שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Summary

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Abstract

שימוש במערכת מודל דג הזברה ללימוד פיתוח, התחדשות, ומחלה מתפשטת לכיוון שימוש בלבבות מבוגרים לניתוק תא וטיהור של RNA, DNA, חלבונים ו. כל היישומים האלה דורשים התאוששות המהירה של מספר המשמעותי של לבבות דג הזברה להימנע גן בקרה, חילוף חומרים, ושינויים אחרים שמתחילים אחרי המוות. לב דג הזברה מבוגר נדרש גם ללימוד מבנה לב עבור מגוון רחב של מוטציות וללימוד התחדשות לב. עם זאת, לנתיחה לב דג הזברה המסורתית היא איטית וקשה ודורשת כלים מיוחדים, מה שהופך את הנתיחה בקנה מידה גדולה של לבבות דג הזברה מבוגרים מייגע. שיטות מסורתיות גם נמל את הסיכון של פגיעה בלב במהלך הניתוח. כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח לב דג הזברה מבוגר שהיא מהיר, לשחזור, ומשמר את ארכיטקטורת לב. יתר על כן, שיטה זו אינה דורשת כלים מיוחדים, אינו מכאיב לדג הזברה,יכול להתבצע על דגימות טריות או קבועים, וניתן לבצעו בדג זברה צעירה כמו בן חודש. הגישה המתוארת מרחיבה את השימוש בדג הזברה מבוגרת למחקר לב וכלי דם.

Introduction

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

Protocol

הערה: תמיד להיות בטוח שאישור ועדת IACUC או אתיקה הוא במקום לפני תחילת כל הליך ניסיוני באמצעות דג הזברה.

1. הכינו חומרים כימיים והתקנה

1. הכן את הפתרונות הבאים. מצא את המתכונים לכל הפתרונות הללו במדריכי דג הזברה סטנדרטיים ^10.
   • 500 מיליליטר של מים ביצה
   • 200 מיליליטר של 0.03% Tricaine בביצת מים
   • של נאגר מלוח פוספט 1x 100 מיליליטר (PBS)
   • RBC תמוגה מאגר (אופציונאלי)
   • חיץ יעד של בחירה (מקבע, Trizol, PBS, וכו ') בצינור 1.5 מיליליטר microfuge על קרח
     הערה: מקבע וTrizol רעילים אם הם באים במגע עם עור. ללבוש כפפות בעת טיפול בחומרים אלה.
2. הכן התקנה לנתיחה:
   1. מקם את מקור מתכווננת אור על מיקרוסקופ לנתח. מניחים את המכסה של 9 סנטימטר צלחת פטרי על הבמה מיקרוסקופ לנתח, ויוצקים שכבה דקה של 1x PBS לזה (המכסה משמש כי המנה עצמה היא עמוקה מדי עבור נתיחה קלה).
   2. מניחים את צלחת פטרי עצמו (לא את המכסה) על הדלפק ליד ההיקף לנתח ויוצקים כ 15 מיליליטר של 1x PBS בזה. להשתמש בזה כדי לשטוף את הלב לאחר נתיחה. לחלופין, להשתמש RBC תמוגה הצפת.
   3. להב מקום גילוח, שני זוגות מלקחיים, microscissors (אופציונאלי), ופיפטה העברה לצד מיקרוסקופ. להשיג מיכל של קרח אם המתת חסד על ידי קירור מהיר נבחרה.
   4. יוצקים 200 מיליליטר של 0.03% Tricaine בביצת מים לתוך כוס זכוכית 250 מיליליטר אם המתת חסד על ידי Tricaine נבחר. הכן תיק Biohazard קטן לסילוק פגרי דג הזברה.

