الأسباب الأخرى للوفيات تسرب تفاغري وفتق داخلي مما يؤدي إلى انسداد الأمعاء.

Discussion

وICR الفئران هو نموذج القوية التي يمكن أن تستخدم لدراسة آثار عملية جراحية في أمراض الأمعاء. توضح هذه المقالة طريقة لأداء مجلس النواب في الفئران مع نسبة نجاح 95٪ وأي مشاكل مع فشل النمو كما يتجلى في أوزان ثابتة تصل إلى 28 يوما بعد العملية. وتشمل أهم التحديات لنجاح ICR تجنب ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LD101 liquid rodent diet	testdiet.com
0.9% NaCl	Baxter	FKE1324	Injection quality saline
Operating Microscope	Ziess
Isoflurane Anesthetic Vaporizer	Harvard Apparatus	34-0483
Isoflurane	Abbott	05260-05
Glass plate			For operating surface
Cotton swabs
Micro Castroviejo Needle holder, curved	World Precision Instruments	503377
Castroviejo straight scissors	World Precision Instruments	555530S
Dissecting Scissors	World Precision Instruments	15922
Dressing Forceps x 2	World Precision Instruments	500363
5-0 silk pre-cut sutures	Ethicon	A182H	For vessel ligation
8-0 Prolene on BV130-5 needle	Ethicon	8732H	For anastomosis
3-0 Silk on FS-2 needls	Ethicon	8665G	For abdominal wall closure
Petroleum Jelly	Vaseline
10 ml syringe	BD biosciences
Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub	betadine.com
Heat lamps
buprenorphine 0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	PL36699/0006