التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Summary

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Abstract

استخدام في النظام النموذجي الزرد لدراسة التنمية والتجديد، والمرض يتوسع نحو استخدام قلوب الكبار لتفارق الخلية وتنقية RNA، DNA، والبروتينات. كل من هذه التطبيقات مطالبة الانتعاش السريع لأعداد كبيرة من قلوب الزرد لتجنب الجينات التنظيمية والتمثيل الغذائي، والتغيرات الأخرى التي تبدأ بعد الموت. كما يطلب قلوب الزرد الكبار لدراسة بنية القلب لمجموعة متنوعة من المسوخ وللدراسة تجديد القلب. ومع ذلك، فإن تشريح القلب الزرد التقليدي بطيء وصعب ويتطلب الأدوات المتخصصة، مما يجعل نطاق واسع تشريح قلوب الزرد الكبار مملة. الطرق التقليدية أيضا المرفأ من مخاطر الإضرار القلب أثناء تشريح. هنا، نحن تصف طريقة لتشريح قلوب الزرد الكبار التي هي سريعة، استنساخه، ويحافظ على بنية القلب. وعلاوة على ذلك، لا يتطلب هذا الأسلوب الأدوات المتخصصة، وغير مؤلم لالزرد،لا يمكن أن يؤديها على عينات جديدة أو ثابتة، ويمكن أن يؤديها على الزرد الشباب مثل شهر واحد من العمر. النهج وصف يوسع استخدام الزرد الكبار للأبحاث القلب والأوعية الدموية.

Introduction

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

Protocol

ملاحظة: تأكد دائما أن موافقة لجنة IACUC أو الأخلاق هي في مكان قبل البدء في أي إجراء التجارب باستخدام الزرد.

1. إعداد الكواشف والإعداد

1. إعداد الحلول التالية. العثور على وصفات لجميع هذه الحلول في كتيبات الزرد القياسية ^10.
   • 500 مل من البيض المياه
   • 200 مل من 0.03٪ تريكين في البيض المياه
   • 100 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
   • RBC الاحتياطي تحلل (اختياري)
   • عازلة الوجهة المفضلة (تثبيتي، Trizol، PBS، الخ) في أنبوب 1.5 مل microfuge على الجليد
     ملاحظة: تثبيتي، وTrizol سامة إذا كانت تتلامس مع الجلد. ارتداء القفازات عند التعامل مع هذه المواد.
2. إعداد الإعداد تشريح:
   1. ضع مصدر الضوء معقوفة على المجهر تشريح. وضع غطاء من 9 سم طبق بتري على المسرح المجهر تشريح، وتصب طبقة رقيقة من برنامج تلفزيوني 1X إلىأنه (يتم استخدام غطاء لأن الطبق نفسه هو عميق جدا لتشريح السهل).
   2. وضع طبق بتري نفسها (وليس غطاء) على كونترتوب بالقرب من نطاق تشريح وتصب حوالي 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X في ذلك. استخدام هذا لغسل القلب بعد تشريح. بدلا من ذلك، استخدم RBC الاحتياطي تحلل.
   3. مكان شفرة حلاقة، واثنين من أزواج من ملقط، microscissors (اختياري)، وماصة نقل بجانب المجهر. الحصول على وعاء من الجليد إذا ما تم اختيار القتل الرحيم التي كتبها التبريد السريع.
   4. صب 200 مل من 0.03٪ تريكين في البيض الماء في كوب 250 مل دورق إذا ما تم اختيار القتل الرحيم التي كتبها تريكين. إعداد حقيبة واقية صغيرة للتخلص من جثث الزرد.

