عالية الوضوح تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) طيفية التصوير من أقسام الأنسجة البشرية نحو تحسين علم الأمراض

Summary

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Abstract

عالية الوضوح تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) التصوير الطيفي هو نهج الناشئة للحصول على صور مفصلة التي ترتبط المعلومات الكيميائية الحيوية. ويستند التصوير FT-IR من الأنسجة على مبدأ أن مناطق مختلفة من منتصف الأشعة تحت الحمراء يتم امتصاصها عن طريق روابط كيميائية مختلفة (على سبيل المثال، C = O، CH، NH) داخل الخلايا أو الأنسجة التي يمكن بعد ذلك أن تكون ذات صلة إلى وجود وتكوين من الجزيئات الحيوية (على سبيل المثال، والدهون، DNA، الجليكوجين، والبروتين، الكولاجين). في صورة FT-IR، كل بكسل في الصورة يتكون بأكمله الأشعة تحت الحمراء (IR) الطيف التي يمكن أن تعطي معلومات عن حالة البيوكيميائية للخلايا التي يمكن بعد ذلك استغلالها لخلية من نوع أو مرض من نوع التصنيف. في هذه الورقة، وتبين لنا: كيفية الحصول على صور الأشعة تحت الحمراء من الأنسجة البشرية باستخدام نظام FT-IR، وكيفية تعديل الأجهزة الموجودة للسماح للقدرات التصوير عالي الوضوح، وكيفية تصور الصور FT-IR. نحن بعد ذلك تقديم بعض التطبيقات من FT-IRلعلم الأمراض باستخدام الكبد والكلى على سبيل المثال. التصوير FT-IR يحمل تطبيقات مثيرة في توفير طريقا جديدا للحصول على المعلومات الحيوية من الخلايا والأنسجة في غير الاقلاق مسار تماما خالية من التسمية نحو إعطاء نظرة جديدة إلى تغييرات الجزيئية البيولوجية كجزء من عمليات المرض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه المعلومات الحيوية يحتمل يسمح للتحليل الموضوعي والآلي لبعض جوانب تشخيص الأمراض.

Introduction

وكانت أطياف الأشعة تحت الحمراء أداة تحليلية المتوفرة في بعض شكل منذ 1930s. ومع ذلك، كان فقط خلال العقد الماضي أن مجال التصوير الأنسجة مع FT-IR قد انفجرت. وقد كان الدافع وراء التقدم في FT-IR لتصوير الأنسجة في جزء كبير من قبل ثلاثة تطورات رئيسية: 1) زيادة سرعة الحصول على البيانات نظرا لتوافر كبير صفيف المستوى البؤري (FPA) للكشف عن الذي عادة ما يكون الآلاف من الأشعة تحت الحمراء للكشف عن حساسية ^{1 ، 2،} 2) تطوير خوارزميات المعالجة المتقدمة والقوة الحسابية لمعالجة البيانات الفائقة الطيفية كبيرة تحدد ^3، و 3) نمذجة نظم التصوير FT-IR لتعظيم القرار المكانية ^4،5. كانت هناك العديد من جودة عالية والمواد واسعة جدا إعادة النظر في مجال FT-IR الطيفي مؤخرا ^6-16، بالإضافة إلى ورقة الطبيعة البروتوكولات التي تفاصيل الخطوات للحصول على الأطياف نقطة أو الخرائط من الأنسجة ^(17). في هذه الورقة، سوف نركز على البروتوكول الاضافيocol للحصول على صور من الأنسجة باستخدام 128 × 128 كاشف FPA في تعديل نظام FT-IR مع قدرات عالية الوضوح.

منذ فترة طويلة واقترح FT-IR التصوير ليكون أداة يحتمل أن تكون مرغوبة للخلية والتصوير الأنسجة بسبب القدرة على الحصول على الصور في كل بكسل التي لديها ثروة من المعلومات الحيوية. ويستند FT-IR التصوير على مبدأ أن الجزيئات الحيوية المختلفة في عينة سوف تمتص الكمية مناطق مختلفة من منتصف الأشعة تحت الحمراء. وهذا يسمح للاشتقاق من 'البصمة الكيميائية الحيوية ". قد تظهر هذه البصمات في العديد من الدراسات لتغيير بين أنواع مختلفة من الخلايا والحالات المرضية. خلافا لما حدث في ممارسة علم الأمراض التقليدية التي تحتاج فيها بقع وعلامات المناعى لاستخدامها لتصور وتحديد أنواع الخلايا والهياكل الأنسجة التي تستخدم لتوجيه خيارات التشخيص والعلاج، ويتم تشكيل الصور من FT-IR على أساس الكيمياء الحيوية المتأصل في الأنسجة. وTECHNIQ الحاليرق من الأنسجة تلطيخ للتشخيص هو مضيعة للوقت، مدمرة، شاقة، ويتطلب الخبرة الشخصية للالطبيب الشرعي، في حين FT-IR توفر إمكانية لجعل هذه العملية سريعة وغير مدمرة، الآلي للغاية، وأكثر من ذلك الهدف. وبالإضافة إلى ذلك، توفر FT-IR طريقا جديدا لحصول على معلومات إضافية البيوكيميائية التي قد لا تكون في متناول الجميع باستخدام تقنيات تلطيخ التقليدية.

