Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Riepilogo

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Abstract

L'uso del sistema modello per lo studio zebrafish sviluppo, rigenerazione e malattia è espansione verso l'uso di cuori adulti per dissociazione cellulare e purificazione del DNA, RNA e proteine. Tutte queste applicazioni richiedono la rapida ripresa di un numero significativo di cuori zebrafish per evitare gene regolatore, metaboliche, e altri cambiamenti che iniziano dopo la morte. Cuori zebrafish adulti sono necessari anche per lo studio la struttura del cuore per una varietà di mutanti e per studiare la rigenerazione del cuore. Tuttavia, il tradizionale dissezione cuore zebrafish è lento e difficile e richiede strumenti specializzati, facendo su larga scala dissezione dei cuori di zebrafish adulto noioso. I metodi tradizionali porto anche il rischio di danneggiare il cuore durante la dissezione. Qui, si descrive un metodo per la dissezione di cuori di zebrafish adulto che è veloce, riproducibile, e conserva l'architettura del cuore. Inoltre, questo metodo non richiede strumenti specializzati, è indolore per il zebrafish,possono essere eseguite su campioni freschi o fissi, e possono essere eseguite sul pesce zebra giovane come un mese. L'approccio descritto espande l'uso di zebrafish adulto per la ricerca cardiovascolare.

Introduzione

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

Protocollo

NOTA: Accertarsi sempre che l'approvazione IACUC o comitato etico è a posto prima di iniziare qualsiasi procedura sperimentale utilizzando zebrafish.

1. Preparare i reagenti e installazione

1. Preparare le seguenti soluzioni. Trova le ricette per tutte queste soluzioni in manuali di zebrafish normali ^10.
   • 500 ml di acqua Egg
   • 200 ml di 0,03% Tricaine a Egg Water
   • 100 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS)
   • RBC Lysis Buffer (optional)
   • Il buffer di destinazione di scelta (fissante, Trizol, PBS, etc.) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga sul ghiaccio
     NOTA: fissativo e Trizol sono tossici se entrano in contatto con la pelle. Maneggiare con guanti queste sostanze.
2. Preparare l'installazione dissezione:
   1. Posizionare la sorgente luminosa collo di cigno sul microscopio da dissezione. Mettere il coperchio di un piatto 9 centimetri Petri sul palco microscopio da dissezione, e versare un sottile strato di 1x PBS in(il coperchio è utilizzato perché il piatto stesso è troppo profonda per un facile dissezione).
   2. Porre la capsula Petri in sé (non il coperchio) sul piano di lavoro in prossimità del campo di applicazione dissezione e versare circa 15 ml di 1x PBS in esso. Usare questo per lavare il cuore dopo la dissezione. In alternativa, utilizzare RBC Lysis Buffer.
   3. Luogo lametta, due paia di pinze, microscissors (opzionale), e una pipetta di trasferimento accanto al microscopio. Ottenere un contenitore di ghiaccio se viene scelto eutanasia per raffreddamento rapido.
   4. Versare 200 ml di 0,03% Tricaine a Egg acqua in un bicchiere di vetro da 250 ml se si sceglie l'eutanasia per Tricaine. Preparare una piccola borsa di rischio biologico per lo smaltimento delle carcasse di zebrafish.

2. Preparare Zebrafish

1. Per il pesce fissa, portano pesce fisso, sciacquati in PBS, per la configurazione del microscopio.
   1. Euthanize tutta zebrafish adulto per un rapido raffreddamento con ghiaccio per> 10 min.
   2. Usare pinze per fare un buco nella pelle sopra il peritoneo(Dal cuore) per favorire la penetrazione di fissativo, e poi metterli in 4% paraformaldeide in Fix Buffer ¹⁰ per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
2. In alternativa, per il pesce fresco, pesce posto da eutanasia in un piccolo serbatoio e portare alla messa a punto del microscopio. A seconda del protocollo di pesce della singola struttura e gli usi a valle per i cuori dei pesci sezionati, anestetizzare pesce con Tricaine o eutanasia da un raffreddamento rapido prima decapitazione.
   1. Per usare il ghiaccio, prendere un pesce con la rete di pesce e posto in acqua ghiacciata fino a quando il pesce si ferma, a circa 5 min.
   2. In alternativa, per usare Tricaine, prendere un pesce con la rete di pesce e posto nel bicchiere della soluzione fino a quando i movimenti delle branchie fermano.
3. Prendere rapidamente il pesce eutanasia dal suo pinna caudale e adagiarla su un fianco nel coperchio piatto Petri che era pieno di 1x PBS. Utilizzare le pinze per sollevare un pettorale con una mano, mentre con l'Razolama r per decapitare il pesce con l'altra mano, appena posteriormente al fissaggio della pinna pettorale (Figura 1A). Eseguire questo passaggio sia guardando attraverso il microscopio o semplicemente visualizzare direttamente il pesce sul palco microscopio.
   NOTA: Il pesce appena eutanasia saranno ancora sanguinano dopo la decapitazione.

