TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

Resumen

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

Resumen

Las vesículas sinápticas liberan neurotransmisores en las sinapsis químicas a través de un ciclo dinámico de la fusión y la recuperación. Supervisión de la actividad sináptica en tiempo real y la disección de los diferentes pasos de exo-endocitosis en el nivel de una sola vesícula son cruciales para la comprensión de las funciones sinápticas en salud y enfermedad.

Genéticamente codificados sondas sensibles al pH directamente dirigidos a las vesículas sinápticas y Reflexión Interna Total microscopía de fluorescencia (TIRFM) proporcionan la resolución espacio-temporal necesario seguir la dinámica de la vesícula. El campo evanescente generada por la reflexión interna total sólo puede excitar fluoróforos colocados en una capa delgada (<150 nm) por encima de la cubierta de vidrio sobre el cual las células se adhieren, exactamente donde los procesos de exo-endocitosis tienen lugar. Las imágenes de alto contraste resultantes son ideales para vesículas de seguimiento y análisis cuantitativo de los eventos de fusión.

En este protocolo, SH-SY5Y n humanaeuroblastoma células se proponen como un modelo valioso para el estudio de la liberación de neurotransmisores en el nivel de una sola vesícula por TIRFM, debido a su superficie plana y la presencia de vesículas dispersas. Los métodos para el cultivo de SH-SY5Y como células adherentes y para transfectar con synapto-pHluorin se proporcionan, así como la técnica para llevar a cabo TIRFM y de imagen. Por último, se presenta una estrategia con el objetivo de seleccionar, contar y analizar los eventos de fusión a nivel de células enteras y de una sola vesícula.

Para validar el método de análisis de procedimiento de imágenes y datos, la dinámica de las vesículas de etiquetado pHluorin se analizan bajo reposo y estimuladas (despolarizar las concentraciones de potasio) condiciones. Despolarización de la membrana aumenta la frecuencia de eventos de fusión y causa un aumento paralelo de la señal de fluorescencia neta registrada en células enteras. Análisis de una sola vesícula revela modificaciones del comportamiento de fusión-evento (altura máxima y una mayor anchura). Estos datos sugieren ésimoen la despolarización de potasio no sólo induce una liberación masiva neurotransmisor sino también modifica el mecanismo de la fusión de vesículas y reciclaje.

Con la sonda fluorescente apropiada, esta técnica se puede emplear en diferentes sistemas celulares para diseccionar los mecanismos de secreción constitutiva y estimulado.

Introducción

La transmisión sináptica química entre las neuronas es un mecanismo principal de la comunicación en el sistema nervioso. Se basa en la liberación de neurotransmisores a través de un ciclo dinámico de la fusión de vesículas y la recuperación en el sitio presináptica. Muchas de las proteínas implicadas en la dinámica de vesículas han sido identificados; Sin embargo, su contribución específica al fenómeno queda por aclarar ^1.

Nuestro entendimiento está parcialmente limitada por el hecho de que los ensayos más utilizados para exo / endocitosis no siempre son las más adecuadas. Varios estudios relacionados con la fusión de vesículas y la dinámica se basan en técnicas electrofisiológicas. Esta técnica proporciona una resolución temporal óptimo y es excelente para la investigación de la fusión inicial de vesículas a la membrana plasmática, pero es incapaz de detectar muchos de los eventos moleculares subyacentes que apoyan la función presináptica. La microscopía electrónica, en el otro lado, ofrece la mejor morphological descripción de cada paso singular, pero el aspecto dinámico del evento no puede ser capturado, ya que las muestras deben ser fijados con el fin de ser analizados.

El advenimiento de nuevas técnicas de grabación óptica ^{de 2,3,} en combinación con los avances en el desarrollo de sondas moleculares fluorescentes ^4-6, permite la visualización de los procesos de exocytic en células vivas, proporcionando así nuevos niveles de información sobre la estructura y la función sináptica.

