עכברי Ileocolic מעי כריתה עם השקה ראשונית

Summary

Ileocolic resection is commonly performed in several human diseases; however, little is known regarding the impact of intestinal resection on surgical illnesses. This article provides instruction on executing the procedure in mice with high success, providing a means to study the effects of ileocolic resection in models of disease.

Abstract

Intestinal resections are frequently required for treatment of diseases involving the gastrointestinal tract, with Crohn’s disease and colon cancer being two common examples. Despite the frequency of these procedures, a significant knowledge gap remains in describing the inherent effects of intestinal resection on host physiology and disease pathophysiology. This article provides detailed instructions for an ileocolic resection with primary end-to-end anastomosis in mice, as well as essential aspects of peri-operative care to maximize post-operative success. When followed closely, this procedure yields a 95% long-term survival rate, no failure to thrive, and minimizes post-operative complications of bowel obstruction and anastomotic leak. The technical challenges of performing the procedure in mice are a barrier to its wide spread use in research. The skills described in this article can be acquired without previous surgical experience. Once mastered, the murine ileocolic resection procedure will provide a reproducible tool for studying the effects of intestinal resection in models of human disease.

Introduction

Ileocolic resection (ICR) is a common procedure performed in both emergent and elective situations for a variety of illnesses. Crohn’s disease and colon cancers are the two most common indications for ICR. In both illnesses, recurrence in the bowel at the site of surgery represents a major clinical problem. Local recurrence rates for colon cancer remain an issue even with the most aggressive resections¹. Following ICR in Crohn’s disease, the disease most frequently (in up to 80%) recurs in the neo-terminal ileum at 1 year after surgery². Given the impact of these two illnesses and their recurrence after surgery, it is important to understand local intestinal factors after ICR, which may have intrinsic influences on the natural history of these diseases. Further, it is also important to consider anastomotic healing after ICR. In the early post-operative period, anastomotic leaks can have devastating consequences for patients resulting in repeat surgeries, stoma creations, significant morbidity, and even mortality³. Despite the importance of this topic, our current understanding of anastomotic healing remains in its infancy as a subject of research. Animal models of ICR, in particular mice, are an excellent platform for studying the intestinal and anastomotic healing following surgery.

A mouse model of ICR was initially developed by Helmrath et al. to be used as a model of short gut syndrome⁴. The authors experimented with various diet regiments and suture sizes to optimize animal survival following ICR. They concluded that feeding with liquid diet in the perioperative period and using 9-0 monofilament sutures resulted in an optimal post-operative survival of 88%. Since this initial publication, ICR in mice removing 50% of the small bowel has been used in several studies to explore the dynamics of massive small bowel resection and the adaptive growth response in attempt to develop new therapies for short gut syndrome^5,6.

The first application of the ICR mouse model to Crohn’s disease used the IL-10^-/- mouse model, which spontaneously develops colitis⁷. The authors found that after ICR these animals developed inflammation in the neo-terminal ileum similar to that seen in post-operative Crohn’s disease patients, and that this inflammation was dependent on the presence of bacteria⁷. More recently, this model was used to explore bacterial changes induced by ICR. In Crohn’s disease there is an associated dysbiosis with relative decreases in bacteria known to have anti-inflammatory properties and increases in invasive species of bacteria^8,9. The association holds true in cases of post-operative recurrence¹⁰. Two studies sought to identify microbial changes resulting from ICR. The first used IL-10 null mice, and performed denaturing gel electrophoresis to compare bacterial similarity between the small bowel and colon after ICR¹¹. This study demonstrated that bacterial populations became similar in the small intestine and colon following ICR. A subsequent study used wild type mice and 16s pyrosequencing for phylogenetic classification of bacterial species post-operatively. This study demonstrated a marked shift in bacterial species resulting from surgery alone with Clostridium species becoming dominant as well as an increase in ϒ-proteobacteria. The results also confirmed the findings of the previous study with similar populations found in the small bowel and colon after ICR¹².

