TIRFM и рН-чувствительные GFP-зонды для оценки нейромедиатора пузырька динамики в SH-SY5Y клеток нейробластомы: Сотовый изображений и анализ данных

Резюме

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

Аннотация

Synaptic пузырьки выпустить нейротрансмиттеров на химических синапсов с помощью динамического цикла синтеза и поиска. Мониторинг синаптической активности в режиме реального времени и рассечения различные этапы экзо-эндоцитоза на уровне одного пузырька имеют решающее значение для понимания синаптические функции в норме и патологии.

Генетически кодируется рН-чувствительных датчиков, непосредственно направленные на синаптических пузырьков и полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM) обеспечивают пространственно-временным разрешением необходимую для отслеживания динамики пузырьков. Мимолетны поле, создаваемое полного внутреннего отражения может только возбудить флуорофоров, размещенные в тонком слое (<150 нм) выше стеклянной крышкой, на которой клетки придерживаться именно там, где имеют место процессы экзо-эндоцитоза. В результате высокая контрастность изображения идеально подходит для пузырьков отслеживания и количественного анализа событий слияния.

В этом протоколе, SH-SY5Y человек пeuroblastoma клетки предлагаются в качестве полезной моделью для изучения высвобождение нейромедиаторов на уровне одного пузырька по TIRFM, из-за их плоской поверхности и в присутствии дисперсных пузырьков. Способы выращивания SH-SY5Y как адгезивные клетки, а также для трансфекции их synapto-pHluorin предоставляются, а также методики для выполнения TIRFM и визуализации. Наконец, стратегия стремится выбрать, рассчитывать и анализировать события в стиле фьюжн в уровнях цельноклеточных и одного пузырька представлены.

Для проверки метода анализа процедуры визуализации и передачи данных, динамика pHluorin-меченых везикул анализироваться в рамках отдыха и стимулировали (деполяризующими концентрации калия) условия. Деполяризацию мембраны увеличивает частоту событий слитых и вызывает параллельное повышение чистого сигнала флуоресценции, записанной в целой клетки. Анализ Single-пузырек показывает изменения поведения Fusion-событий (увеличение максимальной высоты и ширины). Эти данные свидетельствуют о йв деполяризации калия не только вызывает массовое освобождение нейромедиатора, но также изменяет механизм слияния пузырьков и утилизации отходов.

При соответствующей флуоресцентного зонда, эта техника может быть использована в различных клеточных системах рассекать механизмы конститутивной и стимулированную секрецию.

Введение

Химический синаптической передачи между нейронами является основным механизмом связи в нервной системе. Он опирается на высвобождение нейротрансмиттеров через динамический цикл слияния пузырьков и поиска в пресинаптической сайте. Многие из белков, участвующих в динамике везикулы были определены; Однако, их удельный вклад в феномен еще предстоит уточнить ^1.

Наше понимание отчасти ограничена тем, что наиболее широко используемые тесты на экзо / эндоцитоза не всегда являются наиболее подходящим. Несколько исследований, связанных с слияния пузырьков и динамика полагаться на электрофизиологических методов. Эта техника обеспечивает оптимальную временное разрешение и отлично подходит для исследования начальной слияние везикул к плазматической мембране, но не в состоянии обнаружить многие из основных молекулярных событий, которые поддерживают пресинаптической функции. Электронная микроскопия, с другой стороны, обеспечивает лучшие morphologicaл описание каждой особой стадии, но в динамическом аспекте случае не может быть захвачен, потому что образцы должны быть установлены для того, чтобы анализировать.

Появление новых методов оптической записи ^2,3, в сочетании с прогрессом в разработке флуоресцентного молекулярных зондов ^4-6, обеспечивает визуализацию exocytic процессов в живых клетках, тем самым обеспечивая новый уровень информации о синаптической структуры и функции.