كان واحدا من أكثر التطورات إثارة في السنوات الأخيرة توافر نهج عالية التصوير القرار الذي يمكن أن تسمح الآن لتصور وتوصيف أنواع الخلايا والهياكل الأنسجة التي تعتبر بالغة الأهمية لتشخيص شامل المرض. واحدة من هذه التقنيات هو الموهن إجمالي الانعكاس (ATR) FT-IR الذي يشتمل على عدسة الغمر الصلبة (SIL) من معامل الانكسار عالية والذي يسمح لارتفاع القرار التصوير ^18، مع العديد من الدراسات المثيرة جدا تظهر تطبيقاتها ^19-25. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه ثكما ثبت مؤخرا أن زيادة القرار المكانية المرتبطة ATR التصوير يمكن أن تسمح لتصور وتصنيف البطانية وخلايا عضلية ظهارية في أنسجة الثدي والتي تشكل عنصرا رئيسيا في تشخيص سرطان الثدي ^26. في حين ATR التصوير مفيد جدا، وهذا الأسلوب يتطلب SIL لاجراء اتصالات مع الأنسجة لتشكيل الصور FT-IR. وبالتالي، واستخدامه يقتصر إلى حد ما لأمراض الأنسجة حيث مناطق واسعة من الأنسجة يجب تصويره بسرعة.

وقد تجلى نهج الثاني اقتران هدف تضخم عالية إلى النظام القائم FT-IR يستخدم السنكروترون كمصدر مشرق من الأشعة تحت الحمراء، فمن الممكن لإلقاء الضوء بالكامل على FPA وصورة مع حجم بكسل فعال من 0.54 X 0.54 ميكرون. هذا يسمح لنا لتصور الهياكل الرئيسية في الثدي والبروستاتا الأنسجة التي لم تكن للحل باستخدام أنظمة FT-IR التقليدية ^4. في حين أن هذه الزيادات الكبيرة في صورة IR resolutio المكانيةن كانت مثيرة، وبقي استخدامها محدود بسبب تتطلب السنكروترون. وفي وقت لاحق، وقد تم تصميم نظام الأمثل والتي قد تسمح أيضا للقدرات التصوير عالية الوضوح مع حجم بكسل 1.1 X 1.1 ميكرون دون اشتراط وجود مصدر السنكروترون بل باستخدام مصدر IR globar التقليدية ^5. في هذه المقالة، وتبين لنا كيفية تعديل نظام التصوير الموجودة التجاري FT-IR للسماح للحيود الأشعة تحت الحمراء محدودة التصوير من الأنسجة مع إشارة مقبولة إلى نسبة الضوضاء باستخدام الأشعة تحت الحمراء أهداف متعددة (15X، 36X، 74X و). حجم بكسل فعال مع الأهداف الثلاثة هي 5.5 × 5.5 ميكرون (15X)، 2.2 X 2.2 ميكرون (36X) و 1.1 X 1.1 ميكرون (74X). نحن ثم إعطاء بعض الأمثلة على أهمية المكاسب التي تحققت في التحليل المكاني للكشف عن المرض في الكبد والكلى الخزعات ^27.