2. إعداد الزرد

1. وبالنسبة للأسماك ثابتة، وجلب الأسماك ثابتة، تشطف في برنامج تلفزيوني، إلى الإعداد المجهر.
   1. الموت ببطء الزرد الكبار كله التبريد السريع مع الثلج ل> 10 دقيقة.
   2. استخدام ملقط لإحداث ثقب في الجلد فوق الصفاق(بعيدا عن القلب) للمساعدة في اختراق مثبت، ومن ثم وضعها في بارافورمالدهيد 4٪ في فيكس العازلة ¹⁰ لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية.
2. بدلا من ذلك، للأسماك الطازجة والأسماك المكان المراد الموت الرحيم في خزان صغير وتقديمهم إلى الإعداد المجهر. اعتمادا على بروتوكول الأسماك المنشأة الفردية والاستخدامات المصب لقلوب الأسماك تشريح، تخدير الأسماك مع تريكين أو الموت ببطء عن طريق التبريد السريع قبل قطع الرأس.
   1. استخدام الثلج، والتقاط الأسماك واحد مع السمك الصافي وضعها في الماء المثلج حتى توقف الأسماك تتحرك، ما يقرب من 5 دقائق.
   2. بدلا من ذلك، لاستخدام تريكين، والتقاط الأسماك واحد مع السمك الصافي ومكان في الدورق من الحل حتى تتوقف الحركات الخيشومية.
3. بسرعة التقاط الأسماك الموت الرحيم من زعنفة الذيل ووضع على جانبها في الغطاء طبق بيتري التي كانت مليئة برنامج تلفزيوني 1X. استخدام ملقط لرفع زعنفة الصدرية بيد واحدة، في حين باستخدام razoص شفرة لقطع رأس السمكة مع جهة أخرى، الخلفي عادل إلى المرفق من الزعنفة الصدرية (الشكل 1A). تنفيذ هذه الخطوة سواء من خلال النظر من خلال المجهر أو مجرد تصور مباشرة الأسماك على المسرح المجهر.
   ملاحظة: سوف الأسماك طازجة الموت الرحيم لا يزال ينزف بعد قطع الرأس.

الشكل 1. الزرد تشريح القلب الكبار يستخدم المعالم التشريحية الزرد. (A) لقطع رأس السمكة، ورفع الزعنفة الصدرية مع ملقط واستخدام شفرة حلاقة حادة نظيفة على طول خط منقط أحمر كما هو مبين. (B) لثابت رئيس الأسماك، ووضع طينة واحدة من ملقط في حين فم السمكة من طينة أخرى يكمن عبر العين، ومن ثم تحويل رئيس الأسماك بحيث السطح البطني هو ما يصل، وكلا أسنان من ملقط مستقرة ضد الجزء السفلي من طبق بيتري. (C) استخدم forc مجاناالعائد على السهم لقطع الحجز على الغطاء الخيشومي (السهم). (D) رفع هذا الشريان الأبهر الظهري مرئيا كهيكل الأبيض مع شريط وردي تدل الدم اللمعية (السهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تشريح القلب