Первоначальные исследования эксплуатируемые деятельности зависит от стириловые красители (FM1-43 и связанные с ними органические красители) ^7,8. Государство-оф-арт-методы визуализации использовать рН-чувствительных варианты зеленого флуоресцентного белка (GFP) (pHluorin) привязаны к просвете пузырьки белков ^9. Эти датчики, как правило, выключается, когда присутствует в пузырьки из-за низкой просвета рН. После слияния с плазматической мембраной, внутренняя пузырьков подвергается нейтральной внеклеточном пространстве, рН резко возрастает, снимает протонов в зависимости от тушения pHluorin и быстро появляется флуоресцентный сигнал. Как изменения в pHluorin быстрее, чем событие слияния, путем мониторинга флуоресценции возрастает, слияния пузырьков с мембраной могут быть измерены и проанализированы. Поскольку поверхность pHluorin с метками молекулы эндоцитарных, сигнал флуоресценции затем возвращается к исходному уровню, поэтому в тот же конструкция может быть использована также для мониторинга пузырек рециркуляции ^9.

В то время как пузырек с метками pH-сенсор обеспечивает визуализацию только тех пузырьки, которые действительно сливаются с плазматической мембраной, изображения с высоким пространственным и временным разрешением требуется описать в деталях этапы экзо / эндоцитических процессов. Оптический метод, который обеспечивает необходимую пространственно-временное разрешение полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM), применение флуоресцентной микроскопии ^10.

"> Полное внутреннее отражение происходит на границе раздела между стеклом покровным стеклом и образцом. При светлый путь достигает стеклянной крышкой скольжения с углом падения большим, чем критический угол, свет возбуждения не передается в образце, но полностью отражается обратно. В этих условиях, затухающих световой волны формы на границе и распространяется в среде с меньшим оптической плотности (образца). Как интенсивность исчезающего поля убывает экспоненциально с расстоянием от границы (с глубиной проникновения 100 нм) только флуорофоров в непосредственной близости к покровным стеклом могут быть возбуждены в то время как еще дальше от границы нет. В клетках, трансфицированных GFP-конструкций, эта глубина соответствует белков, экспрессированных на плазматической мембране или в везикулярных структур приближается к нему. Как флуорофоры в внутрь клетки не могут быть возбуждены, фон флуоресценции сведено к минимуму, и изображение с очень высоким отношением сигнал / фон крысыIO формируется ^11.

Несколько характеристики делают TIRFM методом выбора для контроля везикулы динамику. Идеальный контраст и высокое отношение сигнал-шум-отношение позволяют обнаруживать очень низких сигналов, возникающих из единичных пузырьков. Чип на основе захвата изображения в каждом кадре обеспечивает временное разрешение, необходимое для обнаружения очень динамичные процессы. Наконец, минимальное воздействие клеток к свету в любой другой плоскости образца, резко снижает фототоксичность и позволяет длительное время покадровой записи ^12.

Анализ данных остается наиболее сложной и важным аспектом этой техники. Самый простой способ для контроля слияния пузырьков состоит в измерении накопления репортера флуоресцирующих белков на поверхности клетки, с течением времени ^13. Как синтеза увеличивается, чистое увеличение сигнала флуоресценции, а также. Тем не менее, этот метод может недооценивать процесс, особенно в больших клетках, и в состоянии покоя условий,потому что эндоцитоза и Фотообесцвечивания процессы компенсировать увеличение интенсивности флуоресценции от пузырьков экзоцитоза. Альтернативным методом является следовать каждый отдельный случай слияния ^14. Этот последний метод является очень чувствительным и может раскрыть важные данные о механизмах синтеза. Тем не менее, он требует ручной выбор отдельных событий, потому что полностью автоматизированные процедуры, чтобы следовать пузырьки и зарегистрировать колебания их флуоресцентных сигналов не всегда доступны. Наблюдение динамики пузырька требуется клетки Отбор проб на высокой частоте. Это приводит к большой объем данных, которые практически не могут быть проанализированы вручную.