Los estudios iniciales explotadas tintes dependientes de la actividad de estirilo (FM1-43 y tintes orgánicos relacionados) ^7,8. Estado-of-the-art técnicas de imagen emplean variantes sensibles al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) (pHluorin) atado a proteínas vesículas luminales ^9. Estas sondas están normalmente desconectados cuando está presente en las vesículas debido al bajo pH luminal. Después de la fusión con la membrana plasmática, el interior de vesículas se expone al espacio extracelular neutral, el pH aumenta abruptamente, alivia la extinción de protones dependiente de pHluorin y la señal fluorescente aparece rápidamente. Como el cambio en pHluorin es más rápido que el evento de fusión, mediante el control de los incrementos de fluorescencia, la fusión de vesículas con la membrana se puede medir y analizar. Debido a que las moléculas de pHluorin-etiquetado de superficie se endocitosis, la señal de fluorescencia posteriormente vuelve al nivel basal, por lo tanto, la misma construcción puede utilizarse también para controlar la vesícula reciclaje ^9.

Mientras que el sensor de pH de vesículas etiquetado asegura la visualización solamente de las vesículas que realmente se fusionan con la membrana plasmática, se requiere formación de imágenes en alta resolución espacial y temporal para describir en detalle los pasos implicados en los procesos de endocitosis exo /. La técnica óptica que proporciona la resolución espacio-temporal es necesario microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM), una aplicación de la microscopía de fluorescencia ^10.

"> La reflexión interna total se produce en la interfase entre el cubre de vidrio y la muestra. Cuando la trayectoria de la luz alcanza el cubre de vidrio con un ángulo de incidencia mayor que el ángulo crítico, la luz de excitación no se transmite en la muestra, pero es completamente reflejada de nuevo. En estas condiciones, un evanescentes formas de onda de la luz en la interfase y se propaga en el medio con menos densidad óptica (la muestra). Como la intensidad del campo evanescente decae exponencialmente con la distancia desde la interfaz (con una profundidad de penetración de alrededor de 100 nm) sólo los fluoróforos en la proximidad más cercana a la hoja de la cubierta puede ser excitado mientras que aquellos más lejos de la frontera no lo son. En las células transfectadas con GFP-construcciones, esta profundidad corresponde a las proteínas expresadas en la membrana plasmática o en estructuras vesiculares acercarse a ella. Como fluoróforos en el interior de la célula no pueden ser excitados, la fluorescencia de fondo se reduce al mínimo, y una imagen con una señal de muy alta / fondo de rataio se forma ^11.

Varias características hacen TIRFM la técnica de elección para el seguimiento de la dinámica de las vesículas. El contraste perfecto y la relación señal a ruido más alta relación de permiten la detección de señales muy bajas derivadas de vesículas individuales. Adquisición de imágenes basado en un chip en cada cuadro proporciona la resolución temporal necesaria para detectar procesos altamente dinámicos. Por último, la mínima exposición de las células a la luz en cualquier otro plano de la muestra reduce fuertemente la fototoxicidad y permite la grabación de largo lapso de tiempo duradero ^12.

Análisis de los datos sigue siendo el aspecto más difícil y crucial de esta técnica. La manera más simple para monitorizar la fusión de vesículas es medir la acumulación de proteínas fluorescentes reportero en la superficie celular, con el tiempo ^13. A medida que aumenta la fusión, neto aumenta señal de fluorescencia así. Sin embargo, este método puede subestimar el proceso, sobre todo en las células grandes y en condiciones de reposo,porque los procesos de endocitosis y fotoblanqueo compensar el aumento en la intensidad de fluorescencia debido a la exocitosis de vesículas. Un método alternativo es seguir cada evento de fusión única ^14. Este último método es muy sensible y puede revelar detalles importantes sobre los mecanismos de fusión. Sin embargo, requiere la selección manual de los eventos individuales, porque los procedimientos completamente automatizados para seguir vesículas y registrar la fluctuación de sus señales fluorescentes no siempre están disponibles. Observación de la dinámica de vesículas requiere células de muestreo a alta frecuencia. Esto genera una gran cantidad de datos que difícilmente pueden ser analizados manualmente.

