Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

Abstract

الحويصلات متشابك الافراج عن الناقلات العصبية في المشابك الكيميائية من خلال دورة ديناميكية من الانصهار واسترجاعها. رصد نشاط متشابك في الوقت الحقيقي، وتشريح الخطوات مختلفة من إكسو-الإلتقام على مستوى واحد حويصلة حاسمة لفهم وظائف متشابك في الصحة والمرض.

وراثيا ترميز تحقيقات حساسة للدرجة الحموضة المستهدفة مباشرة إلى الحويصلات متشابك وانعكاس إجمالي الداخلية المجهر مضان (TIRFM) تقديم القرار المكانية والزمانية اللازمة لمتابعة ديناميات الحويصلة. مجال زائل الناتجة عن الانعكاس الكلي الداخلي يمكن أن تثير فقط fluorophores وضعها في طبقة رقيقة (<150 نانومتر) فوق غطاء زجاجي على الخلايا التي تلتزم، بالضبط حيث عمليات إكسو-الإلتقام تحدث. هي مناسبة الناتجة صور عالية التباين مثالي لالحويصلات التتبع والتحليل الكمي من الأحداث الانصهار.

في هذا البروتوكول، SH-SY5Y ن البشريويقترح خلايا euroblastoma باعتباره نموذجا قيما لدراسة إطلاق سراح العصبي في مستوى واحد-الحويصلة التي كتبها TIRFM، بسبب سطحها مستو وجود حويصلات تفرقوا. يتم توفير الطرق لزراعة SH-SY5Y كما الخلايا الملتصقة وtransfecting لهم synapto-pHluorin، فضلا عن تقنية لأداء TIRFM والتصوير. وأخيرا، قدم استراتيجية تهدف إلى تحديد، عد، وتحليل الأحداث الانصهار عند مستويات كلها خلية واحدة حويصلة.

للتحقق من صحة نهج التحليل إجراء التصوير والبيانات، ويتم تحليل ديناميات حويصلات pHluorin الموسومة تحت يستريح وحفز (إزالة إستقطاب تركيزات البوتاسيوم) الظروف. الاستقطاب غشاء يزيد من وتيرة الأحداث الانصهار ويؤدي إلى زيادة موازية من صافي إشارة مضان سجلت في خلية كاملة. تحليل احدة حويصلة يكشف تعديلات للسلوك الانصهار الحدث (الارتفاع المتزايد الذروة والعرض). وتشير هذه البيانات عشرفي الاستقطاب البوتاسيوم ليس فقط يؤدي الى الافراج عن ناقل عصبي هائل ولكن يغير أيضا آلية الانصهار الحويصلة وإعادة التدوير.

مع التحقيق الفلورسنت المناسب، وهذا الأسلوب يمكن أن تستخدم في الأنظمة الخلوية المختلفة لتشريح آليات إفراز التأسيسي وحفز.

Introduction

انتقال متشابك الكيميائية بين الخلايا العصبية هو آلية رئيسية للاتصال في الجهاز العصبي. وهي تعتمد على إطلاق النواقل العصبية من خلال دورة ديناميكية من الانصهار الحويصلة واسترجاعها في الموقع قبل المشبكي. وقد تم تحديد العديد من البروتينات المشاركة في ديناميات الحويصلة. ومع ذلك، لا تزال المساهمة المحددة لهذه الظاهرة إلى توضيح 1.

فهمنا يقتصر جزئيا بحقيقة أن المقايسات الأكثر استخداما لإكسو / الإلتقام ليست دائما الأنسب. العديد من الدراسات المتعلقة الانصهار الحويصلة وديناميكية تعتمد على تقنيات الكهربية. توفر هذه التقنية على قرار الزمني الأمثل وممتازة للتحقيق الانصهار الأولي من الحويصلات إلى غشاء البلازما ولكن غير قادرة على الكشف عن العديد من الأحداث الجزيئية الكامنة التي تدعم وظيفة قبل المشبكي. الإلكترون المجهري، على الجانب الآخر، يوفر أرقى morphologicaل وصف لكل خطوة واحدة، ولكن الجانب الديناميكي لهذا الحدث لا يمكن القبض، لأن العينات يجب أن تكون ثابتة لكي يتم تحليلها.