Предложение данной работы является оптимизация технику отображения TIRFM для мониторинга базальной и стимулированной высвобождения нейромедиаторов в нейробластомы клеточной линии SH-5YSY, и описать, шаг за шагом, процедура разработана в лаборатории для анализа данных, как на уровне целых клеток и одного пузырька.

протокол

1. Cell Culture and Transfection

1. SH-SY5Y cell culture
   NOTE: The experiments have been performed using the human neuroblastoma SH- SY5Y (ATCC# CRL-2266)¹⁵. SH-SY5Y cells grow as a mixture of floating clusters and adherent cells. Follow the instructions reported in the protocol (cell density, splitting ratio, etc.) to have cells that grow firmly attached to glass cover, which is crucial for TIRFM.
   1. Before starting, under the laminar flow biosafety cabinet, make the opportune volume of sterile phosphate buffer saline solution (PBS) and culture medium.
      1. Make 50 ml of PBS with concentrations of 150 mM NaCl, 24 mM phosphate buffer, pH 7.4. Filter the solution.
      2. Make 50 ml of cell medium from Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) with high glucose, 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 µg/ml), L-glutamine (2 mM), and sodium pyruvate (1 mM). Filter the solution.
   2. Remove complete growth medium and wash the cells with 3 ml of PBS.
   3. Incubate cells with 2 ml of 0.05% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (for 6 cm Petri dish) for 5 min at 37 °C, 5% CO₂ and detach cells using pipette.
   4. Inactivate trypsin by adding 2 ml of DMEM, and collect cells by centrifugation at 300 x g for 5 min.
   5. Remove the supernatant, add 1 ml of DMEM to the pellet and pipette the solution up and down sufficiently to disperse cells into a single cell suspension.
   6. Split them 1:4 in a new 6 cm diameter Petri dish containing 3 ml of complete medium. Maintain cells in culture in 6 cm diameter Petri dishes, at 37 °C in a 5% CO₂ incubator. Sub-culture once a week or when they have covered 80 - 90% of the surface area.
2. SH-SY5Y cell plating for imaging
   1. For TIRFM experiments, plate cells onto glass covers. Employ glass covers with 0.17 ± 0.005 mm thickness and a 1.5255 ± 0.00015 refractive index. Before starting, prepare the glass coverslips as follow:
      1. Clean glass covers with 90% ethanol, O/N.
      2. Rinse them thoroughly in distilled water (three changes of distilled water). Dry glass covers in a drying oven.
      3. Place covers in glass Petri dishes and sterilize in a preheated oven at 200 °C for 3 hr.
   2. The day before transfection, place each coverslip in a 3.5 cm Petri dish, add 1 ml of culture medium and incubate at 37 °C in a 5% CO₂ incubator.
   3. Trypsinize cells as described in steps 1.1.3 - 1.1.5, suspend the cell pellet in 1 ml of complete medium and count. Calculate the correct volume of cell suspension to add to each Petri dish to yield 3 x 10⁵ cells/well. This density is required for optimal cell growth and efficient transfection. Incubate at 37 °C in a 5% CO₂ incubator O/N.
3. SH-SY5Ytransfection by polyethylenimine (PEI)
   NOTE: To visualize synaptic vesicles dynamics, pCB6 vector containing synapto-pHluorin has been used. The synapto-pHluorin has been generated by in frame fusion of a pH-sensitive variant of the green fluorescent protein (GFP)¹⁶ and the vesicular membrane protein synaptobrevin 2. The construct has been extensively employed to investigate synaptic vesicle properties within neurons⁹.
   1. Before starting transfection, make 10 ml of the following solutions. Keep the solutions as maximal as 1 month.
      1. Make a 150 mM NaCl solution. Adjust to pH 5.5 with 0.01 N HCl.
      2. Make a PEI solution at 10% polyethylenimine (PEI; 25 kDa linear) in 150 mM NaCl solution. The pH of solution rises to 8.8. Adjust pH to 7.8 with 0.01 N HCl.
   2. 24 hr after plating, remove the medium and refresh with 1.5 ml of complete medium. Keep the cells at 37 °C, in a 5% CO₂ incubator.
   3. Under the laminar flow biosafety cabinet, in a 1.5 ml microfuge tube, add 3 µg of plasmid DNA to 25 μl of 150 mM NaCl solution and 100 μl of PEI solution per 3.5 cm Petri dish.
   4. Vortex for 10 sec, then incubate the DNA/PEI mixture for 30 min at RT.
   5. Carefully add the DNA/PEI mixture to the Petri dish containing coverslips with cells and gently shake to equally distribute the reagent in the Petri dish.
   6. After 4 hr change the medium and incubate the cells O/N at 37 °C in a 5% CO₂ incubator. Perform imaging experiments 24 - 48 hr after transfection.

