TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

요약

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

초록

시냅스 소포가 융합 및 검색의 동적 사이클을 화학적 시냅스에서 신경 전달 물질을 방출. 실시간 시냅스 활성을 모니터링하고 단일 소포 수준에서 엑소 엔도 시토 시스의 여러 단계를 해부하면 건강과 질환에서 시냅스 기능을 이해하는데 중요하다.

직접 시냅스 소포 및 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)을 대상으로 pH 민감성 프로브 소포 역학을 수행하는 데 필요한 공간 - 시간 해상도를 제공을 유전자 인코딩. 내부 전반사에 의해 생성 산장은 엑소 엔도 시토 시스의 과정이 일어나는 정확한 위치, 세포가 접착 된 커버 유리 위에 박층 (<150 ㎚)에 배치 된 형광체를 여기 할 수있다. 얻어진 높은 콘트라스트 이미지는 이상적으로 추적 소포 융합 이벤트의 정량 분석​​에 적합하다.

이 프로토콜에서는, SH-SY5Y 인간의 Neuroblastoma 세포 때문에 평평한 표면, TIRFM에 의해 단일 ​​소포 수준에서 신경 전달 물질 방출을 연구하기위한 귀중한 모델과 분산 된 소포의 존재로 제안된다. 부착 세포로 SH-SY5Y 성장과 synapto-pHluorin로 형질 감염에 대한 방법은 TIRFM 및 이미징을 수행 할 수있는 기술뿐만 아니라, 제공됩니다. 마지막으로, 개수를 선택하고, 전체 셀 및 단일 소포 수준에서 융합 이벤트를 분석하는 것을 목표로 전략을 제시한다.

이미지를 만드는 절차 및 데이터 분석 방법의 유효성을 검사하기 위해, pHluorin 태그가 소포의 역학은 휴식에서 분석하고 조건 (칼륨 농도 탈분극) 자극. 막 탈분극 융합 이벤트의 빈도를 증가시키고, 전체 셀 내에 기록 순 형광 신호의 병렬 인상을 야기한다. 단일 소포 분석 융합 이벤트 동작 (증가 피크의 높이와 폭)의 수정을 보여준다. 이 자료는 제 제안칼륨 탈분극에 엄청난 신경 전달 물질 방출을 유도뿐만 아니라 소포 융합 및 재활용의 메커니즘을 수정 아닙니다.

적절한 형광 프로브,이 기술은 항시 분비 자극 메커니즘을 해부 다른 셀룰러 시스템들에서 사용될 수있다.

서문

신경 세포 사이의 화학 시냅스 전달은 신경 시스템의 통신의 주요 메커니즘이다. 이 시냅스 사이트에서 소포 융합 및 검색의 동적 사이클을 통해 신경 전달 물질의 방출에 의존한다. 소포 역학에 관여하는 단백질의 대부분은 확인되었다; 그러나, 현상에 특정 공헌 ¹ 명확히 남아있다.

이해 부분적 엑소 / 엔도 사이토 시스에 가장 널리 사용되는 분석은 항상 가장 적합하지 않은 사실에 의해 제한된다. 여러 소포 융합 관련 연구와 역학 전기 생리 기술에 의존하고있다. 이 기술은 최적의 시간 해상도를 제공하며 세포막에 소포 초기 융합을 조사하는 우수하지만 연접 기능을 지원하는 기본 분자 많은 이벤트를 감지 할 수있다. 전자 현미경은, 다른 측면에서, 최고의 morphologica을 제공합니다시료를 분석하기 위해 고정되어야하기 때문에 각 스텝 단수이지만 이벤트의 동적 양태의 설명은 L, 포착 할 수 없다.

형광 분자 프로브 개발 ^4-6의 발전과 함께 새로운 광 기록 기술 ^2,3의 출현, 따라서 시냅스 구조 및 기능에 대한 정보를 제공하는 새로운 수준, 생균의 exocytic 프로세스 시각화 할 수있다.