2. הכן דג הזברה

1. לדגים קבועים, להביא דגים קבועים, לשטוף בPBS, להתקנת מיקרוסקופ.
   1. להרדים את כל דג הזברה מבוגרת על ידי קירור מהיר עם קרח ל> 10 דקות.
   2. שימוש במלקחיים כדי לעשות חור בעור מעל הצפק(מהלב) כדי לסייע לחדירה מקבע, ואז לשים אותם בparaformaldehyde 4% בתקן Buffer ¹⁰ לשעה 2 ב RT או O / N ב 4 ° C.
2. לחלופין, לדגים טריים, דגי המקום להיות מורדמים במכל קטן החזקה ולהביא להתקנת מיקרוסקופ. בהתאם לפרוטוקול הדגים של המתקן הבודד והשימושים במורד הזרם ללב דגים גזורים, להרדים דגים עם Tricaine או להרדים על ידי קירור מהיר לפני עריפת הראש.
   1. כדי להשתמש בקרח, להרים דג אחד עם רשת הדגים והמקום במי קרח עד שהדג מפסיק לנוע, כ -5 דקות.
   2. לחלופין, להשתמש Tricaine, להרים דג אחד עם רשת הדגים ומניחים בכוס של הפתרון עד תנועות זימים להפסיק.
3. במהירות להרים את הדגים מורדמים על ידי סנפיר הזנב שלה ולהניח אותה בצד שלה בכיסוי צלחת פטרי שהיה מלא ב1x PBS. השתמש במלקחיים כדי להרים את סנפיר חזה ביד אחת, תוך השימוש בrazoלהב r לערוף את הדגים ביד השנייה, רק אחורי לצירופה של סנפיר החזה (איור 1 א). לבצע שלב זה או על ידי מחפש דרך מיקרוסקופ או פשוט ישירות לדמיין את הדגים על הבמה מיקרוסקופ.
   הערה: דגים טריים עדיין מורדמים ידממו לאחר עריפת הראש.

איור 1. לנתיחה לב מבוגר דג הזברה מנצלת ציוני דרך אנטומי דג הזברה. (א) כדי לערוף את הדגים, להרים את סנפיר החזה עם מלקחיים ולהשתמש בסכין גילוח נקי חד לאורך הקו המקווקו האדום כפי שמוצג. (ב) כדי לייצב את ראש הדג, מקום שן אחת של המלקחיים בפה הדג ואילו שן האחר טמון פני העין, ולאחר מכן להפעיל את ראש הדג, כך שמשטח הגחון הוא למעלה והן השיניים של המלקחיים יציבות נגד תחתית צלחת פטרי. (C) השתמש בforc החופשיeps לחתוך את הקובץ המצורף של operculum (החץ). (ד) ההרמה זו, אב העורקים הגב גלוי כמבנה לבן עם פס ורוד המציין דם luminal (חץ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. לנתח הלב