2. Cell Imaging by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)

1. Imaging set-up
   1. Perform TIRF imaging with the set-up described in Figure 1. It comprises a motorized inverted microscope (Figure 1, inset A), the laser source (Figure 1, inset B) and the TIRF-slider (Figure 1, inset C). Reach TIRFM illumination through a high numerical aperture (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X oil, immersion objective.
   2. For TIRFM illumination, employ a multi-line (458/488/514 nm) 100 mW argon-ion laser. Using a mono mode fiber, introduce the linearly polarized laser light into the beam path, via the TIRF slider. Insert the TIRF slider into the luminous field diaphragm plane of the reflected-light beam path.
      1. For wide field illumination, connect the microscope to a conventional mercury short-arc lamp HBO white light. A polarization-maintaining double prism in the slider ensures the simultaneous combination of TIRF illumination and white light.
   3. Filter the laser light with an excitation filter (band width 488/10 nm) mounted on a filter wheel, introduced into the laser path. Employ a high speed, software-controlled, shutter to allow fast control of laser illumination. For pHluorin analysis, mount a band pass 525/50 nm emission filter. Capture digital images (512 x 512 pixels) on a cooled Fast CCD camera with the Image ProPlus software.
2. Achieving TIRF illumination (Figure 2)
   1. Turn on the lasers, the computer, the camera, the filter wheel, and the shutter controllers; then, wait 20 min before starting the experiment as the lasers need to warm up and stabilize.
   2. Before imaging, make the opportune volume of the following solutions.
      1. Make 50 ml of Krebs (KRH) solution at 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH₂PO₄, 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) (buffered to pH 7.4), 2 mM CaCl₂, and 6 mM glucose.
      2. Make 10 ml of KCl-KRH solution (pH 7.4) at 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH₂PO₄, 25 mM HEPES (buffered to pH 7.4), 2 mM CaCl₂, and 6 mM glucose.
   3. Remove the glass cover with transfected cells and insert it in the appropriate imaging chamber. Assemble the chamber and add 500 µl of KRH solution in the center of the glass.
   4. Add oil over the objective. Place the imaging chamber on the stage of the microscope and position the objective under the glass coverslip. Position the safe cover over the sample.
   5. In epifluorescence mode, focus on the coverslip (upper surface) and choose transfected cells placed in the chamber center. Select cells whose fluorescent signal can be clearly recorded using an exposure time below 80 msec.
   6. Under software control, switch to TIRF illumination in live mode.
   7. To set the TIRF configuration, check the position of the beam that emerges out of the objective, on the sample cover (Figure 2B). When the beam is positioned in the center of the objective lens (Figure 2A, left), a spot is visible in the center of the TIRF sample cover (Figure 2B, left) and the cell is imaged in epifluorescence mode (several focus planes, high background fluorescence; Figure 2C, left).
   8. To reach the critical angle, move the focused spot in the Y direction (forward or backward; Figure 2B, center) using the angle adjustment screw on the TIRF slider (Figure 1C). When the beam converges on the sample plane at an angle larger than the critical angle (Figure 2A, right), the spot disappears and a straight, thin, focused line is evident in the middle of the sample cover (Figure 2B, right).
   9. To fine-tune the TIRF angle use the cell sample (Figure 2C). Watch the fluorescence image on the video, at this stage, an epifluorescence-like image is still visible. Gently, move the screw until TIRF condition is achieved: only one optical plane of the cell is in focus (i.e., the plasma membrane in contact with the cover-slip), this results in a flat image with high contrast (Figure 2C, right).
3. Sample imaging
   1. Set the single-channel time-lapse experiment. To minimize photobleaching, capture the image using low exposure time and high gain. Appropriate exposure times are between 40 - 80 msec. Acquire images at 1 - 2 Hz sampling frequency. Vesicle kinetics may be better appreciated sampling at higher frequency (10 Hz). The regular time of observation is usually 2 min.
   2. Add 500 µl of KRH solution and record cells in TIRFM mode. This is the resting condition. Save the time sequential images.
   3. Focus on the same cell and record under the same conditions of resting (laser power, time exposure, frame number). After five frames, add 500 µl of KCl-KRH solution and keep KCl in the chamber. This is the stimulated condition; save the time sequential images.