ظهور تقنيات التسجيل البصري الجديدة 2،3، في تركيبة مع التقدم في الفلورسنت تطوير تحقيقات الجزيئية 4-6، وتمكن التصور من العمليات exocytic في الخلايا الحية، وبالتالي توفير مستويات جديدة من المعلومات حول بنية متشابك وظيفة.

الدراسات الأولية استغلال الأصباغ التي تعتمد على النشاط styryl (FM1-43 والأصباغ العضوية ذات الصلة) 7،8. دولة من بين الفن وتقنيات التصوير توظف المتغيرات الحساسة الرقم الهيدروجيني للالبروتين الأخضر نيون (GFP) (pHluorin) المربوطة إلى الحويصلات اللمعية البروتينات 9. يتم تبديل هذه التحقيقات عادة قبالة عندما تكون موجودة في الحويصلات بسبب انخفاض درجة الحموضة اللمعية. بعد الاندماج مع غشاء البلازما، يتعرض الداخلية الحويصلة إلى الفضاء خارج الخلية محايد، ودرجة الحموضة يزيد فجأة، ويخفف من وتبريد تعتمد على بروتون من pHluorin ويظهر إشارة الفلورسنت بسرعة. كما تغير في pHluorin أسرع من الحدث الانصهار، من خلال رصد زيادات مضان، الانصهار الحويصلة مع غشاء يمكن قياسها وتحليلها. لأن endocytosed سطح جزيئات الموسومة pHluorin، إشارة مضان يعود بعد ذلك إلى المستوى القاعدي، وبالتالي فإن نفس التركيبة يمكن أن تستخدم أيضا لمراقبة الحويصلة إعادة تدوير 9.

في حين أن الموسومة حويصلة درجة الحموضة استشعار يضمن التصور فقط من تلك الحويصلات التي تلتحم حقا مع غشاء البلازما، مطلوب التصوير في القرار المكانية والزمانية عالية لوصف بالتفصيل الخطوات المتبعة في إكسو / العمليات التقامي. هذه التقنية البصرية التي توفر الدقة المكانية والزمانية الضروري هو مجموع المجهري التأمل الداخلي مضان (TIRFM)، وهو تطبيق مضان المجهري 10.

"> يحدث الانعكاس الكلي الداخلي في واجهة بين الزجاج غطاء الانزلاق والعينة. عندما يصل مسار الضوء الزجاج غطاء للانزلاق مع زاوية الحادث أكبر من الزاوية الحرجة، لا ينتقل ضوء الإثارة في العينة ولكن تنعكس تماما الظهر. وفي ظل هذه الظروف، وهو زائل أشكال موجة الضوء في واجهة ويكاثر على المدى المتوسط ​​مع أقل كثافة ضوئية (العينة). وبما أن شدة المجال زائل يضمحل بشكل كبير، مع البعد عن واجهة (مع عمق تغلغل حوالي 100 نانومتر) فقط fluorophores في أقرب القرب من غطاء الانزلاق يمكن أن يكون سعيدا في حين أن أولئك بعيدا عن الحدود ليست كذلك. في الخلايا transfected مع GFP-يبني، هذا العمق يتوافق مع البروتينات وأعرب على غشاء البلازما أو في هياكل حويصلي الاقتراب منه. كما fluorophores في داخل الخلية لا يمكن متحمس، والتقليل من مضان الخلفية، وصورة مع إشارة / الفئران خلفية عالية جداويتكون الإعلام والتوعية 11.

العديد من الخصائص تجعل TIRFM أسلوب الاختيار لرصد الحويصلات ديناميات. على النقيض من ذلك الكمال وإشارة إلى الضوضاء نسبة عالية تسمح للكشف عن الإشارات منخفضة جدا مستمدة من الحويصلات واحدة. الحصول على الصور يعتمد على الشرائح الالكترونية في كل إطار يوفر القرار الزماني اللازم لاكتشاف عمليات ديناميكية للغاية. وأخيرا، فإن التعرض الحد الأدنى من الخلايا لضوء في أي طائرة أخرى في العينة يقلل بشدة الضيائية وتمكن تسجيل طويل دائم الوقت الفاصل 12.