La propuesta de este trabajo es optimizar la técnica de imagen TIRFM para el seguimiento de la basal y estimulado la liberación de neurotransmisores en la línea celular de neuroblastoma SH-5YSY, y describir, paso a paso, un procedimiento desarrollado en el laboratorio para analizar los datos, tanto en los niveles de células enteras y de una sola vesícula.

Protocolo

1. Cultivo celular y transfección

1. Cultivo de células SH-SY5Y
   NOTA: Los experimentos se han realizado utilizando el neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) ^15. Células SH-SY5Y crecen como una mezcla de grupos flotantes y las células adherentes. Siga las instrucciones indicadas en el protocolo (densidad celular, relación de división, etc.) Para tener células que crecen firmemente unidos a la cubierta de cristal, que es crucial para TIRFM.
   1. Antes de comenzar, bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, hacer que el volumen oportuna de solución de fosfato estéril solución salina tamponada (PBS) y medio de cultivo.
      1. Hacer 50 ml de PBS con concentraciones de NaCl 150 mM, tampón fosfato 24 mM, pH 7,4. Se filtra la solución.
      2. Hacer 50 ml de medio de células de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml), L-glutamina ( 2 mM), ypiruvato de sodio (1 mM). Se filtra la solución.
   2. Retire medio de crecimiento completo y lavar las células con 3 ml de PBS.
   3. Se incuban las células con 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,05% (EDTA) (por 6 cm plato Petri) durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO ₂ y separar las células con una pipeta.
   4. Inactivar la tripsina mediante la adición de 2 ml de DMEM, y recoger las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min.
   5. Eliminar el sobrenadante, añadir 1 ml de DMEM al sedimento y la pipeta la solución arriba y hacia abajo suficientemente para dispersar las células en una sola suspensión celular.
   6. Ellos dividieron 1: 4 en una nueva placa de Petri de diámetro 6 cm que contiene 3 ml de medio completo. Mantener las células en cultivo en placas de 6 cm de diámetro Petri, a 37 ° C en una incubadora de _CO2 al 5%. Sub-cultivo una vez a la semana o cuando se han cubierto 80 - 90% de la superficie.
2. Chapado de células SH-SY5Y para imágenes
   1. Para los experimentos TIRFM, placacélulas sobre cubiertas de vidrio. Emplear vidrio cubre con 0,17 ± 0,005 mm de espesor y un índice de refracción 1,5255 ± 0,00015. Antes de empezar, prepare los cubreobjetos de vidrio de la siguiente manera:
      1. Limpie el vidrio cubre con etanol al 90%, O / N.
      2. Enjuague bien en agua destilada (tres cambios de agua destilada). Vidrio seco cubre en un horno de secado.
      3. Lugar cubre en platos Petri de vidrio y esterilizar en un horno precalentado a 200 ° C durante 3 horas.
   2. El día antes de la transfección, coloque cada cubreobjetos en una placa de Petri de 3,5 cm, agregar 1 ml de medio de cultivo y se incuba a 37 ° C en una incubadora de _CO2 al 5%.
   3. Tripsinizar las células como se describe en los pasos 1.1.3 - 1.1.5, suspender el sedimento celular en 1 ml de medio completo y contar. Calcular el volumen correcto de la suspensión celular para añadir a cada plato Petri para producir 3 x 10 ⁵ células / pocillo. Se requiere esta densidad óptima para el crecimiento celular y transfección eficiente. Se incuba a 37 ° Cen un incubador de _CO2 al 5% O / N.
3. SH-SY5Ytransfection por polietilenimina (PEI)
   NOTA: Para visualizar la dinámica de las vesículas sinápticas, se ha utilizado vector que contiene pCB6 synapto-pHluorin. El synapto-pHluorin ha sido generada por fusión en el marco de una variante sensible al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) ¹⁶ y la proteína de membrana vesicular sinaptobrevina 2. La construcción se ha empleado ampliamente para investigar las propiedades de vesículas sinápticas dentro de las neuronas ^9.
   1. Antes de iniciar la transfección, hacer 10 ml de las siguientes soluciones. Mantenga las soluciones como máximo 1 mes.
      1. Hacer una solución 150 mM de NaCl. Ajustar el pH a 5,5 con HCl 0,01 N.
      2. Prepare una solución de PEI en el 10% de polietilenimina (PEI; 25 kDa lineal) en solución de NaCl 150 mM. El pH de la solución se eleva a 8,8. Ajustar el pH a 7,8 con HCl 0,01 N.
   2. 24 horas después de la siembra, se elimina el medio y refrescar con 1,5 ml demedio completo. Mantenga las células a 37 ° C, en un incubador de _CO2 al 5%.
   3. Bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 3 g de ADN plásmido a 25 l de solución de NaCl 150 mM y 100 l de solución de PEI por 3,5 cm de placa de Petri.
   4. Vortex durante 10 segundos, a continuación, incubar la mezcla de ADN / PEI durante 30 min a RT.
   5. Añadir con cuidado la mezcla de ADN / PEI a la placa de Petri que contiene cubreobjetos con células y agitar suavemente para distribuir por igual el reactivo en la placa de Petri.
   6. Después de 4 horas cambiar el medio y se incuban las células O / N a 37 ° C en una incubadora de _CO2 al 5%. Realizar experimentos de imagen 24 a 48 horas después de la transfección.