3. Image Analysis and Data Processing

NOTE: To analyze images, macros have been developed in the lab, based on existing functions of the image analysis software; similar macros are available online (URL provided in Table of Materials and Equipment).

1. Fluorescence intensity quantification
   1. Use a “Sequence fluorescence intensity” macro for fluorescence intensity quantification in a region of interest (ROI) of the image, over the course of the movie.
   2. Open the time-sequential images. Go to the macro menu and select 'Sequence fluorescence intensity'. In the 'Analysis' window appears “select the ROI”.
   3. Choose one of the selection tools in the menu to create the ROI. Place 3 ROIs in regions of the cell membrane without spots (background ROI). Employ this “background ROI” to evaluate the photobleaching and to set the threshold for fusion event analysis (Figure 3A).
2. Photobleaching correction and threshold determination (Figure 3B)
   1. To evaluate the photobleaching, open the fluorescence intensity rows “background ROIs”, (Figure 3Ba). Normalize the fluorescence intensity values in each frame to the initial intensity value (F0) (F/F0) (Figure 3Bb). Average the values.
   2. Highlight the average data and create a line plot using the chart menu options.
   3. From the data analysis menu, select “trendline” to open the plot analysis dialog. Select the type of regression. Set “exponential” regression. Then select “display equation on chart”. In the graph window, the exponential equation appears and the parameter values are automatically assigned, (Figure 3Bc).
   4. Apply the exponential correction to the intensity values in each frame as follow:
      Fn (corrected) = Fn / exp(-n * a)
      Fn = experimental fluorescence intensity measured at frame n; n = number of frames; a = bleaching factor (constant expressing the rate of intensity loss due to photobleaching; Figure 3Bd).
   5. To set the threshold, open a normalized and corrected “background ROI”, calculate the average fluorescence signal and its standard deviation (SD). The average value plus 3 SD represents the threshold (Figure 3Be). Use this threshold for data analysis.
3. Selection of fusion events using a semiautomatic procedure
   1. Open the time-sequential images with image analysis software. Apply a Gaussian filter to the active image sequence.
   2. Analyze images using the tool “count objects” or a macro which allows the selection of an object whose pixels have average fluorescence intensity within a defined range. Set the intensity range manually, using the threshold function (go to the bar menu, set measure → threshold to highlight the area of interest). An adequate threshold is 30% over the local fluorescent background signal.
   3. Apply a macro “Filters objects” to select only objects meeting the following criteria:
      1. Apply ranges option (min and max inclusive) for aspect. Aspect reports the ratio between the major axis and the minor axis of the ellipse equivalent to the object. Aspect is always ≥1. Adequate values are min = 1, max = 3.
      2. Apply ranges for diameter. Diameter reports the average length of the diameters measured at two degree intervals joining two outline points and passing through the centroid of the object. Set the range in pixels (or in µm, if using a calibrated system).
      3. Define the optimal range in preliminary experiments: select manually the spots of interest and then measure their diameter using the plot profile function.
   4. Select “display objects”: selected objects will appear superimposed to the TIRFM image (Figure 4B).
   5. Include in the analysis only those spots that show a short (one to three frames) transient increase in fluorescence intensity, immediately followed by a marked loss of signal (transient spots). Employ the circular selection to create a ROI approximately one-spot diameter radially around the selected vesicle/spots (experimental ROIs). Perform this step manually.