초기 연구 악용 활동에 의존 스티 릴 염료 (FM1 - 43 및 관련 유기 염료) ^7,8. 최첨단 영상 기술은 내강 소포 단백질 ⁹ 닿는 녹색 형광 단백질 (GFP) (pHluorin)의 pH 민감성 변종을 사용합니다. 이 프로브는 일반적으로 낮기 때문에 내강의 pH의 소포에 존재하는 경우 꺼져 있습니다. 세포막과 융합 후, 소포 내부는 중성 세포 외 공간에 노출된다 산도 갑자기, 증가 pHluorin의 양성자에 의존 담금질을 완화하고, 형광 신호가 빠르게 나타납니다. pHluorin 변화 형광 증가를 모니터링함으로써, 융합 이벤트보다 빠르기 때문, 막과 소포 융합 측정하고 분석 할 수있다. 표면 pHluorin 태깅 분자 endocytosed되므로 형광 신호는 이후, 따라서 동일한 구조가 소포 ^{9 재활용을} 모니터링하도록 또한 사용될 수있다, 기저 레벨로 되돌아 간다.

베지 태그 pH의 센서 만 실제로 세포막과 융합 그 소포 시각화을 보장하면서, 높은 시공간 해상도 이미징은 상세 엑소 / 이입 과정에 관련된 단계를 설명하는 데 필요하다. 필요한 시공간 해상도를 제공하는 광학 기술은 전반사 형광 현미경 (TIRFM), 형광 현미경 ^(10)의 애플리케이션이다.

"> 내부 전반사가 광 통로가 임계각보다 큰 입사각으로 유리 커버 슬립에 도달 유리 커버 슬립 샘플. 사이의 계면에서 발생 된 여기 광은 샘플에 송신되지만되지 않는다 완전히 다시 반영. 이러한 조건, 계면에서의 에바 네 센트 광 웨이브 형태 및 아래 산장의 강도의 침투 깊이 (계면으로부터의 거리와 함께 지수 함수 적으로 감소있다. 이하의 광학 밀도 (샘플)과 매질에서 전파 멀리 경계로부터 사람들은 GFP-제물로 형질 세포에서.없는 동안 약 100㎚) 커버 슬립에 가장 가까운 근방에만 형광체가 여기 될 수 있으며, 이러한 깊이는 세포막에 발현 된 단백질 또는 소포 성 구조에 대응 셀 내부에 형광 물질이 여기 될 수 없기 때문에, 배경 형광을 최소화하고, 화상이 매우 높은 신호 / 배경 쥐된다. 그것에 접근IO ^(11)을 형성한다.

몇 가지 특성은 소포 역학 모니터링을위한 선택의 TIRFM 기술을합니다. 완벽한 콘트라스트 및 높은 신호 대 잡음비는 단일 소체로부터 도출 매우 낮은 신호들의 검출을 허용한다. 각 프레임에 칩 기반 이미지 획득은 매우 동적 인 프로세스를 검출 할 필요 시간 해상도를 제공한다. 마지막으로, 샘플의 다른면에서 빛 세포의 최소한의 노출은 강하게 광독성을 줄이고 오래 지속 시간 경과 기록 ^(12)을 수 있습니다.

데이터 분석이 기술의 가장 도전적이고 중요한 측면 남아있다. 소포 융합을 모니터링하는 간단한 방법은 ¹³ 시간 동안, 세포 표면에 형광 리포터 단백질의 축적을 측정하는 것이다. 물론 융합 증가 순 형광 신호가 증가함에. 그러나,이 방법은 특히 큰 셀에서 및 휴식 조건에서, 공정을 과소 수도엔도 시토 시스와 광표백 프로세스 인해 엑소 사이토 시스 소포로 형광 강도의 증가를 상쇄하기 때문이다. 다른 방법은 각각의 단일 융합 이벤트 ^(14)을 따르는 것입니다. 이 후자의 방법은 매우 민감하고 융합 메커니즘에 대한 중요한 세부 사항을 공개 할 수 있습니다. 완전히 자동화 된 절차는 소포를 따라 자신의 형광 신호의 변동을 등록 항상 사용할 수 없기 때문에 그러나, 하나의 이벤트의 수동 선택이 필요합니다. 소포 역학 관측은 높은 주파수에서 샘플링 세포가 필요합니다. 이것은 거의 직접 분석 할 수없는 대량의 데이터를 생성한다.