Imagen 2. Celular por reflexión interna total microscopía de fluorescencia (TIRFM)

1. Imaging configuración
   1. Realizar imagen TIRF con la puesta a punto se describe en la Figura 1. Comprende un motorizado invertidamicroscopio (Figura 1, recuadro A), la fuente de láser (Figura 1, recuadro B) y el TIRF deslizante (Figura 1, recuadro C). Alcanzar la iluminación TIRFM a través de una alta apertura numérica (NA 1.45 Alfa Plan-Fluar) aceite de 100X, objetivo de inmersión.
   2. Para la iluminación TIRFM, emplear una multilínea (458/488/514 nm) 100 mW láser de argón-ion. El uso de una fibra monomodo, introducir la luz láser polarizada linealmente en la trayectoria del rayo, mediante el control deslizante TIRF. Insertar el control deslizante TIRF en el plano diafragma de campo luminoso de la trayectoria del haz de luz incidente.
      1. Por amplia iluminación de campo, conecte el microscopio a una lámpara de mercurio de arco corto convencional HBO luz blanca. Un doble prisma mantenedora de polarización en el control deslizante asegura la combinación simultánea de TIRF iluminación y luz blanca.
   3. Se filtra la luz láser con un filtro de excitación (banda ancho de 488/10 nm) montado en una rueda de filtros, introducido en la trayectoria del láser. Emplearuna alta velocidad, controlado por software, obturador para permitir un control rápido de la iluminación láser. Para el análisis pHluorin, montar una banda paso 525/50 nm filtro de emisión. Captura imágenes digitales (512 x 512 píxeles) en una cámara CCD enfriado rápido con el software Image ProPlus.
2. El logro de la iluminación TIRF (Figura 2)
   1. Encienda el láser, el ordenador, la cámara y la rueda de filtros, y los controladores de obturación; luego, esperar 20 minutos antes de comenzar el experimento como los láseres necesitan calentarse y estabilizarse.
   2. Antes de formación de imágenes, hacer que el volumen oportuno de las siguientes soluciones.
      1. Hacer 50 ml de solución de Krebs (KRH) en NaCl 125 mM, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 25 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) (tamponada a pH 7,4), 2 mM CaCl _2, y glucosa 6 mM.
      2. Hacer 10 ml de solución de KCl-KRH (pH 7,4) en NaCl 80 mM, KCl 50 mM, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH ₂ PO ₄, 25 mM HEPES (tamponada a pH 7,4), 2 mM CaCl _2, y glucosa 6 mM.
   3. Retire la cubierta de cristal con células transfectadas e insertarlo en la cámara de imagen apropiado. Montar la cámara y añadir 500 l de solución KRH en el centro del cristal.
   4. Añadir el aceite sobre el objetivo. Coloque la cámara de imágenes en la platina del microscopio y la posición del objetivo bajo el cubreobjetos de vidrio. Colocar la tapa de seguridad sobre la muestra.
   5. En el modo de epifluorescencia, se centran en el cubreobjetos (superficie superior) y elija células transfectadas colocados en el centro de la cámara. Seleccione las celdas cuya señal fluorescente puede grabarse claramente utilizando un tiempo de exposición por debajo de 80 ms.
   6. Bajo el control del software, cambiar a la iluminación TIRF en modo directo.
   7. Para establecer la configuración TIRF, compruebe la posición del haz que emerge del objetivo, en la portada de la muestra (Figura 2B). Cuando el haz se coloca en el centro de tél lente objetivo (Figura 2A, izquierda), un lugar es visible en el centro de la cubierta de la muestra TIRF (Figura 2B, a la izquierda) y la célula se forma la imagen en el modo de epifluorescencia (varios planos de enfoque, de alta fluorescencia de fondo; Figura 2C, izquierda) .
   8. Para alcanzar el ángulo crítico, mover el punto enfocado en la dirección Y (hacia adelante o hacia atrás; Figura 2B, centro) con el tornillo de ajuste del ángulo en el control deslizante TIRF (Figura 1C). Cuando el haz converge en el plano de la muestra en un ángulo mayor que el ángulo crítico (Figura 2A, derecha), el punto desaparece y una, delgada, línea recta centrado es evidente en el medio de la cubierta de la muestra (Figura 2B, derecha).
   9. Para ajustar el ángulo TIRF utilizar la muestra de células (Figura 2C). Ver la imagen de fluorescencia en el video, en esta etapa, una imagen-epifluorescencia como aún es visible. Con cuidado, mueva el tornillo hasta TIRF concondición se logra: un solo plano óptico de la celda está en el foco (es decir, la membrana plasmática en contacto con la hoja de la cubierta), esto resulta en una imagen plana con alto contraste (Figura 2C, derecha).
3. Muestra imágenes
   1. Ajuste el canal único experimento de lapso de tiempo. Para minimizar fotoblanqueo, capturar la imagen con bajo tiempo de exposición y de alta ganancia. Tiempos de exposición apropiados son entre 40 - 80 ms. Adquirir imágenes en 1 - 2 Hz de frecuencia de muestreo. La cinética de vesículas de muestreo pueden ser mejor apreciado en mayor frecuencia (10 Hz). El tiempo regular de observación es generalmente de 2 min.
   2. Añadir 500 l de células de solución KRH y grabar en el modo de TIRFM. Esta es la condición de reposo. Guarde las imágenes secuenciales de tiempo.
   3. Centrarse en la misma celda y registro en las mismas condiciones de reposo (potencia láser, tiempo de exposición, de número de fotograma). Después de cinco marcos, añadir 500 l de solución de KCl-KRH y mantener KCl en la cámara.Esta es la condición estimulada; guardar las imágenes secuenciales de tiempo.

Análisis 3. Imagen y Procesamiento de Datos

NOTA: Para analizar las imágenes, macros se han desarrollado en el laboratorio, basado en funciones existentes del software de análisis de imagen; macros similares están disponibles en línea (URL proporcionado en la Tabla de Materiales y Equipos).

