Murin iléocoliques résection du côlon avec anastomose primaire

Résumé

Ileocolic resection is commonly performed in several human diseases; however, little is known regarding the impact of intestinal resection on surgical illnesses. This article provides instruction on executing the procedure in mice with high success, providing a means to study the effects of ileocolic resection in models of disease.

Résumé

Intestinal resections are frequently required for treatment of diseases involving the gastrointestinal tract, with Crohn’s disease and colon cancer being two common examples. Despite the frequency of these procedures, a significant knowledge gap remains in describing the inherent effects of intestinal resection on host physiology and disease pathophysiology. This article provides detailed instructions for an ileocolic resection with primary end-to-end anastomosis in mice, as well as essential aspects of peri-operative care to maximize post-operative success. When followed closely, this procedure yields a 95% long-term survival rate, no failure to thrive, and minimizes post-operative complications of bowel obstruction and anastomotic leak. The technical challenges of performing the procedure in mice are a barrier to its wide spread use in research. The skills described in this article can be acquired without previous surgical experience. Once mastered, the murine ileocolic resection procedure will provide a reproducible tool for studying the effects of intestinal resection in models of human disease.

Introduction

Ileocolic resection (ICR) is a common procedure performed in both emergent and elective situations for a variety of illnesses. Crohn’s disease and colon cancers are the two most common indications for ICR. In both illnesses, recurrence in the bowel at the site of surgery represents a major clinical problem. Local recurrence rates for colon cancer remain an issue even with the most aggressive resections¹. Following ICR in Crohn’s disease, the disease most frequently (in up to 80%) recurs in the neo-terminal ileum at 1 year after surgery². Given the impact of these two illnesses and their recurrence after surgery, it is important to understand local intestinal factors after ICR, which may have intrinsic influences on the natural history of these diseases. Further, it is also important to consider anastomotic healing after ICR. In the early post-operative period, anastomotic leaks can have devastating consequences for patients resulting in repeat surgeries, stoma creations, significant morbidity, and even mortality³. Despite the importance of this topic, our current understanding of anastomotic healing remains in its infancy as a subject of research. Animal models of ICR, in particular mice, are an excellent platform for studying the intestinal and anastomotic healing following surgery.

A mouse model of ICR was initially developed by Helmrath et al. to be used as a model of short gut syndrome⁴. The authors experimented with various diet regiments and suture sizes to optimize animal survival following ICR. They concluded that feeding with liquid diet in the perioperative period and using 9-0 monofilament sutures resulted in an optimal post-operative survival of 88%. Since this initial publication, ICR in mice removing 50% of the small bowel has been used in several studies to explore the dynamics of massive small bowel resection and the adaptive growth response in attempt to develop new therapies for short gut syndrome^5,6.

The first application of the ICR mouse model to Crohn’s disease used the IL-10^-/- mouse model, which spontaneously develops colitis⁷. The authors found that after ICR these animals developed inflammation in the neo-terminal ileum similar to that seen in post-operative Crohn’s disease patients, and that this inflammation was dependent on the presence of bacteria⁷. More recently, this model was used to explore bacterial changes induced by ICR. In Crohn’s disease there is an associated dysbiosis with relative decreases in bacteria known to have anti-inflammatory properties and increases in invasive species of bacteria^8,9. The association holds true in cases of post-operative recurrence¹⁰. Two studies sought to identify microbial changes resulting from ICR. The first used IL-10 null mice, and performed denaturing gel electrophoresis to compare bacterial similarity between the small bowel and colon after ICR¹¹. This study demonstrated that bacterial populations became similar in the small intestine and colon following ICR. A subsequent study used wild type mice and 16s pyrosequencing for phylogenetic classification of bacterial species post-operatively. This study demonstrated a marked shift in bacterial species resulting from surgery alone with Clostridium species becoming dominant as well as an increase in ϒ-proteobacteria. The results also confirmed the findings of the previous study with similar populations found in the small bowel and colon after ICR¹².

ICR is a common procedure for patients with colon cancer involving the cecum and ascending colon, and it is becoming increasingly recognized that the host-response to surgery likely contributes to both local and distant tumor recurrence¹³. Despite this observation, models of ICR have not been utilized for the study of colorectal cancer and post-operative recurrence. Understanding both the systemic and local immunologic changes resulting from ICR will be important in investigating future therapies. Potential pathways involved in cancer recurrence post ICR include up regulation of growth factors, which may rescue cells from apoptosis and stimulate proliferation, mechanical tumor disruption with cell shedding, and loss of immune surveillance through post-operative immunosuppression^13,14.

Mouse models of ICR have the potential to be a powerful tool for the investigation of short bowel syndrome, Crohn’s disease, and colon cancer. They may also provide lessons on how to prevent early post-operative anastomotic complications by further defining the cellular and biochemical pathways involved in healing the newly constructed anastomosis. A major barrier in utilizing the murine ICR model is the technical difficulty. The intestinal anastomosis requires the use of 8-0 or 9-0 suture, an operating microscope, and training in microsurgical techniques. The goal of this article is to provide clear instructions on how to perform ICR in mice with the goal of utilizing this procedure in models of disease.