يبقى تحليل البيانات الجانب الأكثر تحديا وحاسم من هذه التقنية. إن أبسط طريقة لمراقبة الانصهار الحويصلة هي لقياس تراكم البروتينات مراسل فلوري على سطح الخلية، على مر الزمن 13. كما يزيد من الانصهار، صافي الزيادة إشارة مضان كذلك. ومع ذلك، وهذه الطريقة قد يقلل من شأن هذه العملية، لا سيما في الخلايا الكبيرة وفي ظروف الراحة،لأن العمليات الإلتقام وphotobleaching من تعويض الزيادة في كثافة مضان بسبب حويصلة إيماس. طريقة بديلة هو اتباع كل الانصهار حدث واحد 14. هذا الأسلوب الأخير هو حساس جدا ويمكن أن تكشف عن تفاصيل مهمة حول آليات الاندماج. ومع ذلك، فإنه يتطلب اختيار اليدوية الأحداث واحدة، لأن إجراءات مؤتمتة بالكامل لمتابعة الحويصلات وللتسجيل تذبذب إشاراتها الفلورسنت لا تتوفر دائما. مراقبة ديناميات الحويصلة تتطلب خلايا أخذ العينات في وتيرة عالية. وهذا يولد كمية كبيرة من البيانات التي بالكاد يمكن تحليلها يدويا.

على اقتراح من هذه الورقة هو تحسين تقنية التصوير TIRFM لرصد القاعدية وحفز الإفراج العصبي في خط الخلية العصبية SH-5YSY، ووصف، خطوة بخطوة، وهو إجراء المتقدمة في المختبر لتحليل البيانات، على حد سواء عند مستويات كلها خلية واحدة حويصلة.