1. Cuantificación intensidad de fluorescencia
   1. Utilice una macro "intensidad de fluorescencia Sequence" para la cuantificación intensidad de fluorescencia en una región de interés (ROI) de la imagen, en el transcurso de la película.
   2. Abra las imágenes en tiempo secuencial. Ir al menú de macro y seleccione 'intensidad de fluorescencia Secuencia'. En la ventana "Análisis" aparece "seleccione el retorno de la inversión".
   3. Elija una de las herramientas de selección en el menú para crear el ROI. Coloque 3 ROIs en las regiones de la membrana celular sin manchas (fondo ROI). Emplear this "fondo ROI" para evaluar la photobleaching y para establecer el umbral para el análisis de actividad de fusión (Figura 3A).
2. Corrección Photobleaching y determinación del umbral (Figura 3B)
   1. Para evaluar la fotoblanqueo, abra las filas de fluorescencia intensidad "ROI de fondo", (Figura 3ba). Normalizar los valores de intensidad de fluorescencia en cada marco para el valor de intensidad inicial (F0) (F / F0) (Figura 3BB). La media de los valores.
   2. Resaltar los datos medios y crear un esquema lineal utilizando las opciones de menú gráfico.
   3. Desde el menú de análisis de datos, seleccione "línea de tendencia" para abrir el diálogo de análisis de la representación. Seleccione el tipo de regresión. Ajuste de regresión "exponencial". A continuación, seleccione "ecuación de pantalla en la carta". En la ventana gráfica, la ecuación exponencial aparece y los valores de los parámetros se asignan automáticamente, (Figura 3bc ).
   4. Aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada trama de la siguiente manera:
      Fn (corregido) = Fn / exp (-n * a)
      Fn = intensidad de la fluorescencia experimental medido en la trama n; n = número de fotogramas; a = factor de blanqueo (constante que expresa la tasa de pérdida de intensidad debido a photobleaching;   Figura 3Bd).
   5. Para establecer el umbral, abrir un normalizado y corregido "fondo ROI", calcular la media de la señal de fluorescencia y su desviación estándar (SD). El valor promedio más 3 SD representa el umbral (Figura 3be). Utilice este umbral para el análisis de datos.
3. Selección de los eventos de fusión utilizando un procedimiento semiautomático
   1. Abra las imágenes secuenciales en el tiempo con el software de análisis de imágenes. Aplicar un filtro de Gauss a la secuencia de imagen activa.
   2. Analizar las imágenes con la función "contar objetos" o una macro que permite la selecciónde un objeto cuya píxeles tienen intensidad media de fluorescencia dentro de un rango definido. Ajuste el rango de intensidad de forma manual, utilizando la función de umbral (ir al menú de la barra, defina medida → umbral para resaltar el área de interés). Un umbral adecuado es 30% más que la señal de fondo fluorescente local.
   3. Aplicar una macro "Filtros de objetos" para seleccionar sólo los objetos que cumplan los siguientes criterios:
      1. Aplicar opción rangos (mínimo y máximo incluido) para los aspectos. Aspecto informa de la relación entre el eje mayor y el eje menor de la elipse equivalente al objeto. Aspect es siempre ≥1. Valores adecuados min = 1, max = 3.