Protocol

1. إقامة FT-IR المجهر والحصول الأنسجة الصور

1. القسم جزءا لا يتجزأ من البارافين كتلة الأنسجة الثابتة الفورمالين في 4 ميكرون سمك الدخول إلى الشريحة المتوافقة مع الأشعة تحت الحمراء باستخدام مشراح. بالتناوب، القسم النيتروجين الأنسجة المجمدة السائلة في 4 ميكرون سمك على شريحة متوافقة IR باستخدام ناظم البرد.
   ملاحظة: عادة، كما سيتم الحصول على قسم تسلسلي على شريحة زجاجية وملطخة خاص (مثل Haematoxylin ويوزين (H & E)) أو وصمة عار المناعى. وبالإضافة إلى ذلك، وخطوط خلايا مستنبتة يمكن زراعتها على الشرائح المتوافقة مع الأشعة تحت الحمراء. يمكن الشرائح المتوافقة مع الأشعة تحت الحمراء يكون الشرائح العاكسة الأشعة تحت الحمراء لوضع انعكاس التصوير (على سبيل المثال، MirrIR الشريحة، والذهب) أو الأشعة تحت الحمراء شرائح شفافة لوضع انتقال التصوير (على سبيل المثال، BAF _2، الكاف _2).
2. تطهير المجهر FT-IR ومطياف باستخدام الهواء الجاف أو غاز النيتروجين الجاف لإزالة الماء في الغلاف الجوي من النظام. الانتظار على الأقل 45 دقيقة قبل التصوير لضمان purg شامله.
3. بارد كل من كاشف FPA (79 K) وكاشف MCT الداخلي في المجهر FT-IR باستخدام النيتروجين السائل. تبريد للكشف عن كل ما يقرب من 6 ساعات.
   تنبيه! النيتروجين السائل هو السائل المبردة ويمكن أن يسبب حروق الباردة، وقضمة الصقيع في الأماكن المغلقة الاختناق.
4. جبل الشريحة عينة على المسرح المجهر لFT-IR التصوير.
5. ضمان الضوء المرئي هو "ON"، ومن ثم إما باستخدام المنظار أو برنامج التقاط العينة (الذي يوفر في الوقت الحقيقي صورة واضحة من الأنسجة)، والتركيز على العينة.
6. فتح الحزمة حزمة البرمجيات مثل القرارات المؤيدة وانقر فوق "استلام"، ثم انقر فوق "تشخيص"، ثم حدد "محاذاة مطياف". تأكد من أن مسار الشعاع إلى كاشف الداخلي مطياف لا عرقلة.
7. انقر على "إعداد التصوير".
8. في علامة التبويب "إلكترونيات"، حدد "سرعة" المناسبة، "تحت سانسبة mpling (UDR) "و" إعدادات مرشحات "اعتمادا على النظام.
   ملاحظة: في هذا المثال، يكون الإعداد سرعة = 2.5 كيلو هيرتز، UDR = 4 والفلاتر = لا شيء.
9. في علامة التبويب "البصريات" ضمان أن "مصدر منتصف IR '،' المفتوحة الفتحة" و "100٪ شعاع المخفف" يتم اختيار.
10. لمعايرة النظام، في علامة التبويب "البصريات"، حدد "الكاشف" على أنه "الأرض '،' المجهر الكاشف" على أنه "غادر"، ثم حدد إما "النفاذية" أو "الانعكاس" تحت عنوان "وضع البصريات" تبعا لنوع من الشريحة المستخدمة.
11. انقر فوق إعداد، والتي سوف تفتح نافذة "مراقبة لانسر".
    ملاحظة: للحصول على وضع انعكاس يتبع تعليمات في 1.12 و1.13 واسطة نقل اتباع الإرشادات الموجودة في 1،14-1،16. تواصل من 1.17 لكل من التفكير وانتقال العدوى.
12. لوضع التفكير، في &# 8216؛ تحكم لانسر "انقر على" الخام ". باستخدام عصا التحكم السيطرة مرحلة ومشاهدة عرض حي للصورة تداخل FT-IR (الصورة أعلى اليمين)، والانتقال إلى منطقة نظيفة على الشريحة.
13. ضبط الوقت التكامل إلى ما يقرب من 8،000 التهم الموجهة إليه. وبعد ذلك، نقل مرحلة لإيجاد قطعة من النسيج مع هيكل، ويفضل حافة الأنسجة، والكمال بؤرة الصورة. التغيير "الدفء" و "التباين" خيارات للمساعدة في تشكيل صورة لتحسين التركيز، وهذا لن يكون له أي تأثير على البيانات IR. تواصل من 1.18.
14. لاسطة نقل، في نقرة "مراقبة لانسر 'على' الخام '. باستخدام عصا التحكم السيطرة مرحلة ومشاهدة عرض حي للصورة تداخل FT-IR (الصورة أعلى اليمين)، والانتقال إلى منطقة نظيفة من الشريحة.
15. ضبط الوقت التكامل إلى ما يقرب من 8،000 التهم الموجهة إليه.
16. ضبط أسفل التركيز / الهدف المكثف لزيادة عدد من التهم إلى اقصى لهام. مشاهدة شكل الصورة اليمنى السفلى في مراقبة لانسر للتأكد من أنه هو جاوس في المظهر وموحدة نسبيا. ضبط الوقت التكامل مرة أخرى إلى ما يقرب من 8،000 التهم الموجهة إليه.
    ملاحظة: إذا كان أي من بكسل في FT-IR صورة تداخل تحويل الأبيض، وتقليل الوقت التكامل.
17. نقل المرحلة لإيجاد قطعة من النسيج مع هيكل، ويفضل حافة النسيج والكمال بؤرة الصورة. اختياريا، تغيير خيارات الدفء والتباين للمساعدة في تشكيل صورة لتحسين التركيز، ولكن لن يكون له أي تأثير على البيانات IR.
18. باستخدام عصا التحكم تحكم المرحلة، والانتقال إلى منطقة نظيفة من الشريحة. اضغط على زر 'معايرة ". ضمان "خارج النطاق (OOR)" القيمة هي أقل من 50 والفرق بين "العليا الجريان" وتعول "منخفضة الجريان" هو على الأقل 4،000 التهم الموجهة إليه.
19. حدد "موافق" مرتين. في علامات التبويب البصريات تحديد. "MCT 'الكاشف' = 'مايكروونالتعامل الكاشف '=' الحق 'ومن ثم انقر فوق "إعداد". عند هذه النقطة سوف يكون هناك تداخل FT-IR على الشاشة. انقر على 'البحث Centerburst ". انقر فوق "حسنا".
20. في علامة التبويب "البصريات"، إعادة تحديد 'الكاشف' = 'الأرض'، 'المجهر الكاشف' = 'اليسار' وحدد "إعداد".
21. في تحكم لانسر - ضمان الصورة لا تزال على منطقة نظيفة وانقر فوق "معايرة" مرة أخرى. انقر فوق "حسنا".
22. التالي، وجمع خلفية الصورة FT-IR لتصحيح الامتصاصية من الغلاف الجوي، ونظام الشرائح. انتقل إلى علامة التبويب "للإلكترونيات 'وحدد قرار الطيفي المناسب، وعادة من 4 سم ^-1 أو 8 سم ^-1 لالأنسجة.
23. انتقل إلى علامة التبويب "الخلفية" واكتب 128 في "المسح للمشاركة في إضافة". حدد الزر "ملف جديد ..." ووضع الملف في الخلفية أضعاف المناسبإيه. تحقق علامة التبويب "التصوير" لضمان mosaicing هو 1 ب 1. انقر على "خلفية"، والانتظار لمسح لإنهاء وتأكيد مكان حفظ الملف. انقر فوق المنطقة على خلفية FT-IR صورة والتحقق من الطيف.
24. لالتقاط صورة فسيفسائية كبيرة من العينة، حدد علامة التبويب "التصوير" وإدراج عدد من X و Y إطارات لحجم الفسيفساء التي ترغب في الحصول عليها.
25. انقر فوق "إعداد" وتحكم لانسر استخدام طريقة عرض IR الحية للعثور على مجال الاهتمام. إذا أخذ فسيفساء، ومركز البث المباشر في منتصف مجال الاهتمام. انقر فوق "حسنا". انتقل إلى علامة التبويب "إلكترونيات" واكتب عدد بالاشعة للمشاركة في إضافة (عادة قيمة بين 2 و 16 بالاشعة لالأنسجة). انقر فوق "مسح".
26. تحقق من جمع صورة FT-IR على الشاشة لضمان أنها تبدو تركيزا. انقر على الصورة لإحضار لطيف الأشعة تحت الحمراء من ذلك الموقع وتحقق من أنه يبدو أن يكون إشارة مقبولة للضوضاء. أكيإعادة صورة واضحة من العينة.
27. حفظ الصورة وتصديره إلى الشكل المطلوب، مثل ENVI-IDL.