   6. With the ROIs selected, calculate the average fluorescence intensity of each ROI over the course of the movie.
4. Data analysis (Figure 3C-D)
   1. Export the time-course of the fluorescence changes measured in each “experimental ROI” to a spreadsheet; (Figure 3Da). Normalize the intensity value in each frame to the initial fluorescence intensity (F/F0), (Figure 3Db).
   2. Apply the exponential correction to the intensity values in each frame as reported in step 3.2.4 (Figure 3Dc).
   3. To calculate the total number of fusion events (peak number), the time each fusion occurs (peak width) and the amplitude of fluorescent peak (peak height and AUC) apply logical functions using spreadsheet or math packages. An example of fusion event analysis using logical formulas is reported in Figure 3Dd and 3De.
   4. Assume the increase of fluorescence intensity exceeding the threshold (average background fluorescence intensity ± 3SD) as vesicle fusion to the plasma membrane and the resulting peak as a fusion event.
   5. Calculate the peak width as difference between the last and the first x value of each peak. Multiply this value for 1 / (sampling frequency). Consider this value as the time of vesicle fusion and adhesion at the plasma membrane before vesicle re-acidification and recycling (Figure 3Dd).
   6. Calculate the whole-cell AUC as a sum of values over threshold. Consider this value as net fluorescent change during the recording time due to the spontaneous (resting) or evoked (stimulated) synaptic activity.
   7. Calculate the peak height as the difference between the maximal y value of each peak and the threshold. Consider this value as indicative of the fusion type (single vs. simultaneous/sequential fusion or transient vs. full fusion).

Результаты

The TIRF imaging and data analysis procedures described are designed to study vesicles dynamics in cellular systems. This technique can be used to determine the effects of signaling molecules and drugs on fusion events and neurotransmitter vesicle dynamics¹⁷. Using GFP-tagged plasma membrane proteins, the TIRFM analysis has been employed to characterize the constitutive trafficking of GFP-tagged glutamate transporters in glial and epithelial cells^18,19.

To validate the im...

Обсуждение

This paper presents a protocol to image and analyze vesicles dynamics in secreting cells, using fluorescent cDNA-encoded vectors and TIRFM. Key elements of successful imaging by TIRFM are the selection of the cellular model and cell transfection with genetically-encoded optical indicators of vesicle release and recycling.

TIRFM is ideally suited for cells growing adherent to a glass cover and sufficiently flat to allow stable visualization of membranes and fusion events. Vesicles should ideall...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
Multiline Argon Laser Lasos 77	Lasos	00000-1312-752	multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
Laser TIRF slider	Zeiss	423681-9901-000	http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100x Objective	Zeiss	421190-9900-000	Oil, NA 1.45 Alpha-Plan https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421 190-9900-000&ss=1
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394	QImaging		http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter	Sutter Instrument Company		http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
Software
Image ProPlus 6.3 Software	Media Cybernetics		spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
Excel	Microsoft		photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses http://office.microsoft.com/it-it/excel/
GraphPad Prism 4.00	GraphPad Software, Inc.		statistical analysis http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/