Protocole

les protocoles d'utilisation des animaux ont été approuvés par le comité de soins et d'utilisation des animaux sciences de la santé à l'Université de l'Alberta.

1. Préparation des instruments, les animaux et configuration opérationnelle

1. Transférer les animaux à une nouvelle, propre absent de la cage de tout solide nourriture 24 heures avant l'intervention. Ils peuvent avoir accès gratuitement à l'eau, et le liquide alimentation ad lib jusqu'à ce que le temps de la procédure.
2. Autoclave tous les instruments nécessaires à la procédure. Surface de travail propre et anesthésique cône de nez avec 70% d'éthanol.
3. Mettre en place la surface d'exploitation avec microscope opératoire, appareil d'anesthésie et des produits d'une manière qui est confortable pour le chirurgien. Les coudes du chirurgien devraient être autorisés à se reposer confortablement sur la table d'opération, avec les mains et les bras dégagée par les équipements. Instruments, des sutures, des cotons-tiges, et une seringue de 10 ml doivent être placés dans une position qui permet un accès facile au cours de la procédure.
4. Installerlampes chauffantes puissent fournir à la fois la chaleur de l'animal durant la procédure et de la lumière pour la surface d'exploitation.
5. Remplir un tube conique de 50 ml avec une solution saline à 0,9%, et un tube de 1,5 ml avec de la vaseline et le lieu près de la surface de fonctionnement.
   REMARQUE: Stériliser tous les instruments et de fournitures chirurgicales. Parce que l'intestin est sectionné, la procédure elle-même ne sont pas stériles. Il est considéré comme propre-contaminée. Prendre des mesures pour éviter l'introduction de sources exogènes de l'infection.

2. iléocoliques résection avec anastomose

1. Induire une anesthésie par administration de 4% d'isoflurane avec un débit d'oxygène de 2 L / min par l'intermédiaire de la coiffe jusqu'à ce que le vaporisateur isoflurane fréquence respiratoire des animaux ralentit à environ 30 à 40 respirations / min. Appliquer une pression modérée sur le pied arrière de la souris pour assurer qu'il n'y a pas de réponse à la douleur avant de lancer la procédure. À ce stade, baissez isoflurane à 2% et le flux d'oxygène à 0,5 L / min. Intermittentevérifier la réponse de la douleur au cours de la procédure et régler le débit de l'isoflurane en conséquence.
2. Appliquez de la vaseline pour les yeux pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie, et immobiliser la souris dans la position couchée sur le dos avec les membres sécurisées à l'aide du ruban adhésif transparent.
3. Nettoyez l'abdomen avec une solution povodine / d'iode, et se transformer en nouveaux gants stériles.
4. Faire un 1,5 cm incision de la peau sur la ligne médiane supérieure de l'abdomen à l'aide de ciseaux pointu dissection pour exposer le fascia et du péritoine. Ouvrez la couche aponévrotique / péritonéale de la même façon à travers la ligne blanche pour exposer le contenu du péritoine.
5. En revanche chez l'homme, le caecum de souris se trouve généralement dans le quadrant supérieur gauche de l'abdomen. Une fois identifié, saisir doucement le caecum avec une pince et de le livrer à travers l'incision. Utilisez des cotons-tiges humectés de ventilateur sur environ 3 cm de l'iléon terminal extension du caecum sur une gaze stérile drapée sur la surface abdominale (figure 1A).Assurez-vous de l'intestin exposé est maintenu humide avec 0,9% de solution saline pendant toute la durée de la procédure.
6. Identifier l'artère iléo-caecale bifurcation de l'artère mésentérique supérieure le long du côlon (Figure 1A) à l'aide du microscope opératoire. Disséquer les tissus adjacents avasculaire de l'artère iléo-colique, encercler et ligaturer l'artère avec une cravate de soie 5-0. Ensuite, localisez l'approvisionnement en sang régional de l'iléon terminal et choisir un point de sectionnement 1,5-2 cm en amont de la jonction iléo-colique. Ligaturer les branches de cette section de l'iléon comme ci-dessus. Diviser les artères avec micro dissection ciseaux.
7. Diviser les parties ischémiques de l'iléon et du colon assurer qu'il ya un apport sanguin adéquat aux extrémités sectionnées (figure 1B). Il est souvent utile à la spatule en divisant l'iléon à un angle de 30 degrés pour augmenter le diamètre de la lumière de sorte qu'elle corresponde plus étroitement le côlon. Une fois la partie iléo-colique intestinale a été supprimé, aligner leextrémités sectionnées de l'iléon et du colon sur la toile, assurant les frontières de chaque mésentériques sont alignés.
8. Construire l'anastomose en rapprochant l'extrémité sectionnée de l'iléon à l'extrémité sectionnée du côlon à l'aide interrompu 8-0 sutures en polypropylene (figure 1c). Le premier point est placé à la frontière mésentérique, avec des sutures ultérieures placés tous les 0,5 mm jusqu'à l'anastomose iléo-colique est étanche. Lors du passage de l'aiguille de suture à travers l'iléon et du côlon, de sorte que l'arête de coupe ne sont pas aplatis, et les piqûres d'aiguille sont de 0,5 mm à partir des bords de l'intestin de coupe. Une anastomose typique, il faudra 14 à 16 sutures interrompues. Testez l'intégrité et la perméabilité de l'anastomose à la fin en faisant rouler une proximale coton-tige à distal sur l'iléon de forcer contenu à travers l'anastomose. Contenu de l'intestin grêle devraient passer librement dans le côlon sans fuite anastomotique.
9. Rincer l'intestin exposé avec 3-4 ml d'une solution saline à 0,9% à partir de la seringue de 10 mlpour laver les selles de la surface de l'intestin, et fournir l'intestin dans la cavité péritonéale. En utilisant 2 ml de solution saline 0,9% rincer la cavité péritonéale, et puis les égoutter ce fluide en appliquant une légère pression à la paroi abdominale latérale.
10. Fermer l'incision avec une suture 3-0 fonctionnement de la soie, et interrompre le flux de l'isoflurane. Administrer 0,1 mg / kg de l'opiacé à action prolongée -buprenorphine- voie sous-cutanée pour le contrôle de la douleur post-opératoire.
11. Observer les animaux sous la lampe de chaleur jusqu'à ce qu'ils soient mobiles puis de les transférer dans une cage sans cesse réchauffé.