이 논문의 제안은 모두, 실험실에서 개발 된 절차는 데이터를 분석하기 위해 SH-5YSY 신경 아세포종 세포주에서 기저 및 자극을 신경 전달 물질 방출을 모니터링 TIRFM 영상 법을 최적화하고 설명하는 단계별이고 전체 셀 및 단일 소포 수준.

프로토콜

1. 세포 배양 및 형질

1. SH-SY5Y 세포 배양
   주 : 실험 SY5Y 인간 신경 아세포종 SH- (ATCC # CRL-2266) ^(15)를 사용하여 수행되었다. SH-SY5Y 세포는 부동 클러스터 및 부착 세포의 혼합물로서 성장한다. 단단히 TIRFM 위해 매우 중요 유리 커버에 부착 성장 세포를 가지고 프로토콜 (셀 밀도, 분할 비율, 등.)에보고 된 지시 사항을 따르십시오.
   1. 시작하기 전에, 층류 생물 안전성 캐비닛 하에서 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 배양 배지의 부피를 좋은 기회.
      1. 150 mM의 NaCl을, 24 mM의 인산염 완충액, pH가 7.4의 농도로 PBS 50 ㎖를 확인합니다. 솔루션을 필터링합니다.
      2. 고 글루코스, 10 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린 (100 U / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎍ / ㎖), L- 글루타민 (가진 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 세포 배지 50 mL로 2 mM)을하고피루브산 나트륨 (1 mM)을. 솔루션을 필터링합니다.
   2. 완전한 성장 배지를 제거하고 PBS의 3 ㎖로 세포를 씻어.
   3. 37 ° C에서 5 분 (6cm 페트리 접시)에 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 2 ㎖ (EDTA)와 세포를 품어 5 % CO _2를 피펫을 사용하여 세포를 분리.
   4. 2 ml의 DMEM을 첨가함으로써 트립신을 비활성화하고, 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집한다.
   5. 단일 세포 현탁액으로 세포를 분산시키는 것이 충분히 아래로, 상층 액을 제거 펠릿 DMEM 1 ㎖를 추가하고, 용액을 피펫.
   6. 전체 매체의 3 ㎖를 포함하는 새로운 6cm 직경 페트리 접시에 4 : 그들에게 일을 분할합니다. 5 % CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서, 6cm 직경 배양 접시에서 배양 세포를 유지한다. 일주일에 한 번씩 서브 배양 또는 80 덮여 때 - 표면적의 90 %.
2. 이미징을위한 SH-SY5Y 세포 도금
   1. TIRFM 실험의 경우, 판커버 글래스 상 세포. 고용 유리는 0.17 ± 0.005 mm 두께 1.5255 ± 0.00015 굴절률 다룹니다. 시작하기 전에 다음과 같이 커버 글라스를 준비 :
      1. 유리 청소 90 % 에탄올, O / N로 다룹니다.
      2. 증류수 (증류수 3 번)에 철저히 씻어. 드라이 유리 건조 오븐에서 다룬다.
      3. 장소는 유리 페트리 접시에서 커버하고 3 시간 동안 200 ° C로 예열 된 오븐에서 소독.
   2. 일 형질 감염 전에, 3.5 cm 페트리 접시에 각 커버 슬립을 배치 배지 1 ㎖를 추가하고, 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양한다.
   3. 1.1.5, 완전 배지 1 ㎖로 세포 펠렛을 중단하고 카운트 - 단계 1.1.3에 기재된 바와 같이 세포를 Trypsinize. 잘 / 3 × 10 ⁵ 세포를 산출하기 위해 각 페트리 접시에 추가 세포 현탁액의 올바른 볼륨을 계산합니다. 이 밀도는 세포의 최적 성장 및 효율적인 형질 전환에 필요한. 37 ° C에서 품어5 % CO ₂ 배양기 O / N에서.
3. 폴리에틸렌 이민으로 SH-SY5Ytransfection (PEI)
   참고 : 시냅스 소포 역학을 시각화하려면, synapto - pHluorin를 포함 pCB6 벡터가 사용되었습니다. synapto-pHluorin 녹색 형광 단백질 (GFP) ^(16)와 구조가 광범위하게 뉴런 ⁽⁹⁾ 내에서 시냅스 소포 특성을 조사하기 위해 사용 된 2 시냅 토브 기공을 막 단백질의 pH에 민감한 변형의 프레임 융합에 의해 생성되었습니다.
   1. 형질 전환을 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 10 ㎖를 확인합니다. 1개월으로 최대로 솔루션을 유지합니다.
      1. 150 mM의 NaCl 용액을 확인합니다. 0.01 N 염산으로 pH 5.5로 조정합니다.
      2. 150 mM의 NaCl 용액에 10 % 폴리에틸렌 이민 (25 kDa의 선형 PEI)에서 PEI 솔루션을합니다. 용액의 pH는 8.8로 상승한다. 0.01 N HCl로 7.8 산도를 조정합니다.
   2. 도금 후 24 시간, 배지를 제거하고 1.5 ml의 새로완전 배지. 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 유지.
   3. 층류 생물 안전성 캐비닛에서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에, 150 mM의 NaCl 용액 25 μL 및 3.5 cm 페트리 접시 당 PEI 용액 100 ㎕로 플라스미드 DNA 3㎍을 추가.
   4. 와동 10 초 후, RT에서 30 분 동안 DNA / PEI 혼합물을 배양한다.
   5. 조심스럽게 세포와 커버 슬립을 함유하는 페트리 접시로 DNA / PEI 혼합물을 추가하고 부드럽게 동일 배양 접시에서 시약을 분배 흔들어.
   6. 4 시간 후에 배지를 변경하고, 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 O / N을 배양한다. 형질 전환 후 48 시간 - 이미징 실험 24을 수행합니다.