      2. Aplicar rangos de diámetro. Diámetro informa de la duración media de los diámetros medidos a intervalos de dos grados que une dos puntos de contorno y que pasa a través del centroide del objeto. Ajuste el rango de píxeles (o en micras, si se utiliza un sistema calibrado).
      3. Defina el rango óptimo en preliminexperimentos ary: seleccionar manualmente los puntos de interés y luego medir su diámetro utilizando la función de perfil parcela.
   4. Seleccione "objetos de visualización": los objetos seleccionados se presentarán superpuestas a la imagen TIRFM (Figura 4B).
   5. Incluir en el análisis sólo aquellos puntos que muestran un corto (uno a tres marcos) aumento transitorio de la intensidad de fluorescencia, seguido inmediatamente por una marcada pérdida de señal (puntos transitorios). Emplear la selección circular para crear un retorno de la inversión de diámetro aproximadamente un punto radialmente alrededor de las vesículas seleccionados / spots (ROI experimental). Realice este paso manualmente.
   6. Con las ROIs seleccionado, calcular la intensidad media de fluorescencia de cada ROI en el transcurso de la película.
4. Análisis de los datos (Figura 3C-D)
   1. Exportar el curso de tiempo de los cambios de fluorescencia medidos en cada "ROI experimental" a una hoja de cálculo; (Figura 3DA). Normalizar el valor de intensidad en cada trama a la intensidad de fluorescencia inicial (F / F0), (Figura 3Db).
   2. Aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada trama como se informó en el paso 3.2.4 (Figura 3Dc).
   3. Para calcular el número total de eventos de fusión (número de pico), el tiempo se produce cada fusión (anchura de pico) y la amplitud de pico fluorescente (altura del pico y AUC) aplicar funciones lógicas utilizando los paquetes de hojas de cálculo o matemáticas. Un ejemplo de análisis de eventos de fusión usando fórmulas lógicas se informó en la Figura 3Dd y 3De.
   4. Suponga que el aumento de la intensidad de fluorescencia que excede el umbral (intensidad media de fluorescencia de fondo ± 3SD) como la fusión de vesículas a la membrana plasmática y el pico resultante como un evento de fusión.
   5. Calcular la anchura de pico como diferencia entre el último y el primer valor de x de cada pico. Multiplique este valor por 1 / (frecuencia de muestreo). Considere este valor uns el momento de la fusión de vesículas y la adhesión a la membrana plasmática antes vesícula re-acidificación y reciclaje (Figura 3Dd).
   6. Calcular el AUC de células enteras como una suma de los valores por encima del umbral. Considere este valor como el cambio neto fluorescente durante el tiempo de grabación debido a la espontánea (en reposo) o evocada (estimulado) la actividad sináptica.
   7. Calcular la altura del pico como la diferencia entre el valor máximo y de cada pico y el umbral. Considere este valor como indicativo del tipo de fusión (fusión única vs. simultánea / secuencial o transitoria vs. fusión completa).