ICR is a common procedure for patients with colon cancer involving the cecum and ascending colon, and it is becoming increasingly recognized that the host-response to surgery likely contributes to both local and distant tumor recurrence¹³. Despite this observation, models of ICR have not been utilized for the study of colorectal cancer and post-operative recurrence. Understanding both the systemic and local immunologic changes resulting from ICR will be important in investigating future therapies. Potential pathways involved in cancer recurrence post ICR include up regulation of growth factors, which may rescue cells from apoptosis and stimulate proliferation, mechanical tumor disruption with cell shedding, and loss of immune surveillance through post-operative immunosuppression^13,14.

Mouse models of ICR have the potential to be a powerful tool for the investigation of short bowel syndrome, Crohn’s disease, and colon cancer. They may also provide lessons on how to prevent early post-operative anastomotic complications by further defining the cellular and biochemical pathways involved in healing the newly constructed anastomosis. A major barrier in utilizing the murine ICR model is the technical difficulty. The intestinal anastomosis requires the use of 8-0 or 9-0 suture, an operating microscope, and training in microsurgical techniques. The goal of this article is to provide clear instructions on how to perform ICR in mice with the goal of utilizing this procedure in models of disease.

Protocol

פרוטוקולי שימוש בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה למדעי בריאות טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אלברטה.

1. הכנת מכשירים, בעלי חיים והגדרה אופרטיבית

1. העבר את החיות לנעדרו חדש, נקי כלוב של כל שעה המוצקה מזון 24 לפני ההליך. אולי יש להם גישה חופשית למים, וכופתות דיאטת נוזלים עד למועד ההליך.
2. החיטוי כל המכשירים דרושים להליך. משטח נקי הפעלה וחרטומו הרדמה עם 70% אתנול.
3. הגדר את משטח ההפעלה עם מיקרוסקופ, מכונה הרדמה וציוד באופן שנוח לי מנתח ההפעלה. מרפקיו של המנתח צריכים להיות מותר לנוח בנוחות על שולחן הניתוחים, עם ידיים והזרועות בלא הפרעה על ידי ציוד. מכשירים, תפרים, צמר גפן, ומזרק 10 מיליליטר צריכים להיות ממוקמים במיקום המאפשר גישה נוחה במהלך ההליך.
4. הגדר אתמנורות חימום מעליו כדי לספק חום לבעלי החיים במהלך ההליך והאור למשטח ההפעלה.
5. מלא שפופרת 50 מיליליטר חרוטי עם מי מלח 0.9%, וצינור 1.5 מיליליטר עם וזלין ומקום קרוב לפני השטח התפעולי.
   הערה: לעקר את כל המכשירים וציוד ניתוחי. בגלל המעי transected, ההליך עצמו הוא לא סטרילי. זה נחשב מזוהם נקי. לנקוט בצעדים כדי למנוע את כניסתה של מקורות אקסוגני של זיהום.

2. Ileocolic כריתה עם ההשקה

1. לגרום להרדמה על ידי מתן isoflurane 4% עם קצב זרימת חמצן של 2 ליטר / דקה באמצעות חרטומו מאידוי isoflurane עד קצב הנשימה בעלי החיים מאט לכ 30-40 נשימות / דקה. הפעל לחץ מתון לרגלו האחורית של העכבר כדי להבטיח שאין תגובת כאב לפני שתזם את ההליך. בשלב זה, לדחות את isoflurane עד 2% וזרימת חמצן 0.5 ליטר / דקה. לסירוגיןלבדוק את תגובת כאב במהלך ההליך ולהתאים קצב זרימת isoflurane בהתאם.
2. החל זלין על העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך ניתוח, ולשתק את העכבר במצב שכיבה עם גפיים מאובטחים באמצעות סרט שקוף.
3. לנקות את הבטן עם פתרון povodine / יוד, ולשנות לכפפות סטריליות חדשות.
4. לעשות חתך בעור 1.5 סנטימטרים בקו האמצע העליון של הבטן באמצעות נקודה חדה לנתח מספריים כדי לחשוף את fascia והצפק. פתח את שכבת fascial / הצפק באופן דומה באמצעות alba linea לחשוף את התוכן של הצפק.
5. בניגוד לבני אדם, cecum העכבר הוא נמצאה בדרך כלל ברבע העליון השמאלי של הבטן. ברגע שזיהה, בעדינות לתפוס את cecum עם מלקחיים ויעביר אותו דרך החתך. השתמש בצמר גפן טבולה להתפרש כ 3 סנטימטר של מעי מסוף המשתרע מcecum על גזה סטרילית שנפרשה על פני הבטן (איור 1 א).ודא המעי החשוף הוא כל הזמן לח עם מי מלח 0.9% במהלך המכלול של ההליך.
6. זהה את עורק ileocecal מתפצלים עורק mesenteric מעולה לאורך המעי הגס (איור 1 א) באמצעות מיקרוסקופ. לנתח את רקמות avascular הסמוכות לעורק ileocecal, להקיף ולקשור את העורק עם עניבת משי 5-0. בשלב הבא, לאתר את אספקת הדם האזורית למעי סופני ולבחור הפרוקסימלי סנטימטר 1.5-2 נקודת חיתוך רוחב לצומת ileocecal. ולקשור את הענפים לחלק זה של מעי כאמור לעיל. מחלקים את העורקים עם מיקרו לנתח מספריים.
7. מחלקים את מנות איסכמי של מעי ומעי גס הבטחה יש אספקת דם מספקת לקצות transected (איור 1). זה בדרך כלל מועיל למרית המעי על ידי חלוקתו בזווית של 30 מעלות כדי להגדיל את הקוטר של לומן כך שיתאים למעי גס באופן הדוק יותר. לאחר חלק ileocecal של מעי הוסר, ליישרקצות transected של מעי ובמעי גס בגזה, הבטחת גבולות mesenteric של כל מיושרים.
8. לבנות את ההשקה על ידי קירוב סוף transected של מעי עד סוף transected של מעי גס באמצעות נקטע 8-0 תפרי פוליפרופילן (איור 1 ג '). התפר הראשון ממוקם בגבול mesenteric, עם תפרים שלאחר מכן הוצבו למ"מ 0.5 עד ההשקה Ileocolic היא אטומה למים. כאשר עוברים את מחט התפר דרך המעי והמעי הגס, לוודא שהקצה לחתוך לא התגלגל, ועקיצות מחט 0.5 מ"מ מקצות החתך של המעי. השקה טיפוסית תדרוש 14-16 תפרים נקטעו. בדוק את השלמות וpatency של ההשקה עם השלמה על ידי גלגול הפרוקסימלי מקלון צמר גפן לדיסטלי על המעי לכפות תכנים באמצעות ההשקה. תוכן מעי דק צריך לעבור בחופשיות לתוך המעי הגס ללא דליפה בהשקה.
9. יש לשטוף את המעי החשוף עם 3-4 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% מהמזרק 10 מיליליטרכדי לשטוף את הצואה מפני שטח של המעי, ולספק מעי בחזרה לתוך חלל הצפק. באמצעות 2 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% לשטוף את חלל הצפק, ולאחר מכן ניקוז נוזל זה על ידי הפעלת לחץ עדין על דופן הבטן רוחבית.
10. סגירת החתך עם תפר ריצת 3-0 משי, ולהפסיק את זרימת isoflurane. נהל 0.1 מ"ג / קילוגרם של האופיום הארוך טווח -buprenorphine- תת-עורית לשליטה בכאב שלאחר ניתוח.
11. שים לב לבעלי החיים תחת מנורת החום עד שהם ניידים ולאחר מכן להעביר אותם לכלוב חימם ללא הרף.

טיפול וניטור 3. לאחר ניתוח

1. צג חיות בכלוב מחומם ללא הרף לסימני מצוקה לשארית היום. העבר את החיות בחזרה למתקן הטיפול בבעלי החיים בכלוב סטרילי חדש גישה לדיאטה נוזלית וכופתות מים. בעלי חיים עשויים להיות מאוחסנים בקבוצות של 3-4.
2. לבצע בדיקה על בעלי החיים שלאחר הניתוח למחרת בבוקר,להבטיח את בעלי החיים אינם מופיעים במצוקה. להאכיל את דיאטת נוזלים בלבד. אם הם מופיעים (, יציבה כלומר כפוף או פעילות מינימאלית) שלא בנוח לנהל מנה נוספת של עצירות תת עורי. בדוק על בעלי החיים פעם נוספים בשעתי אחר הצהריים ביום שלאחר ניתוח 1.
3. בבוקרו של יום שלאחר ניתוח 2 בעלי החיים אמורים להופיע התאוששו לחלוטין. עדות לצריכת מזון וstooling סימנים חיוביים של התאוששות. עכשיו, לחדש את דיאטת אוכל מוצקה לבעלי החיים.
   הערה: סימנים של מצוקה כוללים יציבה כפופה, הזנחה עצמית, ופעילות מינימאלית. אם סימני המצוקה בולטים צריכים להיות מורדמים בעלי החיים.
4. להרדים את בעלי החיים על ידי גרימת הרדמה עמוקה עם isoflurane 4% בקצב זרימת O ₂ של 2 ליטר / דקה עד בעלי חיים אינם מגיב ללחץ ברגל. בצע נקע בצוואר הרחם, ולבחון סימנים של euthanization הנכון.
5. הנחיות משתנות, כך מתייחסות להמלצות גופים המוסדיות בדבר אינדיקציותולשיטות של euthanization בעכברים.

תוצאות

שיעורי תמותה ושינוי במשקל לאחר ניתוח.
שיעורי תמותה לאחר ICR בעכברים מסוג בר 129S1 הם בדרך כלל ~ 5%. הסיבה השכיחה ביותר למוסר היא חסימת מעי בהשקה. סיבות נוספות של תמותה כוללות דליפה בהשקה ובקע פנימי המוביל למעי חסימה.

ירידה במשק?...

Discussion

ICR העכברי הוא מודל רב עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של ניתוח במחלות מעי. מאמר זה מתאר שיטה לביצוע ICR בעכברים עם שיעור הצלחה של 95% ואין בעיות עם כישלון בשגשוג כפי שמשתקף במשקל יציב עד 28 ימים לאחר הליך. האתגרים המשמעותיים ביותר לICR המוצלח כוללים הימנעות ממכשולי מע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LD101 liquid rodent diet	testdiet.com
0.9% NaCl	Baxter	FKE1324	Injection quality saline
Operating Microscope	Ziess
Isoflurane Anesthetic Vaporizer	Harvard Apparatus	34-0483
Isoflurane	Abbott	05260-05
Glass plate			For operating surface
Cotton swabs
Micro Castroviejo Needle holder, curved	World Precision Instruments	503377
Castroviejo straight scissors	World Precision Instruments	555530S
Dissecting Scissors	World Precision Instruments	15922
Dressing Forceps x 2	World Precision Instruments	500363
5-0 silk pre-cut sutures	Ethicon	A182H	For vessel ligation
8-0 Prolene on BV130-5 needle	Ethicon	8732H	For anastomosis
3-0 Silk on FS-2 needls	Ethicon	8665G	For abdominal wall closure
Petroleum Jelly	Vaseline
10 ml syringe	BD biosciences
Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub	betadine.com
Heat lamps
buprenorphine 0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	PL36699/0006