총 내부 반사 형광 현미경 2. 세포 이미징 (TIRFM)

1. 영상 설정
   1. 그림 1에 설명 된 셋업과 TIRF 이미징을 수행합니다. 그것은 거꾸로 모터 구성현미경 (도 1, 인셋), 레이저 소스 (도 1, 인셋 B) 및 TIRF-슬라이더 (도 1, 인셋 C). 높은 개구 수 (NA 1.45 - 알파 플랜 Fluar) 100X 오일, 침지 대물 통해 TIRFM 조명에 도달한다.
   2. TIRFM 조명용, 멀티 라인 (458/488/514 ㎚) 100 mW의 아르곤 이온 레이저를 이용한다. 모노 모드 광섬유를 사용 TIRF 슬라이더를 통해, 빔 경로에 직선 편광의 레이저 광을 소개한다. 반사 된 빛의 빔 경로의 발광 필드 격막면에 TIRF 슬라이더를 삽입합니다.
      1. 넓은 필드 조명의 경우, 기존의 수은 쇼트 아크 램프 HBO 흰색 빛에 현미경을 연결합니다. 슬라이더의 편파 유지 이중 프리즘 TIRF 조명과 백색광의 동시 결합을 보장한다.
   3. 여기 필터 (밴드 폭 10분의 488 ㎚)와 레이저 광 필터 레이저 경로에 도입 필터 휠에 탑재. 고용고속, 소프트웨어 제어, 셔터는 레이저 조명의 빠른 제어를 가능하게합니다. pHluorin 분석을 위해, 밴드 50분의 525 nm의 방출 필터를 통과 마운트합니다. 이미지 PROPLUS 소프트웨어 냉각 고속 CCD 카메라에 디지털 이미지 (512 X 512 픽셀)를 캡처합니다.
2. TIRF 조명을 달성 (그림 2)
   1. 레이저, 컴퓨터, 카메라, 필터 휠, 셔터 컨트롤러를 켭니다; 다음, 레이저는 따뜻하게하고 안정을 필요로하는 실험을 시작하기 전에 20 분을 기다립니다.
   2. 촬영하기 전에 다음과 같은 솔루션의 좋은 기회 볼륨을 확인합니다.
      1. 1.2 mM의 KH ₂ PO _4, 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산 (HEPES) (완충액을 125 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1.2 mM의 MgSO4로에서 크렙스 (KRH) 용액 50 mL로 하여 pH 7.4), 2 mM의 _CaCl2를, 6 mM의 포도당.
      2. 80 mM의 염화나트륨, 50 mM의 KCl을, 1.2 mM의 황산, 1.2 mM의 KH ₂ PO _4에서의 KCl-KRH 솔루션 (PH 7.4) 10 mL로25 mM의 HEPES는, 2 mM의 _CaCl2를, 6 mM의 포도당 (7.4의 pH로 완충).
   3. 형질 세포와 유리 커버를 제거하고 적절한 영상 실에 삽입합니다. 챔버를 조립하고 유리의 중앙에 KRH 용액 500 μL를 추가한다.