Protocol

1. الثقافة الخلية وترنسفكأيشن

  1. زراعة الخلايا SH-SY5Y
    ملاحظة: وقد أجريت التجارب باستخدام العصبية البشرية SH- SY5Y (آي تي سي سي # CRL-2266) 15. خلايا SH-SY5Y تنمو على شكل مزيج من مجموعات العائمة والخلايا الملتصقة. اتبع الإرشادات الواردة في البروتوكول (كثافة الخلايا، ونسبة تقسيم، الخ.) لديك الخلايا التي تنمو ترتبط بقوة مع غطاء زجاجي، وهو أمر حاسم بالنسبة TIRFM.
    1. قبل البدء، في ظل مجلس الوزراء تدفق الصفحي السلامة الأحيائية، وجعل حجم مناسب من الفوسفات العقيمة حل العازلة المالحة (PBS) ومستنبت.
      1. جعل 50 مل من برنامج تلفزيوني مع تركيزات 150 مم كلوريد الصوديوم، و 24 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4. تصفية الحل.
      2. جعل 50 مل من المتوسط ​​خلية من Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع ارتفاع نسبة الجلوكوز، و 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) والبنسلين (100 U / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، L-الجلوتامين ( 2 مم)، والبيروفات الصوديوم (1 ملم). تصفية الحل.
    2. إزالة كاملة المتوسطة النمو وغسل الخلايا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني.
    3. احتضان الخلايا مع 2 مل من 0.05٪ التربسين ethylenediaminetetraacetic-حمض (EDTA) (لمدة 6 سم طبق بتري) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 وفصل الخلايا باستخدام ماصة.
    4. تعطيل التربسين بإضافة 2 مل من DMEM، وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
    5. إزالة طاف، إضافة 1 مل من DMEM لبيليه وماصة الحل صعودا وهبوطا بما فيه الكفاية لتفريق الخلايا في تعليق خلية واحدة.
    6. تقسيمها 1: 4 في 6 سم القطر طبق بتري جديدة تحتوي على 3 مل من المتوسط ​​كاملة. الحفاظ على الخلايا في الثقافة في 6 سم القطر أطباق بتري، عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. الثقافة الفرعية مرة واحدة في الأسبوع أو عندما قد غطت 80-90٪ من مساحة السطح.
  2. SH-SY5Y الطلاء خلية للتصوير
    1. للتجارب TIRFM، لوحةالخلايا على أغطية الزجاج. يغطي توظيف الزجاج مع 0.17 ± 0.005 مم سماكة ومعامل الانكسار 1.5255 ± 0.00015. قبل البدء، وإعداد coverslips الزجاج على النحو التالي:
      1. يغطي زجاج نظيف مع 90٪ من الإيثانول، O / N.
      2. شطف لهم جيدا في الماء المقطر (ثلاثة تغييرات من الماء المقطر). يغطي الزجاج الجاف في فرن التجفيف.
      3. مكان يغطي في أطباق بتري الزجاج وتعقيم في فرن محمى على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    2. قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، ووضع كل ساترة في 3.5 سم طبق بتري، إضافة 1 مل من مستنبت واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.1.3 - 1.1.5، تعليق بيليه خلية في 1 مل من المتوسط ​​الكامل والاعتماد. حساب حجم الصحيح من تعليق خلية لإضافة إلى كل طبق بيتري لانتاج 3 × 10 5 خلايا / جيد. مطلوب هذه الكثافة لنمو الخلايا الأمثل وترنسفكأيشن كفاءة. احتضان عند 37 ° Cفي 5٪ CO 2 حاضنة O / N.
  3. SH-SY5Ytransfection التي كتبها polyethylenimine (PEI)
    ملاحظة: لتصور ديناميات حويصلات متشابك، وقد استخدم ناقلات pCB6 تحتوي على synapto-pHluorin. تم إنشاء synapto-pHluorin من قبل في إطار اندماج البديل الحساسة الرقم الهيدروجيني للالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) 16 والبروتين الغشاء الحويصلي synaptobrevin 2. بناء واستخدمت على نطاق واسع للتحقيق خصائص حويصلة متشابك داخل الخلايا العصبية 9.
    1. قبل البدء ترنسفكأيشن، وجعل 10 مل من الحلول التالية. حافظ على الحلول القصوى كما ك 1 الشهر.
      1. جعل 150 مم كلوريد الصوديوم الحل. ضبط لدرجة الحموضة 5.5 مع 0.01 N حمض الهيدروكلوريك.
      2. جعل حل PEI بنسبة 10٪ polyethylenimine (PEI، و 25 كيلو دالتون الخطي) في 150 ملي كلوريد الصوديوم الحل. الرقم الهيدروجيني للمحلول ترتفع إلى 8.8. ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 مع 0.01 N حمض الهيدروكلوريك.
    2. 24 ساعة بعد والطلاء، وإزالة المتوسطة وتحديث مع 1.5 مل منمتوسطة كاملة. إبقاء الخلايا عند 37 درجة مئوية، في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. تحت مجلس الوزراء تدفق الصفحي السلامة الأحيائية، في أنبوب 1.5 مل microfuge، إضافة 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 25 ميكرولتر من 150 مم كلوريد الصوديوم الحل و 100 ميكرولتر من PEI الحل في 3.5 سم طبق بتري.
    4. دوامة لمدة 10 ثانية، ثم احتضان الخليط DNA / PEI لمدة 30 دقيقة في RT.
    5. إضافة بعناية الخليط DNA / PEI إلى طبق بتري تحتوي على coverslips مع الخلايا ويهز بلطف لتوزيع بالتساوي الكاشف في طبق بتري.
    6. بعد 4 ساعات تغيير المتوسطة واحتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. إجراء تجارب التصوير 24 - 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

التصوير 2. خلية من انعكاس إجمالي الداخلية المجهر مضان (TIRFM)