Resultados

Los procedimientos de imágenes TIRF y datos de análisis descritos están diseñados para estudiar la dinámica de vesículas en los sistemas celulares. Esta técnica se puede utilizar para determinar los efectos de las moléculas de señalización y las drogas en los eventos de fusión y la dinámica de vesículas de neurotransmisores ^17. El uso de proteínas de la membrana plasmática GFP-etiquetados, el análisis TIRFM se ha empleado para caracterizar el tráfico constitutiva de los transportadores de glu...

Discusión

Este artículo presenta un protocolo para la imagen y analizar la dinámica de vesículas en las células secretoras, utilizando vectores cDNA codificada fluorescentes y TIRFM. Los elementos clave del éxito de formación de imágenes por TIRFM son la selección del modelo celular y transfección celular con indicadores ópticos genéticamente codificados de la liberación de vesículas y el reciclaje.

TIRFM es ideal para las células de crecimiento adherente a una cubierta de vidrio planas ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
Multiline Argon Laser Lasos 77	Lasos	00000-1312-752	multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
Laser TIRF slider	Zeiss	423681-9901-000	http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100x Objective	Zeiss	421190-9900-000	Oil, NA 1.45 Alpha-Plan https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421 190-9900-000&ss=1
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394	QImaging		http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter	Sutter Instrument Company		http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
Software
Image ProPlus 6.3 Software	Media Cybernetics		spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
Excel	Microsoft		photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses http://office.microsoft.com/it-it/excel/
GraphPad Prism 4.00	GraphPad Software, Inc.		statistical analysis http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/