2. التكيف على FT-IR المجهر لقدرات عالية الوضوح

ملاحظة: يتم تجهيز معظم النظم FT-IR مع هدف ما يقرب من 15X التكبير و 0.5 الفتحة العددية (NA). إلى الصورة في وضع الوضوح العالي، وهو متوافق IR 36X 74X أو الهدف يمكن أن تستخدم لإعطاء حيود قدرات التصوير محدودة.

1. إزالة الهدف 15X النظام عن طريق فك عكس اتجاه عقارب الساعة.
2. المسمار سواء في الهدف 36X 74X أو في مكانها. محاذاة الهدف قبل استخدامها. استخدام أنابيب تمديد عدسة لتحقيق الهدف قريبة بما فيه الكفاية للعينة.
3. وضع الأنسجة في إطار الهدف الجديد والتركيز باستخدام الضوء المرئي باستخدام المنظار أو برنامج التقاط عينة.
   ملاحظة: يجب أن يتم التصوير عالي الوضوح في وضع الإرسال. المسافة عمل وثيقة جدا للالأهداف ذاتها (1-2 ملم) وعمق ضحل جدا من التركيز فلابد من التركيز ببطء وبعناية، مع الوقت لخفض هدف دون لمس العينة.
4. اتبع التعليمات 1،6 حتي 1،11.
   ملاحظة: نظرا لكونها بشكل ملحوظ أكثر صعوبة في التركيز والكثير ضوء أقل الوصول إلى كاشف، ويتم تعديل البروتوكول التالي على أساس 1.14.
5. في اسطة نقل، انقر على 'الخام'. باستخدام عصا التحكم السيطرة مرحلة ومشاهدة عرض حي للصورة تداخل FT-IR (الصورة أعلى اليمين)، والانتقال إلى الأنسجة والتركيز (مثالي على حافة).
   ملاحظة: قد يكون هذا صعبا، وبالتالي ضبط "الدفء" و "التباين" خيارات للمساعدة في تشكيل صورة لتحسين التركيز (وهذه الخيارات لا يؤثر على البيانات IR).
6. مرة واحدة مركزة، باستخدام عصا التحكم السيطرة مرحلة ويعيش رأي IR الانتقال إلى منطقة نظيفة من الشريحة. ضبط الوقت التكامل إلى ما يقرب من 8،000 التهم الموجهة إليه. ضبط أسفل تركز الهدف لزيادة عدد من التهم إلى الحد الأقصى. ضبط الوقت التكامل مرة أخرى إلى ما يقرب من 8،000 التهم الموجهة إليه.
7. نقل المرحلة لإيجاد قطعة من النسيج مع هيكل، ويفضل حافة الأنسجة، والكمال بؤرة الصورة.
8. إذا الصور الفسيفسائية صورة بدقة عالية، وضبط المرحلة للسماح للحركة الصحيحة المطلوبة عبر مسافات للmosaicing دقيقة. لتغيير إعدادات مسافة المرحلة، انتقل إلى "مرحلة الإعداد" في مراقبة لانسر وضبط إعدادات المحاذاة الأفقية والرأسية للسماح الصور الفسيفسائية الصحيحة.
9. باستخدام جهاز التحكم مرحلة عصا التحكم الانتقال إلى منطقة نظيفة من الشريحة. اضغط على زر 'معايرة ". ضمان خارج النطاق (OOR) قيمة أقل من 50 لكل من 36X 74X والأهداف. ضمان الفرق بين الجريان السامية والقيم منخفضة الجريان هو 1،000 على الأقل التهم لتحقيق الهدف 74X و 2،000 التهم لتحقيق الهدف 36X.
10. مواصلة 1،19-1،27. عدد بالاشعة في 1.23 و1.25 سوف تحتاج إلى تعديل نظرا لانخفاض إشارة إلى ما يقرب من 256 بالاشعة لصورة الخلفية و16-128 مسح للصورة الأنسجة.