3. Soins post-opératoires et de surveillance

1. De surveiller les animaux dans une cage sans cesse réchauffé les signes de détresse pour le reste de la journée. Transférer les animaux vers le centre de protection des animaux dans une nouvelle cage stérile avec accès à l'alimentation liquide et de l'eau ad lib. Les animaux peuvent être hébergés en groupes de 3-4.
2. Effectuer un contrôle sur les animaux post-opératoires, le lendemain matin,assurer que les animaux ne semblent pas en détresse. Nourrir seul régime liquide. Si elles apparaissent mal à l'aise (ie, une posture voûtée ou activité minimale) administrer une dose supplémentaire de buprénorphine sous-cutanée. Arrivée sur les animaux une fois de plus dans l'après-midi le jour post-opératoire 1.
3. Le matin du jour post-opératoire 2, les animaux doivent apparaître complètement récupéré. Preuve de la consommation alimentaire et des selles sont des signes positifs de reprise. Maintenant, reprendre une alimentation chow solide pour les animaux.
   REMARQUE: Les signes de détresse comprennent une posture voûtée, toilettage pauvres, et une activité minimale. Si des signes de détresse sont au premier plan les animaux doivent être euthanasiés.
4. Euthanasier les animaux en induisant anesthésie profonde avec 4% d'isoflurane à un débit O ₂ de 2 L / min jusqu'à ce que les animaux ne réagissent pas à la pression du pied. Effectuer dislocation cervicale, et d'observer les signes de l'euthanasie approprié.
5. Lignes directrices varient, se réfèrent à des institutions recommandations concernant les indicationspour et des méthodes appropriées d'euthanasie chez les souris.

Résultats

Les taux de mortalité et le changement de poids post-op.
Les taux de mortalité suivants IC chez les souris de type sauvage 129S1 sont généralement ~ 5%. La cause la plus fréquente de la morale est une occlusion intestinale à l'anastomose. Les autres causes de mortalité incluent fuite anastomotique et hernie interne entraînant une occlusion intestinale.

La perte de poids peut être vu jusqu'à 14 jours après l'opération, mais est généralement non signif...

Discussion

La souris ICR est un modèle puissant qui peut être utilisé pour étudier les effets de la chirurgie dans les maladies de l'intestin. Cet article décrit un procédé de réalisation IC chez la souris avec un taux de réussite de 95% et pas de problèmes avec un retard de croissance, comme en témoigne poids stables jusqu'à 28 jours après l'intervention. Les défis les plus importants de la réussite ICR notamment d'éviter obstructions intestinales à l'anastomose et les fuites anastomotiques. <...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LD101 liquid rodent diet	testdiet.com
0.9% NaCl	Baxter	FKE1324	Injection quality saline
Operating Microscope	Ziess
Isoflurane Anesthetic Vaporizer	Harvard Apparatus	34-0483
Isoflurane	Abbott	05260-05
Glass plate			For operating surface
Cotton swabs
Micro Castroviejo Needle holder, curved	World Precision Instruments	503377
Castroviejo straight scissors	World Precision Instruments	555530S
Dissecting Scissors	World Precision Instruments	15922
Dressing Forceps x 2	World Precision Instruments	500363
5-0 silk pre-cut sutures	Ethicon	A182H	For vessel ligation
8-0 Prolene on BV130-5 needle	Ethicon	8732H	For anastomosis
3-0 Silk on FS-2 needls	Ethicon	8665G	For abdominal wall closure
Petroleum Jelly	Vaseline
10 ml syringe	BD biosciences
Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub	betadine.com
Heat lamps
buprenorphine 0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	PL36699/0006