1. דמיין את ראש הדג מתחת למיקרוסקופ. עם אחד מלקחיים, לייצב את ראש הדג על ידי הנחת שן אחת של המלקחיים בפה הדגים, דרך המוח, ואילו שן האחר הוא מחוץ לראש, על פני העין (איור 1). ודא שני השיניים של המלקחיים הן יציבים נגד תחתית צלחת פטרי. מחזיק את ראש הדג בדרך זו, משטח הגחון שלה צריך להיות כלפי מעלה.
2. ביד השנייה, להשתמש במלקחיים השני לחתוך את הקובץ המצורף הגחון של operculum לגוף (חץ, איור 1 ג). ההרמה מעט זה עם המלקחיים, דאב העורקים orsal יופיעו מתחת למבנה לבן עם פס אדום של דם בלומן של אב העורקים (חץ, 1D איור). חותך את אב העורקים גב עם המלקחיים על ידי צובט את אב העורקים ומושכים כלפי מעלה; לחלופין, להשתמש microscissors לחתוך את אב העורקים הגב.
3. עכשיו, להשתמש במלקחיים השני לתפוס את סנפיר החזה מבסיסו, ובכלל זה סחוס הגוף בבסיס של הסנפיר, ולהרים את זה ממני. חזור עם סנפיר החזה האחר. מדי פעם, הלב יוצא עם סנפירי החזה, כך לבחון חלקים אלה כדי לוודא שהלב אינו מחובר לפני השלכת אותם.
   הערה: בשלב זה, הלב צריך להיות גלוי, עדיין שלם ומחוברים לראש הדג שנותר (אם כי מדי פעם זה יורד עם סנפירי החזה). הלב יכול להיות מזוהה על ידי צורתו, צבעו הוורוד, והיותו מוקפים בקרום לב פיגמנט. משום המתת חסד של הדגים מתבצע במהירות, לב דגים טרי מורדמים עדיין עשוי להיות מכות slowly.
4. עזוב את ראש הדג עם המלקחיים הראשונים, כך ששני הידיים מחזיקות מלקחיים וחופשיים. להשתמש בשני המלקחיים כדי להקניט את הלב מקרום הלב. לתפוס את הלב על ידי השארית של אב העורקים הגב תוך קרום הלב הנותר התרחק.
   הערה: אם קבוע או טרי, הלב הוא חזק כדי עדין מושך תוך רקמת חיבור המקיפה היא פריך יותר. לכן, כל רקמת קרום הלב שמסביב יכולה להיות גזור משם עם הלב שנותר ללא פגע.
5. מחק את פגר דגי שאריות בשקית Biohazard.

4. מכין את הלב ליישומים במורד הזרם

1. בעזרת מלקחיים, לתפוס את הלב על ידי הקצה של אב העורקים גב / arteriosus bulbus ולמקם את הלב בצלחת הטרי של 1x PBS. לחלופין, להשתמש פיפטה העברה. הזז את הלב הלוך ושוב בPBS על 10x כדי לשטוף כמה שיותר דם ככל האפשר.
2. עבור יישומים בהם הוא חשוב כדי להסיר את כל possibתאי דם le, לשטוף בצלחת פטרי 9 סנטימטר עם 15 מיליליטר RBC תמוגה הצפת במקום PBS, תוך שימוש באותה תנועת גב ו-ושוב. אם השמירה על מבנה הלב אינה חשובה ליישום במורד הזרם (לדוגמא, מה שהופך את RNA), להשתמש במלקחיים או microscissors כדי לפתוח את חלל הלב ולהקל על השטיפה במרחק של תאי דם.
3. עבור יישומים בי חדרי לב נפרדים רצויים, להשתמש במלקחיים או microscissors לנתח את arteriosus bulbus, אטריום, והחדר מלבד אחד את השני.
4. העבר את הלב, או תאים נפרדים, למאגר שהיעד על קרח.
   הערה: יעדים נפוצים כוללים מאגרים לתא דיסוציאציה, paraformaldehyde 4%, או Trizol.

תוצאות

באמצעות שיטה זו, לב דג הזברה מבוגר יכול להיות גזור בדקות פחות מ 1, בהשוואה ליותר מ -5 דקות בשיטות מסורתיות ^8. לבבות גזורים בשיטה זו הם באופן מהימן שלמים (איור 2 א), ואילו שיטות מסורתיות ⁸ דורשות חיתוך בצורה עיוורת לקרום הלב ולכן בדרך כלל לגרום לניזק או ?...

Discussion

בעוד שיטות ללנתח לב דג הזברה המבוגר תוארו, שיטות אלה היו זמן רב ונפוצות גרמו לפגיעה בלב במהלך נתיחה. כדי לבצע ניסויים שבם מספר רב של לבבות מבוגרים עשוי להיות נחוץ, ו / או כאשר הימנעות השפלה של רקמת לב היא חשובה עבור יישומים במורד הזרם, הזמן הנדרש תוך שימוש בטכניקות מסור?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
Fish net	Petsmart	36-16731
250 ml glass beaker	Kimble	14005-250
9 cm polystyrene Petri dish	Nunc	172958
Razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
2 Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
Plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
Gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
Micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57	optional