3. تصور وتصنيف IR الطيفي مجموعات البيانات

ملاحظة: في هذا القسم، وسوف نناقش كيفية تصور واستخراج البيانات من الصور الطيفية باستخدام معالجة الصور الجغرافية المكانية وتحليل البرمجيات مثل ENVI + IDL، ولكن العملية مشابهة جدا لأي برنامج بديل مثل MATLAB، والبرمجيات الحرة مثل CytoSpec ، أو البرامج المطور الصك الخاص. وهناك عدد قليل من مختلف تقنيات المعالجة الطيفية التي يمكن أن تجرى على البيانات IR.

1. مفتوحة الجغرافية المكانية ومعالجة الصور والبرمجيات وتحليل تحميل ملف البيانات IR.
2. تطبيق خوارزمية تصحيح خط الأساس على البيانات IR عن طريق اختيار "أدوات الطيفية" وانتقل لأسفل وانقر على "الأطياف الامتصاصية". نلاحظ في القائمة المنبثقة وحدد "خط الأساس كورction "
   ملاحظة: تصحيح خط الأساس سيزيل معادلة أساسية المنحدر من البيانات نظرا لتشتتها
3. أداء تطبيع الطيفي، من خلال ratioing البيانات إلى ذروة معينة الطيفية (عادة أميد I (1،650 سم ^-1) أو أميد II (1،550 سم ^-1)) أو منطقة تحت منطقة محددة من الأطياف. القيام بذلك عن طريق اختيار "عادي الأطياف" تحت عنوان "الامتصاصية الأطياف" خيارات القائمة.
   يتم تنفيذ الطيفية التطبيع بحيث أن أي اختلافات في الأطياف هي الاختلافات الحقيقية البيوكيميائية وليس بسبب سمك أو الاختلافات بين كثافة عينات: ملاحظة.
4. استخدام خوارزمية الحد من الضوضاء لإزالة الضوضاء من أطياف إذا لزم الأمر ^28.
   ملاحظة: هناك مناهج متعددة المتاحة التي يمكن أن يتحقق تصحيح خط الأساس، وتطبيع الطيفي والحد من الضوضاء، مع معظم برامج وجود خوارزميات الآلي بنيت في وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدد من النهج الناشئة التي من شأنها تصحيح.الانحرافات الطيفية، والتي تم مناقشتها بالتفصيل ^29-42. ومع ذلك، فإن المجتمع لا يتفق بعد على أي من هذه اللازمة.
5. مراقبة قائمة جميع الترددات IR جمعها داخل الصورة (عادة من مجموعة الطيفي من 900 إلى 4،000 سم ^-1). انقر على الترددات التي تتوافق مع الجزيئات الحيوية محددة لمراقبة صورة من الأنسجة على التردد المحدد.
   1. على سبيل المثال، انقر على 1،650 سم ^-1 فرقة لمراقبة توزيع البروتينات في العينة. انقر بدلا من ذلك على 1،080 سم ^-1 فرقة لمراقبة توزيع الأحماض النووية في العينة. استخدام متجه مموج موجه 1،650 سم ^-1.
6. إنشاء صور إضافية من خلال حساب الطيفية نسب ارتفاع الذروة، نسب منطقة الذروة الخ من شأنها أن تسمح لرؤية المكونات الجزيئية البيولوجية المختلفة. انقر على 'أدوات الطيفية "، ثم حدد إما" نسب الطول الذروة "أو" حساب المساحة صورة "لخلق صور.
7. تفحص قسم الأنسجة المجاورة المقابلة التي اتسخت باستخدام كله نظام تصوير الشريحة منفصل الذي يلتقط الصور brightfield. جنبا إلى جنب مع صورة الأشعة تحت الحمراء، إحضار صورة رقمية من النسيج الملون مع برنامج صورة مرئية.
8. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة في المنطقة من اهتمام واختر 'Z الشخصي'. وهذا يعطي المعلومات الطيفية في بكسل المحدد.
9. نظرة على أطياف الأشعة تحت الحمراء من عدة وحدات البكسل من فئات متعددة، مثل المقارنة بين أنواع الخلايا، الحالات المرضية. علامة بكسل معينة على الصورة باستخدام 'المناطق ذات الاهتمام "(ROI) الأداة. لتنفيذ هذا، انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة واختر 'أداة ROI ". إنشاء الفئات التي يتم ليكون المسمى، على سبيل المثال العادي، وخلل التنسج، والطبقات السرطان. ثم حدد، 'نوع ROI' - 'نقطة'. ثم حدد الفئة لتحديد بكسل لورسم على بكسل المناسبة على صورة الأشعة تحت الحمراء. اشتقاق متوسط ​​الأطياف وأو كل من الفئات باستخدام أداة "متوسط ​​العائد على الاستثمار".
10. قارن الأطياف التي يجنيها بالتآمر في برنامج الرسوم البيانية.