1. تصور رئيس الأسماك تحت المجهر. مع واحد ملقط، ثابت رئيس الأسماك عن طريق وضع طينة واحدة من ملقط في فم السمكة، من خلال الدماغ، في حين أن طينة الآخر هو خارج الرأس، عبر العين (الشكل 1B). ضمان كلا من أسنان ملقط هي ثابتة أمام السفلي من طبق بتري. عقد رئيس الأسماك بهذه الطريقة، سطحه البطني يجب متجهة لأعلى.
2. مع جهة أخرى، استخدم ملقط الثانية لقطع التعلق بطني منطقة الغطاء الخيشومي للجسم (السهم، الشكل 1C). رفع هذا قليلا مع ملقط، دستظهر orsal الشريان الأورطي تحت كهيكل الأبيض مع شريط أحمر من الدم في التجويف الأبهر (السهم، 1D الشكل). قطع الشريان الأبهر الظهري مع ملقط عن طريق معسر الشريان الأورطي وسحب صعودا. بدلا من ذلك، استخدم microscissors لقطع الشريان الأبهر الظهري.
3. الآن، استخدم ملقط الثانية لفهم الزعنفة الصدرية من قاعدتها، بما في ذلك الغضروف الجسم عند قاعدة الزعنفة، ورفع هذا الخروج. كرر مع غيرها من الزعنفة الصدرية. أحيانا، والقلب يخرج مع الزعانف الصدرية، وذلك بفحص هذه القطع للتأكد من عدم ويرد القلب قبل التخلص منها.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، يجب أن يكون القلب مرئية، لا تزال سليمة ومتصلة إلى رئيس الأسماك المتبقية (على الرغم من أن في بعض الأحيان يتعلق الأمر قبالة مع الزعانف الصدرية). يمكن التعرف على القلب من قبل شكله، لونه وردي، وكونها محاطة التامور المصطبغة. لأنه يتم تنفيذ القتل الرحيم من الأسماك بسرعة، قد تكون قلوب الأسماك الطازجة الموت الرحيم لا يزال الضرب سلوفاكياwly.
4. ترك للرئيس الأسماك مع ملقط الأولى، بحيث أن كلا يديه تمسك ملقط ومجانية. استخدام كل ملقط لندف قلب بعيدا عن التامور. فهم القلب من قبل ما تبقى من الشريان الأبهر الظهري بينما يتم سحبها التامور المتبقية بعيدا.
   ملاحظة: سواء الثابتة أو الطازجة، والقلب هو قوي لطيف سحب في حين أن الأنسجة الضامة المحيطة بها أكثر قابلة للتفتيت. ولذلك، أي نوع من الأنسجة المحيطة التامور يمكن تشريح بعيدا مع قلب المتبقية سليمة.
5. تجاهل الذبيحة الأسماك متبقية في حقيبة واقية.

4. إعداد القلب للتطبيقات المصب

1. باستخدام ملقط، فهم قلب على حافة ظهري الشريان الأورطي / بصلة شريانية ومكان القلب في طبق جديد من برنامج تلفزيوني 1X. بدلا من ذلك، استخدم ماصة نقل. نقل القلب ذهابا وإيابا في برنامج تلفزيوني حول 10X ليغسل الكثير من الدم ممكن.
2. وبالنسبة للتطبيقات التي من المهم لإزالة كافة possibخلايا الدم جنيه، ويغسل في 9 سم طبق بتري مع 15 مل RBC الاحتياطي تحلل بدلا من برنامج تلفزيوني، باستخدام نفس ذهابا وإيابا الحركة. إذا الحفاظ على هيكل القلب ليس مهما لتطبيق المصب (على سبيل المثال، مما يجعل RNA)، واستخدام الملقط أو microscissors لفتح تجويف القلب وتسهيل الشطف بعيدا من خلايا الدم.
3. وبالنسبة للتطبيقات التي يتم المطلوب حجرات القلب منفصلة، ​​استخدم ملقط أو microscissors لتشريح بصلة شريانية، الأذين، والبطين بعيدا عن بعضها البعض.
4. نقل القلب، أو غرف منفصلة، ​​إلى المخزن المؤقت الوجهة على الجليد.
   ملاحظة: تشمل الوجهات الشائعة مخازن لتفارق الخلية، 4٪ امتصاص العرق، أو Trizol.

النتائج

باستخدام هذه الطريقة، قلب الزرد البالغين يمكن تشريح في أقل من 1 دقيقة، مقارنة مع أكثر من 5 دقيقة باستخدام الطرق التقليدية ^8. قلوب تشريح باستخدام هذه الطريقة سليمة موثوق (الشكل 2A)، في حين أن الطرق التقليدية تتطلب ⁸ قطع عمياء في التامور وبالتالي تسبب ...

Discussion

في حين أساليب لتشريح القلب الزرد الكبار وقد وصفت، كانت هذه الأساليب تستغرق وقتا طويلا، وتسبب عادة الأضرار التي لحقت القلب أثناء تشريح. لإجراء التجارب حيث قد تكون هناك حاجة لعدد كبير من قلوب الكبار، و / أو عندما تجنب تدهور أنسجة القلب من المهم للتطبيقات المصب، والوقت ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
Fish net	Petsmart	36-16731
250 ml glass beaker	Kimble	14005-250
9 cm polystyrene Petri dish	Nunc	172958
Razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
2 Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
Plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
Gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
Micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57	optional