  1. التصوير انشاء
    1. أداء TIRF التصوير مع مجموعة المتابعة هو موضح في الشكل 1. وهي تتألف من بمحركات مقلوبالمجهر (الشكل 1، أقحم A)، مصدر الليزر (الشكل 1، أقحم B) وTIRF-المنزلق (الشكل 1، أقحم C). وصول TIRFM الإضاءة من خلال الفتحة العددية عالية (NA 1.45 ألفا خطة-Fluar) النفط 100X، الهدف الغمر.
    2. لTIRFM الإضاءة، وتوظيف متعدد الخطوط (458/488/514 نانومتر) 100 ميغاواط الأرجون ليزر ايون. باستخدام الألياف أحادية الوضع، ويعرض ضوء الليزر الاستقطاب خطيا إلى مسار الشعاع، عبر شريط التمرير TIRF. إدراج شريط التمرير TIRF في الطائرة الحجاب الحاجز الحقل مضيئة من مسار الشعاع ينعكس الضوء.
      1. للإضاءة في حقل واسع، قم بتوصيل المجهر إلى التقليدية مصباح الزئبق قصيرة قوس HBO الضوء الأبيض. A-منظور الحفاظ على الاستقطاب المزدوج في شريط التمرير يضمن الجمع في وقت واحد TIRF الإضاءة والضوء الأبيض.
    3. تصفية ضوء الليزر مع مرشح الإثارة (عرض الفرقة 488/10 نانومتر) التي شنت على عجلة التصفية، التي أدخلت على مسار الليزر. توظيفسرعة عالية، مصراع الكاميرا، التي تسيطر عليها البرنامج للسماح للسيطرة السريعة للإضاءة ليزر. لتحليل pHluorin، جبل عصابة تمر 525/50 نانومتر تصفية الانبعاثات. التقاط الصور الرقمية (512 × 512 بكسل) على كاميرا CCD سريعة يبرد مع صورة ProPlus البرمجيات.
  2. تحقيق TIRF الإضاءة (الشكل 2)
    1. بدوره على أشعة الليزر، والكمبيوتر، والكاميرا، وعجلة التصفية، والتحكم مصراع الكاميرا، ثم، وانتظر 20 دقيقة قبل البدء في التجربة كما تحتاج إلى أشعة الليزر في عملية الاحماء والاستقرار.
    2. قبل التصوير، وجعل حجم مناسب من الحلول التالية.
      1. جعل 50 مل من كريبس (KRH) حل في 125 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1.2 ملي MgSO4، 1.2 ملي KH 2 PO 4، 25 مم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-1-ethanesulfonic حمض (HEPES) (مخزنة ل درجة الحموضة 7.4)، 2 مم CaCl 2، و 6 ملي الجلوكوز.
      2. جعل 10 مل من بوكل-KRH الحل (7.4 درجة الحموضة) في 80 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي بوكل، 1.2 ملي MgSO4، 1.2 ملي KH 2 PO 4و 25 ملي HEPES (مخزنة لدرجة الحموضة 7.4)، 2 مم CaCl 2، و 6 ملي الجلوكوز.
    3. إزالة الغطاء الزجاجي مع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وأدخله في غرفة التصوير المناسبة. تجميع الغرفة وإضافة 500 ميكرولتر من حل KRH في وسط الزجاج.
    4. إضافة زيت على الهدف. ضع غرفة التصوير على مسرح المجهر ووضع الهدف تحت ساترة الزجاج. ضع غطاء آمن على العينة.
    5. في وضع epifluorescence، والتركيز على ساترة (السطح العلوي) واختيار الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وضعت في وسط الغرفة. حدد الخلايا التي يمكن تسجيلها بشكل واضح استخدام وقت التعرض أقل من 80 ميللي ثانية إشارة الفلورسنت.
    6. تحت السيطرة البرمجيات، والتحول إلى TIRF الإضاءة في طريقة العيش.
    7. لتعيين التكوين TIRF، والتحقق من موقف من الحزم التي تنبثق من هذا الهدف، على غلاف العينة (الشكل 2B). عندما يتم وضع شعاع في وسط رانه عدسة الهدف (الشكل 2A، يسار)، بقعة مرئيا في وسط غطاء عينة TIRF (الشكل 2B، يسار) وتصويرها الخلية في وضع epifluorescence (عدة طائرات التركيز، وارتفاع مضان الخلفية؛ الشكل 2C، يسار) .
    8. للوصول إلى زاوية حرجة، نقل بقعة مركزة في اتجاه Y (إلى الأمام أو الخلف، الشكل 2B، وسط) باستخدام المسمار تعديل زاوية على شريط التمرير TIRF (الشكل 1C). عندما يتقاطع شعاع على متن الطائرة العينة في زاوية أكبر من الزاوية الحرجة (الشكل 2A، يمين)، وبقعة يختفي و، رقيقة، خط ركزت على التوالي هو واضح في منتصف غطاء العينة (الشكل 2B، والحق).
    9. لضبط زاوية TIRF استخدام نموذج الخلية (الشكل 2C). مشاهدة صورة مضان على الفيديو، في هذه المرحلة، وهي صورة تشبه epifluorescence لا تزال واضحة. بلطف، حرك المسمار حتى TIRF يخدعويتحقق dition: واحد فقط طائرة البصرية للخلية هي في التركيز (أي غشاء البلازما في اتصال مع غطاء الانزلاق)، وهو ما يؤدي في صورة مسطحة مع التباين العالي (الشكل 2C، يمين).
  3. التصوير عينة
    1. تعيين على قناة واحدة التجربة مرور الزمن. لتقليل photobleaching من، والتقاط الصورة باستخدام منخفضة وقت التعرض ومكاسب عالية. مرات التعرض المناسبة ما بين 40 - 80 ميللي ثانية. الحصول على صور في 1 - 2 هرتز تردد أخذ العينات. قد تكون حركية حويصلة أخذ العينات مقدرة أفضل على التردد العالي (10 هرتز). في الوقت العادي من المراقبة هو عادة 2 دقيقة.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من الحل وسجل خلايا KRH في وضع TIRFM. هذا هو الشرط يستريح. توفير الوقت صور متسلسلة.
    3. التركيز على نفس الخلية وسجل تحت نفس ظروف يستريح (قوة الليزر، والتعرض الوقت، رقم الإطار). بعد خمس الإطارات، إضافة 500 ميكرولتر من حل بوكل-KRH والحفاظ على بوكل في الغرفة.هذا هو الشرط حفز. توفير الوقت صور متسلسلة.