النتائج

التصوير FT-IR يسمح للاشتقاق من الصور IR من الأنسجة التي يمكن أن تعطي تناقضات مختلفة تبعا لتردد الأشعة تحت الحمراء من الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك، في صورة الأشعة تحت الحمراء، ويتكون كل بكسل من الطيف IR بأكمله، مع قمم مختلفة الموافق الجزيئات الحيوية المختلفة التي يمكن أن تعطي معلومات حول الخصائص الكيميائية الحيوية من أنواع الخلايا أو الحالات المرضية (الشكل 1). هنا، لقد أظهرنا كيفية مقارنة بصمات طيفية بين الطبقات، وتصنيف ولكن أكثر تقدما الآلي ممكن باستخدام خوارزميات إضافية ^3،43-50، مثل تصنيف النظرية الافتراضية، عشوائية الغابات، الشبكات العصبية الاصطناعية، والهيكل التنظيمي تحليل العنقودية لا يمكن أن يؤديها على البيانات. سوف النهج تصنيف تحت الملاحظة تسمح لبناء المصنف الذي يمكن تدريب للسماح للاعتراف الآلي من أنواع الخلايا أو الحالات المرضية. النهج تصنيف غير خاضعة للرقابة يمكن أن تستخدم للبحث عن DIF التي تحدث بشكل طبيعيمن مؤتمرات في الأنسجة أو الخلايا بسبب التباين الكيمياء الحيوية.

وقد تطورت FT-IR الأجهزة على مدى العقود القليلة الماضية، من قياس في نقطة / وضع الخرائط واحد باستخدام الأشعة تحت الحمراء فتحات مبهمة إلى وضع التصوير باستخدام الأهداف Cassegrain، وذلك باستخدام إما الهدف إلقاء الضوء على جانب وجود هدف جمع في نقل الوضع أو هدف واحد أن كلا ينير ويجمع في انعكاس الوضع (الشكل 2). وقد تجلى مؤخرا أن الهدف جمع في وضع الإرسال يمكن أن تنتقل عن الملاعب لالتكبير العالي والهدف الفتحة العددية للسماح للحيود محدود التصوير الأشعة تحت الحمراء، الذي يؤدي إلى زيادات كبيرة في القرار المكانية التي تم جمعها من الصور IR ^4،5. قد يكون تقدما في القرار المكانية للتصوير الأنسجة ذات أهمية حاسمة كما يمكننا الآن تحديد أنواع الخلايا والهياكل الأنسجة، وعلى سبيل المثال وحدات وظيفية في الكلى، الكبيبات، وذلك باستخدام تكييفها في المنزلأنظمة FT-IR (الشكل 3).

عالية الوضوح التصوير FT-IR يسمح للصور مفصلة من الأنسجة لفحصها لتحديد المناطق غير الطبيعية وتحديد الاختلافات الحيوية بين أنواع مختلفة من الخلايا. في نواة أنسجة الكبد، فمن الممكن لتصور خلايا الكبد والمناطق بالتسلل التليف الذي يقسم منطقتين متميزة من النمو الشاذ وتليف الكبد غير التنسج (الشكل 4). ونحن نعمل على استغلال هذا لجعل أدوات التشخيص الآلي للاستخدام في الحالات الصعبة من مرض في الكبد.

الأهم من ذلك، يمكن زيادة القرار المكانية الآن تسمح لنا لعزل السمات الهيكلية المحددة التي يمكن تعديلها كيميائيا بواسطة المرض قبل التغيرات النسيجية واضحة. على سبيل المثال، نحن نركز على تحديد التغيرات البيوكيميائية في الهياكل الكبيبي في الكلى مثل كبسولة بومان، مسراق الكبيبة، الغشاء القاعدي الكبيبي وأنبوبي الغشاء القاعدي، قبل التغييرات التي تم تحديدها من قبل الطبيب الشرعي ويمكن ملاحظة (الشكل 5). على وجه الخصوص، ونحن مهتمون في تحديد التغييرات المرتبطة تطور اعتلال الكلية السكري والرفض المزمن في مرضى زرع، حيث فشلت تقنيات الحالية لتحديد التغييرات بطريقة وقت مبكر بما يكفي لتدخل ناجح.