   4. 목표를 통해 오일을 추가합니다. 현미경의 무대에 영상 실을 놓고 유리 커버 슬립 아래의 목적을 놓습니다. 샘플을 통해 안전 커버를 배치합니다.
   5. 표면 형광 모드에서, 커버 슬립 (상면)에 초점을 실 중앙에 배치 형질 감염된 세포를 선택합니다. 그의 형광 신호 분명히 80 밀리 초 미만의 노출 시간을 사용하여 기록 될 수있는 셀을 선택.
   6. 소프트웨어 제어, 라이브 모드에서 TIRF 조명으로 전환합니다.
   7. TIRF 구성을 설정하려면, 샘플 커버 (그림 2B)에, 목적에서 나오는 빔의 위치를 확인합니다. t는 빔의 중심에 위치 할 때그 대물 렌즈 (좌측도 2a)은, 스폿 (왼쪽,도 2B) TIRF 샘플 커버의 중앙에 표시되고 셀 표면 형광 모드에 이미징된다 (몇몇 포커스 평면, 높은 배경 형광도 2C, 왼쪽) .
   8. 임계각에 도달하기 위해, Y 방향으로 집광 스폿을 이동 (전방 또는 후방도 2B, 중앙) TIRF 슬라이더 (도 1C)에 각도 조절 나사를 이용. 빔 (우측도 2a) 임계각보다 큰 각도로 시료면에 집광함으로써, 스폿은 사라지고 직선, 얇은 초점 선 (우측도 2B) 샘플 덮개의 중앙에 분명하다.
   9. 미세 조정하려면 TIRF 각도는 세포 샘플 (그림 2C)를 사용합니다. 이 단계에서, 표면 형광 같은 이미지가 여전히 표시, 비디오의 형광 이미지를보세요. 부드럽게, TIRF 콘 때까지 나사를 이동dition 달성된다 : 셀의 단지 하나의 광학면은 포커스 (즉, 커버 슬립에 접하는 플라즈마 막),이 (오른쪽,도 2C) 콘트라스트가 높은 평면 화상 결과이다.
3. 샘플 영상
   1. 단일 채널 시간 경과 실험을 설정합니다. photobleaching에 최소화하기 위해, 낮은 노출 시간 및 높은 이득을 이용하여 이미지를 캡처. 80 밀리 초 - 적절한 노출 시간은 40 사이입니다. 2 Hz의 샘플링 주파수 - 1에서 이미지를 획득. 소포 반응 속도는 더 높은 주파수 (10 Hz에서)에서 더 극명하게 샘플링 할 수있다. 관찰 일정한 시간은 통상 2 분이다.
   2. TIRFM 모드에서 KRH 솔루션 및 기록 세포의 500 μl를 추가합니다. 이 휴식 상태이다. 시간 순차 이미지를 저장합니다.
   3. 휴식의 동일한 조건 (레이저 파워, 노출 시간, 프레임 번호)에서 동일한 셀 기록에 초점을 맞 춥니 다. 다섯 프레임 후, KCl을-KRH 솔루션의 500 μl를 추가하고 챔버에서의 KCl을 유지합니다.이것은 자극 된 상태이고; 시간 순차 이미지를 저장합니다.