3. تحليل الصورة ومعالجة البيانات

ملاحظة: لتحليل الصور، وقد وضعت وحدات الماكرو في المختبر، استنادا إلى المهام الحالية للبرنامج تحليل الصور. تتوفر وحدات الماكرو مماثلة عبر الإنترنت (URL المقدمة في جدول المواد والمعدات).

  1. كثافة مضان الكمي
    1. استخدام "تسلسل كثافة مضان" ماكرو للكثافة مضان الكمي في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) من الصورة، على مدار الفيلم.
    2. فتح الصور مرة ومتسلسلة. انتقل إلى القائمة الكلية واختر 'تسلسل كثافة مضان. في نافذة "تحليل" يبدو "تحديد العائد على الاستثمار".
    3. اختيار واحد من أدوات التحديد في القائمة لإنشاء ROI. ضع 3 رويس في مناطق من غشاء الخلية من دون نقاط (ROI الخلفية). توظيف ثيالصورة "ROI الخلفية" لتقييم photobleaching من وإلى تعيين الحد الأدنى لتحليل الحدث الانصهار (الشكل 3A).
  2. photobleaching من التصحيح وتحديد العتبة (الشكل 3B)
    1. لتقييم photobleaching من فتح مضان الصفوف كثافة "رويس الخلفية"، (الشكل 3BA). تطبيع قيم الكثافة مضان في كل إطار لقيمة كثافة الأولية (F0) (F / F0) (الشكل 3BB). متوسط ​​القيم.
    2. تسليط الضوء على متوسط ​​البيانات وإنشاء خط المؤامرة باستخدام الخيارات القائمة الرسم البياني.
    3. من القائمة تحليل البيانات، حدد "خط الاتجاه" لفتح الحوار تحليل المؤامرة. حدد نوع الانحدار. تعيين الانحدار "أسي". ثم حدد "معادلة العرض على الرسم البياني". في نافذة الرسم البياني، تظهر المعادلة الأسية ويتم تعيين القيم المعلمة تلقائيا، (الشكل 3Bc ).
    4. تطبيق تصحيح الأسي لقيم الكثافة في كل إطار على النحو التالي:
      الجبهة الوطنية (تصحيح) = الجبهة الوطنية / إكسب (-n * أ)
      الجبهة الوطنية = التجريبية كثافة مضان تقاس في إطار ن. ن = عدد الإطارات. و= عامل التبييض (ثابتة التعبير عن معدل فقدان كثافة بسبب photobleaching من.   الرقم 3BD).
    5. لضبط عتبة، فتح "ROI الخلفية" تطبيع وتصحيح، وحساب متوسط ​​إشارة مضان والانحراف المعياري لها (SD). متوسط ​​قيمة بالإضافة إلى 3 SD تمثل عتبة (الشكل 3BE). استخدام هذه العتبة لتحليل البيانات.
  3. اختيار الأحداث الانصهار باستخدام إجراء شبه
    1. فتح الصور مرة ومتسلسل مع برنامج تحليل الصور. تطبيق عامل تصفية جاوس إلى تسلسل الصور النشط.
    2. تحليل الصور باستخدام أداة "عد الأشياء" أو ماكرو الذي يسمح للاختياركائن الذين لديهم متوسط ​​كثافة مضان ضمن مجموعة محددة بكسل. تعيين كثافة تتراوح يدويا، وذلك باستخدام وظيفة العتبة (انتقل إلى القائمة شريط، تعيين مقياس → عتبة لتسليط الضوء على مجال الاهتمام). عتبة كافية هي 30٪ خلال إشارة الخلفية الفلورسنت المحلية.
    3. تطبيق ماكرو "مرشحات الأجسام" لتحديد الأجسام الوحيدة التي تستوفي المعايير التالية:
      1. تطبيق الخيار نطاقات (دقيقة والحد الأقصى ضمنا) لالجانب. تقارير الجانب النسبة بين المحور الرئيسي والمحور البسيط ما يعادل القطع الناقص إلى الكائن. الجانب هو دائما ≥1. القيم الكافية هي دقيقة = 1، الحد الأقصى = 3.
      2. تطبيق نطاقات لقطر. قطر تقارير متوسط ​​طول أقطار قياسها على فترات درجة اثنين من الانضمام نقطتين الخطوط العريضة والتي تمر عبر النقطه الوسطى للكائن. تعيين نطاق بالبكسل (أو في ميكرون، إذا كان استخدام نظام معايرة).
      3. تعريف نطاق الأمثل في preliminتجارب آري: تحديد يدويا البقع من الفائدة ومن ثم قياس قطرها باستخدام وظيفة الملف الشخصي المؤامرة.
    4. حدد "عرض الكائنات": سوف تظهر الكائنات المحددة فرضه على الصورة TIRFM (الشكل 4B).
    5. تدرج في التحليل فقط تلك البقع التي تظهر قصيرة (1-3 إطارات) زيادة عابرة في كثافة مضان، تليها مباشرة خسارة ملحوظة من إشارة (بقع عابرة). توظيف اختيار دائرية لإنشاء ROI قطرها حوالي بقعة واحدة شعاعيا حول اختيار حويصلة / البقع (رويس التجريبي). تنفيذ هذه الخطوة يدويا.
    6. مع رويس مختارة، وحساب متوسط ​​كثافة مضان من كل ROI على مدار الفيلم.
  4. تحليل البيانات (الشكل 3C-D)
    1. تصدير بالطبع وقت التغييرات مضان يقاس في كل "ROI التجريبية" إلى جدول بيانات. (الشكل 3DA). تطبيع قيمة كثافة في كل إطار لشدة الأولية مضان (F / F0)، (الشكل 3DB).
    2. تطبيق تصحيح الأسي لقيم الكثافة في كل إطار كما ذكرت في الخطوة 3.2.4 (الشكل 3DC).
    3. لحساب عدد من الأحداث الانصهار (رقم ذروة)، ومرة ​​يحدث كل الانصهار (العرض ذروة) واتساع ذروة الفلورية (ارتفاع الذروة وAUC) تطبيق وظائف منطقية باستخدام جدول بيانات أو الرياضيات الحزم. وذكر مثالا على تحليل الحدث الانصهار باستخدام الصيغ المنطقية في الشكل 3Dd و3DE.
    4. نفترض زيادة كثافة مضان تتجاوز عتبة (شدة متوسط ​​مضان الخلفية ± 3SD)، والانصهار الحويصلة إلى غشاء البلازما وذروة الناتج كما حدث الانصهار.
    5. حساب العرض الذروة كما الفرق بين الماضي وقيمة X الأولى من كل الذروة. تتضاعف هذه القيمة ل1 / (تردد أخذ العينات). النظر في هذه القيمةهذه هي المرة الانصهار الحويصلة والتصاق في غشاء البلازما قبل حويصلة إعادة تحمض وإعادة التدوير (الشكل 3Dd).
    6. حساب AUC خلية كاملة باعتبارها مجموع القيم على العتبة. تنظر هذه القيمة كما صافي التغيير الفلورسنت خلال مدة التسجيل بسبب عفوية (يستريح) أو أثار (حفز) النشاط متشابك.
    7. حساب ارتفاع الذروة بالفرق بين القيمة ذ القصوى من كل الذروة والعتبة. تنظر هذه القيمة كما يدل على نوع الانصهار (واحد في وقت واحد مقابل الانصهار متسلسل / أو عابر مقابل الانصهار الكامل).