الشكل 1. الصور FT-IR والطيف من نواة الكبد. صورة (A) H & E الملون الأساسية من خزعة الكبد وصور الأشعة تحت الحمراء الامتصاصية من قسم التسلسلي للنفس الأساسية في (B) 3،286 سم ^-1 و (C) 2،603 سم ^-1، الذي سلط الضوء على السمات الهيكلية مختلفة. (D) نموذجي طيف الأشعة تحت الحمراء من الأنسجة، مع القمم الهامة المسمى. على نطاق وبار = 100 ميكرون.fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. البصريات التخطيطي بالتفصيل وسائط تشغيل المجهر FT-IR. (A) في وضع الإرسال، يضيء العينة من خلال هدف القاع، والضوء المار من خلال العينة التي تم جمعها من قبل الهدف العلوي. (B) في وضع التأمل، والهدف من كبار يخدم على حد سواء لإلقاء الضوء على عينة وجمع الضوء المنعكس. لم يتم استخدام الهدف السفلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. مقارنة بين مختلفاأهداف المجهر ر على الصور FT-IR من الكبيبة الكلى في 2،925 سم ^-1. (A) 15X جمع الهدف مع NA = 0.5 (حجم 5.5 × 5.5 ميكرون بكسل). (B) 36X الهدف جمع مع NA = 0.5 (حجم 2.2 X 2.2 ميكرون بكسل). (C) جمع الهدف مع NA 74X = 0.65 (حجم 1.1 X 1.1 ميكرون بكسل). شريط النطاق = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. الاختلافات الطيفية بين التليف وخلايا الكبد في نواة الكبد. (A) H & E الملون الأساسية من خزعة الكبد. (ب) صورة لمقطع الأساسية التسلسلي الممسوحة ضوئيا في FT-IR (36X الإعداد موضوعي). (C) معدل تقييمأطياف resentative من خلايا الكبد والتليف، والتي اتخذت من مناطق الأنسجة المشار إليها السهام في (A) و (B). على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5. التمايز من الميزات خزعة نسيج الكلى من خلال استخدام عالية الوضوح التصوير FT-IR. (A) الدوري حمض شيف القسم الملون مع ميزات ليكون استخراجه المسمى. (B) عالية الوضوح FT-IR صورة CH ₂ غير المتماثلة المنطقة الممتدة (36X الإعداد موضوعي) من قسم التسلسلي للالأنسجة نفسها. (C) ملامح وصفت في (A) استخراج باستخدام صورة FT-IR في (ب) أن يكون قادرا على DIF كيميائياferentiate الميزات أربعة من الأنسجة. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

FT-IR هي طريقة الناشئة عن خالية من التسمية التصوير الكيمياء الحيوية من أقسام الأنسجة، مع احتمال أن يكون لها دور مهم في تحسين مستوى الحالي للتشخيص في علم الأمراض. المعيار الذهبي الحالي للأمراض الأنسجة يتطلب أن تحتاج فحص، ثابتة في الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين، مقطوع عدة مرات، وملطخة البقع متعددة. وقال الطبيب الشرعي المدربين تدريبا عاليا ديه لتقييم ذاتي بصريا بنية الأنسجة والتشكل الخلوي لتحديد التشخيص. نحن هنا تظهر كيفية جمع الصور IR عالية الدقة من نفس النوع من أقسام ومناقشة بعض النهج الحسابية لدراسة الاختلافات الكيميائية بين أنواع الخلايا والحالات المرضية.

الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي للتأكد من أن الأنسجة التي تركز بعناية فائقة وأن النظام معايرة بشكل جيد لضمان البيانات الطيفية ذات جودة عالية جدا. الرعاية عند إعداد هذا النظام هو criti ولا سيما كال عند العمل مع أهداف التكبير عالية. للمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، القائمة التالية تغطي بعض الصعوبات المحتملة التي تمت مواجهتها؛

مشكلة: انخفاض كثافة الأشعة تحت الحمراء عند التصوير في التفكير. الحل: تحقق IR التوجه الشريحة مثل طلاء عاكسة قد تكون على الجانب الخطأ من الشريحة.

مشكلة: انخفاض إشارة / علامة تحذير الأحمر في مراقبة لانسر. الحل: كشف كول مع LN2. مطلوب النيتروجين السائل للكشف عن FPA على العمل ويتطلب دوريا يجري تصدرت تصل.

المشكلة: سرعة الأخطاء الخطأ / الحركة. الحل: إعادة تعيين مطياف وتقليل الاهتزازات. سوف تسبب الاهتزازات المرآة تتحرك في تداخل أن بالانزعاج.

المشكلة: ارتفاع بخار الماء في البيانات. الحل: زيادة تطهير على النظام وحماية عينة من الهواء.

المشكلة: centerburst غير صالح. الحل: البحث centerburst مرة أخرى.

e_content "> المشكلة: الفرق انخفاض تدفق في نقل، على الرغم من تركز الحل: ضبط المكثف أسفل هذا سوف يحدث كما هو لا يجري التركيز ضوء الأشعة تحت الحمراء إلى نقطة على العينة.