3. 이미지 분석 및 데이터 처리

주 : 이미지를 분석하기가 매크로 이미지 분석 소프트웨어 기존의 기능에 기초하여, 실험실에서 개발되었다; 비슷한 매크로 온라인 (재료 및 장비의 표에서 제공하는 URL)를 사용할 수 있습니다.

1. 형광 강도 정량화
   1. 동영상의 과정을 통해, 이미지 관심 영역 (ROI)의 영역에서 형광 강도 정량화 "시퀀스 형광 강도"매크로를 사용.
   2. 시간 순차 이미지를 엽니 다. 매크로 메뉴로 가서 '시퀀스 형광 강도'를 선택합니다. '분석'창에서 "투자 수익 (ROI)을 선택합니다"가 나타납니다.
   3. 투자 수익 (ROI)을 생성하기 위해 메뉴에서 선택 도구 중 하나를 선택합니다. 관광 명​​소 (배경 ROI)없이 세포막의 지역에서 3 ROI를 배치합니다. 생을 고용S "배경 ROI"광표백을 평가하고 융합 이벤트 분석 (도 3A)에 대한 임계 값을 설정.
2. 광표백 수정 및 임계 값 결정 (그림 3B)
   1. 광표백을 평가하기 위해 형광 강도 행 "배경 ROI를", (그림도 3B)을 엽니 다. 초기 강도 값 (F0) (F / F0) (도 3BB) 각 프레임에서 형광 강도 값을 정규화한다. 값을 평균.
   2. 평균 데이터를 선택하고 차트 메뉴 옵션을 사용하여 선 그림을 만듭니다.
   3. 데이터 분석 메뉴에서 플롯 분석 대화 상자를 엽니 다 "추세선"를 선택합니다. 회귀의 유형을 선택합니다. 설정 "지수"회귀. 그런 다음 "차트에 표시 방정식"을 선택합니다. 그래프 창에서, 지수 방정식이 나타나고 매개 변수 값이 자동으로 (그림 3BC 할당 ).
   4. 다음과 같이 각각의 프레임의 휘도 값으로 보정 지수 적용 :
      FN은 (수정) FN / 애 썼는데 = (α *)
      FN = 프레임 N에서 측정 실험 형광 강도; N = 프레임 수; photobleaching에 의한 강도로 손실율을 발현 = 표백 계수 (정수;   그림 3BD).
   5. 임계 값을 설정하려면, 정규화 및 수정 "배경 투자 수익 (ROI)을"열기 평균 형광 신호 및 표준 편차 (SD)를 계산한다. 3 SD 플러스 평균값은 임계 값 (도 3Be)을 나타낸다. 데이터 분석이 임계 값을 사용합니다.
3. 반자동 절차를 이용하여 융합 이벤트의 선택
   1. 이미지 분석 소프트웨어와 시계열 화상을 연다. 활성 이미지 시퀀스에 가우시안 필터를 적용합니다.
   2. 을 선택할 수 있습니다 도구 "개체를 계산"또는 매크로를 사용하여 이미지를 분석픽셀들이 정의 된 범위 내에서의 평균 형광 강도를 가지고 개체. 수동 임계 함수를 사용 범위 설정 강도 (바 메뉴로 이동을, 계수 설정 → 임계치는 관심 영역을 강조하기 위해). 적절한 임계 값은 로컬 형광 배경 시그널이 30 % 이상이다.
   3. 매크로는 다음과 같은 기준을 충족 객체 만 선택 "개체를 필터"적용 :
      1. 측면에 대한 범위 옵션 (최소 및 최대 포함)를 적용합니다. 양태는 장축과 객체 타원 상당의 보조 축 간의 비율을보고한다. 화면은 항상 ≥1. 적절한 값은 분 = 1, 최대 = 3이다.
      2. 직경에 대한 범위를 적용합니다. 두 직경도 구간 두 윤곽 점 접합과 물체의 중심을 통과하는 직경 측정의 평균 길이를보고한다. 픽셀 범위를 설정 (또는 μm의에서, 보정 시스템을 사용하는 경우).
      3. prelimin에서 최적의 범위를 정의진 실험 수동 관심 지점을 선택하고 플롯 프로파일 함수를 사용하여 직경을 측정한다.