Figura 1. Zebrafish dissezione cuore adulto utilizza punti di repere anatomici zebrafish. (A) di decapitare i pesci, sollevare la pinna pettorale con una pinza e utilizzare una lama di rasoio pulito affilata lungo la linea tratteggiata rossa come mostrato. (B) Per stabilizzare la testa di pesce, mettere un dente della pinza nella bocca del pesce, mentre l'altro dente si trova attraverso l'occhio, e poi girare la testa di pesce in modo che la superficie ventrale è alto e due denti della pinza sono stabili contro il fondo della scatola di Petri. (C) Utilizzare la forc gratuitoeps per tagliare l'attaccamento del opercolo (freccia). (D) Sollevamento questo, l'aorta dorsale è visibile come una struttura bianca con una striscia rosa denota sangue luminale (freccia). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Sezionare il Cuore

1. Visualizza la testa di pesce sotto il microscopio. Con una pinza, stabilizzare la testa di pesce mettendo una tine della pinza nella bocca di pesce, attraverso il cervello, mentre l'altro dente è al di fuori della testa, attraverso l'occhio (Figura 1B). Garantire entrambi denti della pinza sono costanti contro il fondo della capsula di Petri. Tenendo la testa di pesce in questo modo, la sua superficie ventrale deve essere rivolto verso l'alto.
2. Con l'altra mano, utilizzare la seconda pinza per tagliare l'attacco ventrale dell'opercolo al corpo (freccia, Figura 1C). Sollevamento questo un po 'con le pinze, il dOrsal aorta apparirà sotto una struttura bianca con una striscia rossa di sangue nel lume aortico (freccia, Figura 1D). Tagliare le aorta dorsale con la pinza pizzicando l'aorta e tirando verso l'alto; in alternativa, utilizzare microscissors per tagliare l'aorta dorsale.
3. Ora, utilizzare la seconda pinza per afferrare la pinna pettorale dalla sua base, compresa la cartilagine corpo alla base della pinna, e sollevare fuori questo. Ripetere con l'altra pinna pettorale. Di tanto in tanto, il cuore esce con le pinne pettorali, quindi esaminare questi pezzi per assicurarsi che il cuore non è collegato prima di scartare.
   NOTA: A questo punto, il cuore deve essere visibile, ancora intatta e collegato alla restante testa di pesce (anche se a volte si stacca con le pinne pettorali). Il cuore può essere identificato dalla sua forma, il suo colore rosa, e il suo essere circondato da pericardio pigmentata. Perché l'eutanasia del pesce viene effettuata rapidamente, cuori di pesce fresco eutanasia possono essere ancora battendo sloWLY.
4. Lasciate andare la testa di pesce con le prime pinze, in modo che entrambe le mani tengono pinze e sono gratuiti. Usare entrambe le pinze per prendere in giro il cuore lontano dal pericardio. Afferrare cuore dal resto dei dell'aorta dorsali mentre il pericardio rimanente viene tirato via.
   NOTA: Sia fisso o fresco, il cuore è robusta a leggera trazione mentre il tessuto connettivo circostante è più friabile. Pertanto, qualsiasi tessuto pericardico circostante può essere sezionato via con il cuore rimasta intatta.
5. Eliminare la carcassa di pesce rimasto nel sacchetto.

4. Preparare il Cuore per applicazioni a valle

1. Utilizzando pinze, afferrare il cuore dal bordo della aorta dorsale / bulbo arterioso e mettere il cuore nel piatto fresco di 1x PBS. In alternativa, utilizzare una pipetta di trasferimento. Spostare il cuore avanti e indietro nel PBS circa 10x per lavare via il più sangue possibile.
2. Per applicazioni in cui è importante rimuovere tutto possibLe cellule del sangue, lavare in un piatto 9 centimetri Petri con 15 ml RBC Lysis Buffer invece di PBS, utilizzando lo stesso movimento di va e vieni. Se mantenendo la struttura del cuore non è importante per l'applicazione a valle (ad esempio, facendo RNA), utilizzare le pinze o microscissors per aprire la cavità cardiaca e facilitare risciacquo distanza di cellule del sangue.
3. Per le applicazioni in cui sono determinanti: camere cardiache separati, utilizzare forcipe o microscissors per sezionare il bulbo arterioso, atrio e il ventricolo uno dall'altro.
4. Trasferire il cuore o camere separate, al buffer di destinazione su ghiaccio.
   NOTA: destinazioni più comuni includono buffer per dissociazione cellulare, 4% paraformaldeide, o Trizol.

Risultati

Usando questo metodo, un cuore zebrafish adulto può essere sezionato in meno di 1 minuto, a fronte di oltre 5 min con metodi tradizionali ^8. Hearts sezionati con questo metodo sono affidabile intatto (figura 2A), mentre i metodi tradizionali richiedono ⁸ tagliando alla cieca in pericardio e quindi comunemente causare danni o la perdita dell'atrio o bulbo arterioso (Figura 2B). Cuori sezionato mantengono la loro integrità strutturale e sono adatti per l'is...

Discussione

Mentre sono stati descritti i metodi per sezionare cuore zebrafish adulto, questi metodi sono stati in termini di tempo e di solito causato danni al cuore durante la dissezione. Per eseguire esperimenti in cui può essere necessario un gran numero di cuori adulti, e / o quando evitare il degrado del tessuto cardiaco è importante per le applicazioni a valle, il tempo necessario utilizzando tecniche di dissezione tradizionali è proibitivo. Allo stesso modo, ottenendo riproducibile intatti, cuori intatti è importante pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
Fish net	Petsmart	36-16731
250 ml glass beaker	Kimble	14005-250
9 cm polystyrene Petri dish	Nunc	172958
Razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
2 Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
Plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
Gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
Micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57	optional