في هذه الورقة، فقد ركزنا على كيفية الحصول على صور عالية الوضوح IR من الأنسجة في أي انتقال أو وضع transflectance. طبيعة التصوير FT-IR، هو أن هناك تعديلات المتعددة التي يمكن إدخالها على الحصول على البيانات، مثل، نوع من الركيزة، تقنية التثبيت، سمك العينة، القرار الطيفي، وتداخل سرعة مرآة الخ تأثير هذه المعلمات لديها نوقشت بالتفصيل واسعة في الآونة الأخيرة ^{4،5،17،51.}

وهناك عدد من التعديلات التي يمكن إدخالها على نظام التصوير بما في ذلك التصوير في وضع ATR ^10،24،26 وباستخدام نهج الحرارية النانوية ^52،53 للسماح لارتفاع القرار التصوير IR. القيد الرئيسي مع ارتفاع القرار التصوير IR هو أن منظمة الشفافية الدوليةssues يجب أن يكون مستعدا بعناية ورقيقة بما يكفي لIR لتمرير من خلال (عادة 4 سمك ميكرون). وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب نقل والانعكاس FT-IR التصوير العينات إلى أن تكون جافة بسبب امتصاص الأشعة تحت الحمراء عن طريق المياه. ومع ذلك، FT-IR التصوير ديه مزايا هامة على تقنيات أخرى، في أن ما في وسعها صورة بسرعة جدا مساحات واسعة من الأنسجة في حين اشتقاق المعلومات الكيميائية الحيوية الغنية وتفصيلا. وتشمل التقنيات الأخرى المماثلة التي تستمد المعلومات الحيوية بطريقة خالية من التسمية رامان الطيفي، ولكن وقت الحصول على البيانات أبطأ بكثير للحصول على الصور. النهج الجديد التصوير رامان آخذة في الظهور بما في ذلك محفز رامان نثر (SRS) ومتماسك Antistokes رامان نثر (CARS)؛ ومع ذلك، لديهم مجموعة وصول الطيفية محدود أو التصوير تيرة واحدة.

قد يكون تقدما في سرعة الحصول على البيانات، التحليل المكاني، وتوافر النهج الحسابية من قيمة كبيرة في جعل FT-IR ايماج جي نهجا أكثر جدوى للترجمة كأداة التصوير الجديدة في علم الأمراض. وكانت التطورات الأخيرة في القرار المكانية أهمية خاصة بالنسبة للأمراض الأنسجة نتيجة لأنواع الخلايا الأساسية لا يجري للحل باستخدام نظم التصوير FT-IR التقليدية. الورقة الأخيرة التي ريدي وآخرون. أظهرت كيفية تصميم نموذج نظام مثالي للحصول على قرار المكاني الأمثل لنظام التصوير FT-IR ^5. على سبيل المثال أنسجة الكلى المقدمة في هذه الورقة يوضح أهمية القرارات المكانية أعلى من أجل استخراج المعلومات الحيوية من الهياكل الكبيبي (الشكل 3) والشكل (5). في المستقبل، التطورات الجديدة في الكم تتالي الليزر كما مشرقة جدا مصادر الضوء الأشعة تحت الحمراء ^54-57، 3D الطيفي التصوير ^58، وتحقيق اختراقات في مجال تقنيات النانو IR ^{52،53،59،60} عقد آفاقا جديدة مثيرة من البحوث التي قد يكون لها آثار ضخمة في مستقبل التصوير الأنسجة.

الحمار = "jove_content"> لقد قدمنا ​​أمثلة من التطبيقات في الكبد وأمراض الكلى حيث أن هناك حاجة للحصول على معلومات إضافية الكيميائية الحيوية التي يمكن أن تكون ذات قيمة تشخيصية. ويركز مختبر علم الأمراض الطيفي في قسم علم الأمراض في جامعة إلينوي في شيكاغو على ترجمة تقنيات التصوير IR نحو تحسين تشخيص الأمراض وتحسين التنبؤ بنتائج المرضى. قد التصوير FT-IR التغلب على بعض القيود الحالية في ممارسة علم الأمراض التي تتطلب معلومات كمية وموضوعية. على وجه الخصوص، ويتركز العمل في المستقبل على تحديد المناطق في ممارسة علم الأمراض الحالية حيث تفشل التقنيات الحالية لتوفير الحساسية التشخيصية المناسبة أو تقديم معلومات محدودة. وثمة حاجة واضحة في تحسين الممارسة الحالية للعلم الأمراض ونحو إعطاء المزيد من المعلومات إلى الطبيب الشرعي حول حالة مرض المريض، والتي قد تكون قابلة للتحقيق باستخدام عالية الوضوح التصوير FT-IR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 600 Series FT-IR system	Agilent	Multiple configurations	Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR	Edmund Optics	66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR	Edmund Optics	66-586
MirrIR slide	Kevley Technologies	CFR	For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides	International Crystal Laboratories	Multiple sizes	For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides	International Crystal Laboratories	Multiple sizes	For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas	Multiple gas suppliers	Multiple sizes
Hexane	Sigma Aldrich	Multiple sizes	For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen	Multiple cryogenic liquid suppliers	Multiple sizes
ENVI-IDL software	Exelis-Vis		Other software packages available
Whole slide Imager	Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)		To image stained slides