النتائج

وقد صممت هذه الإجراءات التصوير TIRF وتحليل البيانات ووصف لدراسة الحويصلات ديناميكية في الأنظمة الخلوية. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد آثار يشير الجزيئات والمخدرات على الأحداث الانصهار وديناميكية العصبي حويصلة 17. باستخدام بروتينات غشاء البلازما الموسومة GFP، ...

Discussion

وتعرض هذه الورقة على بروتوكول لصورة وتحليل ديناميات الحويصلات في الخلايا المفرزة، وذلك باستخدام ناقلات ترميز [كدنا الفلورسنت وTIRFM. العناصر الرئيسية في التصوير الناجحة التي قام بها TIRFM هي اختيار نموذج الخلوية وترنسفكأيشن الخلية مع المؤشرات البصرية المشفرة وراثي?...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أنوه جامعة ديلي ستودي دي ميلانو لدعم إليانا دي Cairano (زمالة ما بعد الدكتوراه) وستيفانيا موريتي (زمالة الدكتوراه). وأيد هذا العمل من قبل برنامج أبحاث جامعة PUR لCP

ونود أن نشكر البروفيسور جيريمي م هينلي، كلية الكيمياء الحيوية، جامعة بريستول، المملكة المتحدة، لpHluorin بناء والدكتور Dotti فرانشيسكو للمساعدة في تحليل البيانات، وسيلفيا Marsicano للحصول على المساعدة الفنية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Axio Observer Z1Zeiss491912-9850-000inverted microscope
http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
Multiline Argon Laser Lasos 77Lasos00000-1312-752multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser
http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
Laser TIRF sliderZeiss423681-9901-000http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100x ObjectiveZeiss421190-9900-000Oil, NA 1.45 Alpha-Plan
https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421
190-9900-000&ss=1
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 QImaginghttp://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutterSutter Instrument Companyhttp://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
Software
Image ProPlus 6.3 SoftwareMedia Cyberneticsspot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination
http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
ExcelMicrosoftphotobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses
http://office.microsoft.com/it-it/excel/
GraphPad Prism 4.00 GraphPad Software, Inc.statistical analysis
http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/

References

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  3. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  4. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  5. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
  6. Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
  7. Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
  8. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
  12. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  13. Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  14. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
  15. Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
  16. Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
  17. Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
  18. D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
  19. Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
  20. Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
  21. Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
  22. Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
  23. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).
  24. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

95 pHluorin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved