Murino ileocólica Resección intestinal con anastomosis primaria

Resumen

Ileocolic resection is commonly performed in several human diseases; however, little is known regarding the impact of intestinal resection on surgical illnesses. This article provides instruction on executing the procedure in mice with high success, providing a means to study the effects of ileocolic resection in models of disease.

Resumen

Intestinal resections are frequently required for treatment of diseases involving the gastrointestinal tract, with Crohn’s disease and colon cancer being two common examples. Despite the frequency of these procedures, a significant knowledge gap remains in describing the inherent effects of intestinal resection on host physiology and disease pathophysiology. This article provides detailed instructions for an ileocolic resection with primary end-to-end anastomosis in mice, as well as essential aspects of peri-operative care to maximize post-operative success. When followed closely, this procedure yields a 95% long-term survival rate, no failure to thrive, and minimizes post-operative complications of bowel obstruction and anastomotic leak. The technical challenges of performing the procedure in mice are a barrier to its wide spread use in research. The skills described in this article can be acquired without previous surgical experience. Once mastered, the murine ileocolic resection procedure will provide a reproducible tool for studying the effects of intestinal resection in models of human disease.

Introducción

Ileocolic resection (ICR) is a common procedure performed in both emergent and elective situations for a variety of illnesses. Crohn’s disease and colon cancers are the two most common indications for ICR. In both illnesses, recurrence in the bowel at the site of surgery represents a major clinical problem. Local recurrence rates for colon cancer remain an issue even with the most aggressive resections¹. Following ICR in Crohn’s disease, the disease most frequently (in up to 80%) recurs in the neo-terminal ileum at 1 year after surgery². Given the impact of these two illnesses and their recurrence after surgery, it is important to understand local intestinal factors after ICR, which may have intrinsic influences on the natural history of these diseases. Further, it is also important to consider anastomotic healing after ICR. In the early post-operative period, anastomotic leaks can have devastating consequences for patients resulting in repeat surgeries, stoma creations, significant morbidity, and even mortality³. Despite the importance of this topic, our current understanding of anastomotic healing remains in its infancy as a subject of research. Animal models of ICR, in particular mice, are an excellent platform for studying the intestinal and anastomotic healing following surgery.

A mouse model of ICR was initially developed by Helmrath et al. to be used as a model of short gut syndrome⁴. The authors experimented with various diet regiments and suture sizes to optimize animal survival following ICR. They concluded that feeding with liquid diet in the perioperative period and using 9-0 monofilament sutures resulted in an optimal post-operative survival of 88%. Since this initial publication, ICR in mice removing 50% of the small bowel has been used in several studies to explore the dynamics of massive small bowel resection and the adaptive growth response in attempt to develop new therapies for short gut syndrome^5,6.

The first application of the ICR mouse model to Crohn’s disease used the IL-10^-/- mouse model, which spontaneously develops colitis⁷. The authors found that after ICR these animals developed inflammation in the neo-terminal ileum similar to that seen in post-operative Crohn’s disease patients, and that this inflammation was dependent on the presence of bacteria⁷. More recently, this model was used to explore bacterial changes induced by ICR. In Crohn’s disease there is an associated dysbiosis with relative decreases in bacteria known to have anti-inflammatory properties and increases in invasive species of bacteria^8,9. The association holds true in cases of post-operative recurrence¹⁰. Two studies sought to identify microbial changes resulting from ICR. The first used IL-10 null mice, and performed denaturing gel electrophoresis to compare bacterial similarity between the small bowel and colon after ICR¹¹. This study demonstrated that bacterial populations became similar in the small intestine and colon following ICR. A subsequent study used wild type mice and 16s pyrosequencing for phylogenetic classification of bacterial species post-operatively. This study demonstrated a marked shift in bacterial species resulting from surgery alone with Clostridium species becoming dominant as well as an increase in ϒ-proteobacteria. The results also confirmed the findings of the previous study with similar populations found in the small bowel and colon after ICR¹².

ICR is a common procedure for patients with colon cancer involving the cecum and ascending colon, and it is becoming increasingly recognized that the host-response to surgery likely contributes to both local and distant tumor recurrence¹³. Despite this observation, models of ICR have not been utilized for the study of colorectal cancer and post-operative recurrence. Understanding both the systemic and local immunologic changes resulting from ICR will be important in investigating future therapies. Potential pathways involved in cancer recurrence post ICR include up regulation of growth factors, which may rescue cells from apoptosis and stimulate proliferation, mechanical tumor disruption with cell shedding, and loss of immune surveillance through post-operative immunosuppression^13,14.

Mouse models of ICR have the potential to be a powerful tool for the investigation of short bowel syndrome, Crohn’s disease, and colon cancer. They may also provide lessons on how to prevent early post-operative anastomotic complications by further defining the cellular and biochemical pathways involved in healing the newly constructed anastomosis. A major barrier in utilizing the murine ICR model is the technical difficulty. The intestinal anastomosis requires the use of 8-0 or 9-0 suture, an operating microscope, and training in microsurgical techniques. The goal of this article is to provide clear instructions on how to perform ICR in mice with the goal of utilizing this procedure in models of disease.

Protocolo

Protocolos de uso de los animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Ciencias de la Salud de la Universidad de Alberta.

1. Preparación de Instrumentos, Animales y Configuración Operativo

1. Transferencia de los animales a una nueva, ausente jaula limpia de todos los alimentos sólidos 24 h antes del procedimiento. Ellos pueden tener libre acceso al agua, y el líquido dieta ad libitum hasta el momento del procedimiento.
2. Autoclave todos los instrumentos necesarios para el procedimiento. Superficie de operación Limpie y cono de la nariz anestesia con etanol al 70%.
3. Configurar la superficie de funcionamiento con el microscopio operativo, máquina de anestesia y materiales de construcción de una manera que sea cómoda para el cirujano. Los codos del cirujano se debe permitir que descansar cómodamente en la mesa de operaciones, con las manos y los brazos sin obstáculos por equipos. Instrumentos, suturas, hisopos de algodón, y una jeringa de 10 ml se deben colocar en un lugar que permite un fácil acceso durante el procedimiento.
4. Prepararlámparas de calor de arriba para proporcionar tanto calor para el animal durante el procedimiento y de la luz para la superficie de funcionamiento.
5. Llenar un tubo cónico de 50 ml con 0.9% de solución salina, y un tubo de 1,5 ml con vaselina y el lugar cerca de la superficie de funcionamiento.
   NOTA: Esterilizar todos los instrumentos y suministros quirúrgicos. Debido a que el intestino se secciona, el procedimiento en sí no es estéril. Se considera limpia-contaminada. Tome medidas para evitar la introducción de fuentes exógenas de la infección.

2. La resección ileocólica con anastomosis

1. Inducir la anestesia mediante la administración de 4% de isoflurano con una tasa de flujo de oxígeno de 2 L / min a través de cono de la nariz desde el vaporizador de isoflurano hasta que la tasa respiratoria animales se desacelera a aproximadamente 30-40 respiraciones / min. Aplique una presión moderada a la pata trasera del ratón para asegurar que no haya respuesta de dolor antes de iniciar el procedimiento. En este punto, baje isoflurano al 2% y el flujo de oxígeno a 0,5 L / min. De forma intermitentecomprobar la respuesta al dolor durante el procedimiento y ajustar la velocidad de flujo de isoflurano en consecuencia.
2. Aplique vaselina en los ojos para evitar que se seque durante la cirugía, e inmovilizar el ratón en la posición supina con las extremidades garantizados utilizando cinta adhesiva transparente.
3. Limpie el abdomen con solución povodine / yodo, y el cambio en los nuevos guantes estériles.
4. Hacer una incisión en la piel de 1,5 cm en la línea media superior del abdomen utilizando punta afilada disección tijeras para exponer la fascia y el peritoneo. Abra la capa fascial / peritoneal de una manera similar a través de la línea alba para exponer los contenidos peritoneales.
5. En contraste con los seres humanos, el ciego ratón se encuentra típicamente en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Una vez identificado, agarre suavemente el ciego con fórceps y entregarlo a través de la incisión. Use hisopos de algodón humedecidos en abanico de aproximadamente 3 cm de íleon terminal que se extiende desde el ciego sobre una gasa estéril cubierto en la superficie abdominal (Figura 1A).Asegúrese de que el intestino expuesto se mantiene húmedo con 0,9% de solución salina durante la totalidad del procedimiento.
6. Identificar la arteria ileocecal ramificación de la arteria mesentérica superior lo largo del colon (Figura 1A) usando el microscopio operativo. Diseccionar los tejidos avasculares adyacentes a la arteria ileocecal, rodear y se liga la arteria con un lazo de seda 5-0. A continuación, localice el suministro de sangre regional para el íleon terminal y elegir un punto transección 1,5-2 cm proximal a la unión ileocecal. Ligar las ramas a esta sección de íleon como anteriormente. Divida las arterias con micro tijeras de disección.
7. Divida las porciones isquémicas del íleon y colon asegurándose de que hay suficiente suministro de sangre a los extremos seccionados (Figura 1B). A menudo es útil para espatuladas el íleon dividiéndolo en un ángulo de 30 grados para aumentar el diámetro de la luz por lo que es más compatible con el colon. Una vez que la porción ileocecal del intestino se ha eliminado, alinee elestán alineados extremos seccionados del íleon y colon en la gasa, asegurando las fronteras mesentéricas de cada uno.
8. Construir la anastomosis mediante la aproximación final seccionado de íleon hasta el final seccionado de colon usando interrumpido 8-0 suturas de polipropileno (Figura 1C). El primer punto se coloca en el borde mesentérico, con suturas posteriores colocan cada 0.5 mm hasta que la anastomosis ileocólica es hermético. Al pasar la aguja de sutura a través del íleon y colon, asegúrese de que el borde de corte no se enrolla, y picaduras de agujas son de 0,5 mm de los bordes cortados del intestino. Una anastomosis típica requerirá de 14 a 16 suturas interrumpidas. Prueba de la integridad y la permeabilidad de la anastomosis al finalizar haciendo rodar una proximal a distal hisopo de algodón sobre el íleon para forzar los contenidos a través de la anastomosis. El contenido del intestino pequeños deben pasar libremente hacia el colon sin dehiscencia de la anastomosis.
9. Enjuague el intestino expuesto con 3.4 ml de solución salina al 0,9% de la jeringa de 10 mlpara lavar las heces de la superficie del intestino, del intestino y entregar de nuevo en la cavidad peritoneal. El uso de 2 ml de solución salina al 0,9% a enjuagar la cavidad peritoneal, y luego drenar este líquido mediante la aplicación de presión suave en la pared abdominal lateral.
10. Cierre la incisión con una sutura continua de seda 3-0, y suspender el flujo de isoflurano. Administrar 0,1 mg / kg del opiáceo de acción prolongada -buprenorphine- por vía subcutánea para el control del dolor post-operatorio.
11. Observe los animales bajo la lámpara de calor hasta que son móviles a continuación, transferirlos a una jaula continuamente calentado.

3. Cuidado post-operatorio y Monitoreo

1. Observar a los animales en una jaula continuamente calentado para signos de sufrimiento para el resto del día. Transfiera los animales de vuelta al centro de cuidado de los animales en una nueva jaula estéril con el acceso a la dieta líquida y agua ad lib. Los animales pueden ser alojados en grupos de 3-4.
2. Lleve a cabo un control de los animales después de la operación a la mañana siguiente,aseguran que los animales no aparecen en la angustia. Alimente sólo dieta líquida. Si aparecen incómodo (es decir, postura encorvada o actividad mínima) administrar una dosis adicional de buprenorfina subcutánea. Compruebe en los animales una vez más por la tarde en el día después de la operación 1.
3. En la mañana del día después de la operación 2 los animales deben aparecer totalmente recuperado. Evidencia de consumo de alimentos y las deposiciones son signos positivos de recuperación. Ahora, reanudar una dieta de pienso sólido para los animales.
   NOTA: Los signos de angustia incluyen postura encorvada, la mala preparación, y la actividad mínima. Si los signos de angustia son prominentes los animales deben ser sacrificados.
4. La eutanasia a los animales mediante la inducción de la anestesia profunda con 4% de isoflurano a una tasa de flujo de O ₂ de 2 L / min hasta que los animales no responden a la presión del pie. Realizar dislocación cervical, y observar si hay signos de eutanasia adecuado.
5. Directrices varían, por lo que se refiere a las recomendaciones de las instituciones con respecto a las indicacionesy de métodos apropiados de eutanasia en ratones.

Resultados

Las tasas de mortalidad y el cambio de peso después de la operación.
Las tasas de mortalidad siguientes ICR en 129S1 ratones de tipo salvaje son generalmente ~ 5%. La causa más común de la moral es la obstrucción intestinal en la anastomosis. Otras causas de la mortalidad incluyen fuga anastomótica y hernia interna que conduce a la obstrucción intestinal.

La pérdida de peso se puede ver hasta 14 días después de la operación, pero generalmente no es significativa. L...

Discusión

El ICR murino es un modelo de gran alcance que se puede utilizar para estudiar los efectos de la cirugía en enfermedades intestinales. En este artículo se describe un método para realizar ICR en ratones con una tasa de éxito del 95% y no hay problemas con la falta de crecimiento que se refleja en los pesos estables hasta 28 días después del procedimiento. Los desafíos más importantes para el éxito de ICR incluyen evitar obstrucciones intestinales en la anastomosis y fugas anastomóticas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LD101 liquid rodent diet	testdiet.com
0.9% NaCl	Baxter	FKE1324	Injection quality saline
Operating Microscope	Ziess
Isoflurane Anesthetic Vaporizer	Harvard Apparatus	34-0483
Isoflurane	Abbott	05260-05
Glass plate			For operating surface
Cotton swabs
Micro Castroviejo Needle holder, curved	World Precision Instruments	503377
Castroviejo straight scissors	World Precision Instruments	555530S
Dissecting Scissors	World Precision Instruments	15922
Dressing Forceps x 2	World Precision Instruments	500363
5-0 silk pre-cut sutures	Ethicon	A182H	For vessel ligation
8-0 Prolene on BV130-5 needle	Ethicon	8732H	For anastomosis
3-0 Silk on FS-2 needls	Ethicon	8665G	For abdominal wall closure
Petroleum Jelly	Vaseline
10 ml syringe	BD biosciences
Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub	betadine.com
Heat lamps
buprenorphine 0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	PL36699/0006