   4. "표시 객체"를 선택 : 선택된 개체가 TIRFM 이미지 (그림 4B)에 중첩되어 나타납니다.
   5. 분석 만 짧은 (1-3 프레임) 표시 스폿 즉시 신호 (과도 스폿)의 현저한 손실이어서 형광 강도 일시적인 증가를 포함한다. 선택한 소포 ​​/ 스팟 (실험의 ROI) 주위에 약 한 스폿 직경 반경 투자 수익 (ROI)을 생성하기 위해 원형 선택을 사용한다. 수동으로이 단계를 수행합니다.
   6. ROI 영역을 선택하면, 영화에 걸쳐 각 ROI의 평균 형광 강도를 계산한다.
4. 데이터 분석 (도 3C-D)
   1. 스프레드 시트에 각 "실험적인 투자 수익 (ROI)"에서 측정 된 형광 변화의 시간 코스를 보냅니다; (그림 3DA). 초기 형광 강도 (F / F0) (도에서 3dB)에 대한 각 프레임의 강도 값을 정규화한다.
   2. 단계 3.2.4 (도 3DC)에보고 된 각 프레임의 강도 값의 지수에 보정을 적용한다.
   3. 융합 이벤트들의 총 수 (피크 수), 각각의 융합이 발생 시간 (피크 폭)와 형광 피크 (피크 높이 및 AUC)의 진폭을 계산하기 위해 스프레드 시트 또는 수학 패키지를 사용하여 논리 함수를 적용한다. 논리식을 사용하여 융합 이벤트 분석의 일례가도 3Dd 및 3DE에보고된다.
   4. 원형질막 소포 융합과 같은 임계 값 (평균 ± 3SD 배경 형광 강도)를 초과 형광 강도의 증가와 융합 이벤트로 인한 피크를 가정한다.
   5. 마지막으로 각 피크의 제 x 값의 차이로서 피크 폭을 계산한다. 1 / (샘플링 주파수)이 값을 곱합니다. 이 값을 고려소포 다시 산성화 및 재활용 (도 3Dd) 전에 세포막에서 소포 융합 및 부착 시간이야.
   6. 임계 값 이상의 값의 합으로 전체 세포 AUC를 계산합니다. 때문에 자연 (휴식)에 녹화 시간 동안 순 형광 변화 또는 유발 (자극) 시냅스 활동이 값을 고려하십시오.
   7. 각 피크 및 임계치 Y의 최대 값 사이의 차이로서 피크 높이를 계산한다. 융합 형 (대 단일 동시 / 순차 융합 또는 과도 대 전체 퓨전)의이 값으로 나타내는 것이 좋습니다.

결과

설명 TIRF 이미징 및 데이터 분석 절차는 셀룰러 시스템에서 소포 역학을 연구하기 위해 설계되었습니다. 이 기술은 융합 이벤트 및 신경 전달 물질 소포 ⁽¹⁷⁾ 상에 분자 역학 및 약물 시그널링의 효과를 결정하기 위해 사용될 수있다. GFP 표지 된 세포막 단백질 사용 TIRFM 분석 교세포에서 GFP 표지 된 글루타메이트 수송 상피 세포 ^(18,19)의 구성 적 특징을 거래하기 위해 사용되어왔다....

토론

이 논문은 이미지에 프로토콜을 제시하고, 형광 cDNA를 인코딩 벡터와 TIRFM를 사용하여, 분비 세포에서 소포 역학을 분석 할 수 있습니다. TIRFM에 의해 성공적으로 영상의 핵심 요소 소포 자료 및 재활용의 유전자 인코딩 광학 지표와 셀룰러 모델과 세포 형질의 선택입니다.

TIRFM는 이상적으로 유리 커버에 부착 성장과 세포막과 융합 이벤트의 안정적인 시각화를 허용하기에 충...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
Multiline Argon Laser Lasos 77	Lasos	00000-1312-752	multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
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