Yüksek çözünürlüklü Fourier Patoloji iyileştirilmesi yönünde İnsan Doku Bölümler Kızılötesi (FT-IR) Spektroskopik Görüntüleme Dönüşümü

Özet

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Özet

Yüksek çözünürlüklü Fourier Kızılötesi (FT-IR) spektroskopik görüntüleme biyokimyasal bilgi ilişkili olan detaylı görüntüler elde etmek gelişmekte olan bir yaklaşımdır Transform. Doku FT-IR görüntüleme orta kızıl ötesi farklı bölgeleri, varlığı ve bileşimine bağlı olabilir (örneğin, C = O, CH, NH) hücre veya doku içinde farklı kimyasal bağlar tarafından absorbe edilir prensibine dayanır biyomoleküllerin (örneğin, lipidler, DNA, glikojen, protein, kollajen). FT-IR görüntüsü olarak, görüntü içindeki her bir piksel daha sonra, hücre tipi veya hastalık tipi sınıflandırma için yararlanılabilir hücrelerin biyokimyasal durumu hakkında bilgi verebilir tüm Kızılötesi (IR) spektrum içerir. Bu yazıda göstermek: Bir FT-IR sistemini kullanarak insan dokularından IR görüntüleri edinme, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yetenekleri için izin ve nasıl FT-IR görüntüleri görselleştirmek için mevcut enstrümantasyon değiştirmek nasıl. Daha sonra FT-IR bazı uygulamaları sunmakpatoloji için örnek olarak karaciğer ve böbrek kullanarak. FT-IR görüntüleme hastalık süreçlerinin bir parçası olarak biyomoleküler değişiklikler yeni fikir veren yönelik tamamen etiket ücretsiz olmayan bozucu rota hücreleri ve doku biyokimyasal bilgi edinmek için yeni bir rota sağlayan heyecan verici uygulamaları tutar. Ayrıca, bu biyokimyasal bilgiler potansiyel hastalık tanısı bazı yönlerinin nesnel ve otomatik analiz için izin verebilirsiniz.

Giriş

IR spektroskopisi 1930'lardan beri bazı şeklinde kullanılabilir bir analitik araç olmuştur; Ancak, sadece FT-IR ile doku görüntüleme alanı patladı son on yıl içinde be. nedeniyle büyük Odak Düzlemi Array durumu (FPA) genellikle IR duyarlı dedektörler ¹ binlerce dedektörler için veri toplama 1) artış hızı: doku görüntüleme için FT-IR gelişmeler üç temel gelişmelerin büyük bir bölümünde tahrik edilmiştir ^gelişmiş işleme algoritmaları ve büyük hiperspektral verileri işlemek için hesaplama gücü ^2, 2) geliştirme ^3. setleri, ve FT-IR görüntüleme sistemlerinin 3) modelleme uzaysal çözünürlüğü ^4,5 maksimize etmek. Dokulardan ¹⁷ point spektrumları veya haritalar elde etmek için adımlar detayı Doğa Protokolleri kağıda ek olarak çok sayıda yüksek kaliteli ve son zamanlarda ^6-16 FT-IR spektroskopisi alanını gözden çok geniş makaleler, olmuştur. Bu yazıda, prot üzerinde durulacakocol yüksek çözünürlüklü yetenekleri ile modifiye FT-IR sisteminde 128 x 128 FPA dedektör kullanılarak dokuların görüntüleri elde etmek.

FT-IR görüntüleme uzun nedeniyle her piksel biyokimyasal bilgi hazinesi olan görüntüleri elde etmek için yeteneği hücre ve doku görüntüleme için bir potansiyel arzu araç olarak öne sürülmüştür. FT-IR görüntüleme, bir numunedeki farklı biyomoleküllerin kantitatif orta kızıl ötesi farklı bölgelerini emeceği ilkesine dayanmaktadır; Bu bir 'biyokimyasal parmak izi' türetilmesi için izin verir. Bu parmak izi farklı hücre tipleri ve hastalık durumları arasında değiştirmek için birçok çalışmalarda gösterilmiştir olmuştu. Lekeleri ve immünohistokimyasal belirteçler görselleştirmek ve tanı ve tedavi seçeneklerini yönlendirmek için kullanılan hücre tiplerini ve doku yapıları belirlemek için kullanılması gereken geleneksel patoloji uygulamada aksine, FT-IR görüntüleri doku doğal biyokimya dayanarak oluşturulmuştur. Mevcut techniqTanı için boyama dokusunun vi zaman alıcı, zahmetli, yıkıcı ve FT-IR Bu süreç, hızlı tahribatsız, yüksek otomasyonlu ve daha objektif hale getirmek için potansiyeli sunmaktadır ise, patolog öznel uzmanlık gerektirir. Buna ek olarak, FT-IR, geleneksel boyama teknikleri kullanılarak kolayca erişilebilir olmayabilir ilave biyokimyasal bilgi elde etmek için yeni bir yol sağlar.

Son yılların en heyecan verici gelişmelerden biri artık hücre tipleri ve kapsamlı bir hastalık tanısı için kritik olan doku yapılarının görselleştirme ve karakterizasyonu için izin yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlarının kullanılabilirliği olmuştur. Bu tekniklerden biri de birçok heyecan verici çalışma uygulamaları ^19-25 gösteren, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ¹⁸ sağlayan bir yüksek kırılma indeksi, bir katı daldırma lens (SIL) içerir zayıflatılmış Toplam Yansıtma (ATR) FT-IR olduğunu. Buna ek olarak, ağırlıkolarak son zamanlarda ATR görüntüleme ile ilişkili artmış uzaysal çözünürlüğü endotelyal ve meme kanseri teşhisi ²⁶ kilit bileşeni oluşturan meme dokusunda miyoepitelyal hücrelerin görselleştirme ve sınıflandırılması için izin olduğunu göstermiştir. ATR görüntüleme çok yararlı olmakla birlikte, bu teknik, FT-IR görüntü oluşturmak için doku ile iletişim kurmak için SIL gerektirmektedir; bu nedenle, bir kullanımı bir bakıma dokuların büyük bir kısmının hızlı bir şekilde görüntülenmiştir gereken doku patolojisi ile sınırlıdır.

İkinci bir yaklaşım IR parlak bir kaynağı olarak bir sinkrotron kullanan varolan bir FT-IR, sisteme yüksek bir büyütme amacı birleştirilmesi ile gösterilmiştir, tamamen 0.54 x 0.54 um etkili bir piksel boyutuna sahip bir FPA ve resmi de aydınlatılması mümkündür. Bize konvansiyonel FT-IR sistemleri ⁴ kullanılarak çözülebilir değildi meme ve prostat dokularında önemli yapıları görselleştirmek için bu izin. IR görüntü mekansal çözünürlük bu dramatik artışlar olurkenn kullanımı nedeniyle sinkrotron gerektiren sınırlı kalmıştır, heyecan verici idi. Daha sonra, optimal sistem aynı zamanda yüksek çözünürlüklü görüntüleme bir sinkrotron kaynağı gereksinimi olmadan 1.1 x 1.1 mikron piksel boyutu ile yetenekleri değil, geleneksel bir globar IR kaynağı ⁵ kullanmak için izin verebilir dizayn edilmiştir. Bu makalede, biz çoklu IR hedefleri (15X, 36X ve YOK 74X) kullanarak gürültü oranı kabul edilebilir bir sinyal ile dokuların kırınım sınırlı IR görüntüleme için izin varolan ticari FT-IR görüntüleme sistemi değiştirmek için nasıl gösterir. Üç hedefleri ile etkin piksel boyutu 5.5 x 5.5 mm (15X), 2.2 x 2.2 mm (36X) ve 1.1 x 1.1 mm (YOK 74X). Daha sonra karaciğer ve böbrek biyopsileri ²⁷ hastalık tespiti için mekansal çözünürlükte kazanımların önemini bazı örnekler vermek.

Protokol

1. Doku Görüntüleri bir FT-IR Mikroskop kurma ve Kazanılması

1. Bölüm bir mikrotomu kullanarak IR uyumlu slayta 4 mikron kalınlığında bir formalin ile fikse parafine gömülü doku bloğu. Seçenek olarak ise, bölüm bir kriyostat kullanarak bir IR uyumlu slayt üzerine 4 mm kalınlığında bir sıvı azot dondurulmuş doku.
   NOT: Genellikle, bir seri bölüm cam slayt üzerinde elde edilecek ve ya immünohistokimyasal leke (örneğin Hematoksilen ve Eosin (H & E) gibi) özel ile boyandı. Buna ek olarak, kültürlenmiş hücre çizgileri İR uyumlu slaytlar üzerinde yetiştirilir. IR uyumlu slaytlar iletim modu görüntüleme için yansıma modu görüntüleme (örneğin, MirrIR slayt, altın) veya IR şeffaf slaytlar IR yansıtıcı slaytlar olabilir (örneğin, BaF _{2, CaF2).}
2. Sistemden atmosferik su çıkarmak için kuru hava veya kuru azot gazı kullanarak FT-IR mikroskop ve spektrometresi temizleyin. Ayrıntılı purg sağlamak için görüntüleme öncesi en az 45 dakika bekleyinör.
3. Serin FPA dedektör hem (79 K) ve sıvı azot kullanılarak FT-IR mikroskop iç MCT dedektör. Dedektörleri yaklaşık her 6 saat soğutulur.
   DİKKAT! Sıvı nitrojen bir kriyojenik sıvı ve soğuk yanıklara, donmaya ve kapalı alanlarda boğulma içinde neden olabilir.
4. FT-IR görüntüleme için mikroskop sahnede örnek slayt monte edin.
5. Görünür ışık emin olun sonra ya dürbün ya da (bir gerçek zamanlı doku görünür görüntü sağlar) örnek yakalama programı kullanarak "AÇIK" ve bir numune üzerinde odaklanmak.
6. Böyle yanlısı kararları gibi paket yazılım paketi açın ve 'Toplama' tıklayın, ardından 'Tanı' ve ardından 'Hizala Spektrometre' tıklayın. Spektrometre iç dedektöre ışın yolu tıkalı olmadığından emin olun.
7. 'Görüntüleme Kur' üzerine tıklayın.
8. 'Elektronik' sekmesinde, Sa Altında ', uygun' Speed ​​'seçeneğinimpling Oranı (SDR) 've' sistemine bağlı Filtreler 'ayarları.
   NOT: Bu örnekte, ayar, SDR = 4 ve Filtreler = Yok Hız = 2.5 KHz olduğunu.
9. 'Optics'in sekmesinde' Orta IR kaynağı ',' Açık diyafram 've'% 100 kiriş zayıflatıcı 'seçili olduğundan emin olun.
10. 'Optics'in sekmesinde' Ground 'olarak seçin' Dedektör 'sistemini, kalibre etmek için,' Sol 'olarak' Mikroskop Dedektörü ', ve sonra türüne bağlı olarak' Geçirgenlik 'ya da' Optik modu 'altında' Yansıtılması 'birini seçin kullanılarak hazırlanmıştır kaydırın.
11. 'Lancer Kontrolü' pencere açılacaktır, Kur'u tıklatın.
    NOT: yansıma modu 1.12 ve 1.13 ve iletim modu 1,14-1,16 yönergeleri izleyin talimatlarını takip edin. Yansıma ve iletim hem de 1.17 den devam edin.
12. Yansıma modu için, içinde &# 8216; Raw 'Lancer Denetimi' üzerine tıklayın '. Sahne Kontrol çubuğunu kullanarak ve FT-IR interferogram görüntüde (sağ üst resim) canlı görünümünü izlerken, slayt üzerinde temiz bir alana taşıyın.
13. Yaklaşık 8.000 sayıları entegrasyon süresini ayarlayın. Sonraki, yapıyla doku parçası, bir doku tercihen kenarına bulmak için sahneye taşımak ve görüntünün odağını mükemmel. Değişim 'Sıcaklık' ve odaklama geliştirmek için bir görüntü oluşturmak yardımcı olmak için 'Kontrast' seçeneği, bu kızılötesi veri üzerinde hiçbir etkisi olmayacaktır. 1.18 den devam edin.
14. 'Raw' üzerinde 'Lancer Denetimi' tıklama iletim modu için. Sahne Kontrol çubuğunu kullanarak ve FT-IR interferogram görüntüde (sağ üst resim) canlı görünümünü izlerken, slayt temiz bir alana taşıyın.
15. Yaklaşık 8.000 sayıları entegrasyon süresini ayarlayın.
16. Onun büyük zıplama için sayıyı artırmak için odaklama / kondansatör hedefi alt ayarlayınm. Bu görünüşte Gauss ve nispeten homojen olduğundan emin olmak için Lancer Kontrol sağ alt görüntünün şeklini izlemek. Yaklaşık 8.000 sayıları yeniden entegrasyon süresini ayarlayın.
    NOT: FT-IR interferogram görüntüdeki piksellerin herhangi bir beyaz açarsanız, entegrasyon süresini azaltmak.
17. Yapısı ile bir doku parçası, bir doku tercihen kenarını bulmak ve görüntünün odağını mükemmel sahne taşıyın. İsteğe bağlı olarak, odaklama geliştirmek için bir görüntü oluşturmak yardımcı olmak için sıcaklık ve kontrast seçeneklerini değiştirmek, ancak kızılötesi veri üzerinde hiçbir etkisi olmayacaktır.
18. Sahne Kontrol çubuğunu kullanarak, slayt temiz bir alana taşıyın. 'CALIBRATE' düğmesine basın. Emin olun 'Range (OOR) Out Of' değeri 50'den az olan ve 'High Flux' ve 'Düşük Flux' sayımları arasındaki fark en az 4.000 sayar.
19. Iki kez 'Tamam' seçeneğini seçin. Optik sekmelerde seçin; 'Dedektörü' = 'MCT', 'MicrosDedektörü '=' Sağ baş 've ardından' Setup '. Bu noktada, ekranda bir FT-IR interferogram olacaktır. 'Centerburst Bul' üzerine tıklayın. 'Tamam' düğmesine tıklayın.
20. 'Optics'in sekmesinde,' Dedektörü '=' Ground ',' Mikroskop Dedektörü '=' Setup '' Sol 've seçin yeniden seçin.
21. Lancer Denetim - resim temiz bir alanda hala sağlamak ve tekrar 'Kalibre' tıklayın. 'Tamam' düğmesine tıklayın.
22. Sonraki, atmosfer, sistem ve slayt absorbans düzeltmek için bir plan FT-IR görüntü toplamak. 'Electronics'in' sekmesine gidin ve 4 cm ^-1 veya 8 cm ^-1 dokusu için tipik, uygun spektral çözünürlüğü seçin.
23. 'Arka Plan' sekmesine gidin ve 'işbirliği eklemek için tarar' de 128 yazın. 'Yeni Dosya ...' düğmesini seçin ve uygun kat arka plan dosyasını yerleştiriner. Mosaicing 1. Click 'Arka Plan' 1 sağlamak için 'Imaging'e' sekmesini kontrol edin, bitirmek ve nerede dosyayı kaydetmek için onaylamak için tarama bekleyin. Arka plan FT-IR görüntü üzerinde bir bölgeyi tıklayın ve spektrumu kontrol edin.
24. Numunenin büyük bir mozaik görüntü çekmek için, 'Imaging'e' sekmesini seçin ve kazanmak isteyen mozaik boyutu için X ve Y kare sayısını yerleştirin.
25. 'Setup' tıklayın ve Lancer Kontrol ilgi alanı bulmak için canlı IR görünümünü kullanın. Bir mozaik alarak Eğer, ilgi alanının ortasında canlı yem merkezi. 'Tamam' düğmesine tıklayın. 'Electronics'in' sekmesine gidin ve (doku için 2 ve 16 taramalar arasında tipik bir değer) işbirliği eklemek için taramalar sayısını yazın. 'Tara' tıklayın.
26. O odaklanmış görünüyor emin olmak için ekranda toplanan FT-IR görüntü kontrol edin. Bu konumdan bir IR spektrumunu getirmek ve gürültü kabul edilebilir bir sinyal var görünüyor olmadığını kontrol için resmin üzerine tıklayınız. Acquiörnek bir görünür bir görüntü yeniden.
27. Görüntü kaydetme ve ENVI-IDL gerekli biçime ihracat.

2. Yüksek çözünürlüklü Yetenekleri için bir FT-IR Mikroskop Uyarlama

NOT: Çoğu FT-IR sistemleri yaklaşık objektif 15X büyütme ve 0.5 sayısal açıklık (NA) ile donatılmıştır. Yüksek çözünürlüklü modunda görüntü, bir kızılötesi uyumlu 36X veya YOK 74X objektif kırınım sınırlı görüntüleme yetenekleri vermek için kullanılabilir.

1. Saat yönünün tersine sökerek sistemin 15X objektif çıkarın.
2. Onun yerine 36X veya YOK 74X objektif ya vidalayın. Kullanmadan önce hedefi hizalayın. Numune yeterince objektif yakın getirmek için objektif uzatma tüpleri kullanın.
3. Yeni hedef altında dokuyu yerleştirin ve dürbün ya da örnek Yakalama programı kullanarak görünür ışık kullanarak odak.
   NOT: Yüksek çözünürlüklü görüntüleme iletim modunda yapılmalıdır. çok yakın çalışma mesafesise hedefleri (1-2 mm) ve odak derinliği çok sığ örneği dokunmadan hedefi düşürmek için zaman ayırdığınız, yavaş ve dikkatli bir şekilde odaklama gerektirir.
4. 1,6-1,11 yönergeleri izleyin.
   NOT: anlamlı odaklanmak için daha zor ve dedektör ulaşan çok daha az ışık olmak nedeniyle, aşağıdaki protokol 1.14 dayalı ayarlanır.
5. İletim modunda, 'Raw' üzerine tıklayın. Sahne Kontrol çubuğunu kullanarak ve FT-IR interferogram görüntüde (sağ üst resim) canlı görünümünü izlerken, dokuya taşımak ve (bir kenarında ideal) odaklanmak.
   NOT: Bu nedenle (bu seçenekler IR verileri etkilemez var) odaklama geliştirmek için bir görüntü oluşturmak yardımcı olmak için 'Sicakkanlilik' ve 'Kontrast' seçeneklerini ayarlamak zor olabilir.
6. Bir kez sahne kontrol joystick ve slayt temiz bir alanda canlı IR görünümü hareket kullanarak, odaklı. Yaklaşık 8.000 sayıları entegrasyon süresini ayarlayın. Amacını odaklama alt ayarlayınonun maksimum sayıyı artırmak. Yaklaşık 8.000 sayıları yeniden entegrasyon süresini ayarlayın.
7. Yapısı ile bir doku parçası, bir doku tercihen kenarına bulmak için sahneye taşımak ve görüntünün odağını mükemmel.
8. Yüksek çözünürlükte bir görüntü Mozaikleme ise, doğru mozaikleme için mesafeler boyunca gereken doğru hareketine izin vermek üzere sahneye ayarlayın. Sahne mesafe ayarlarını değiştirmek için, Lancer Kontrolü 'Kur aşamasında' gidin ve doğru Mozaikleme sağlamak için yatay ve dikey hizalama ayarlarını.
9. Slayt temiz bir alanda sahne kumanda kolu hareket kullanma. 'CALIBRATE' düğmesine basın. Menzil (OOR) değeri Out Of olun hem 36x ve YOK 74X hedefleri için daha az 50'dir. Yüksek Flux ve Düşük Akı değerleri arasındaki fark YOK 74X hedefi için en az 1.000 sayımları ve 36X objektif için 2.000 sayımları olduğundan emin olun.
10. 1,19-1,27 devam edin. 1.23 yılında tarama sayısı ve1.25 arka plan görüntüsü için yaklaşık 256 tarama ve doku görüntüsü için 16-128 taramalar indirgenmiş sinyal nedeniyle ayarlanması gerekir.

3. görselleştirme ve Sınıflandırılması IR spektral veri kümeleri

NOT: Bu bölümde, biz görselleştirmek ve ENVI + IDL gibi yazılımları coğrafi görüntü işleme kullanarak ve analiz spektral görüntü veri ayıklamak nasıl görüşecek, ancak süreç gibi MATLAB gibi CytoSpec gibi özgür yazılım olarak herhangi bir alternatif yazılım için çok benzer veya alet geliştirici kendi yazılım. İR veri gerçekleştirilebilir birkaç farklı spektral işleme teknikleri vardır.

1. Açık coğrafi görüntü işleme ve analiz yazılımları ve kızılötesi veri dosyası yüklenemedi.
2. "Spektral araçları" seçerek IR verilerine bir temel düzeltme algoritması uygulayın ve aşağı kaydırın ve "Absorbans spektrumları" tıklayın. Bir pop-up menü gözlemlemek ve "Temel correction "
   NOT: Temel düzeltme nedeniyle saçılma veri bir başlangıç ​​ofset eğim kaldıracaktır
3. Spektrumları tanımlanmış bir bölge altında belli bir spektral tepe (genellikle Amid I (1.650 cm ^-1) veya Amid II (1.550 cm ^-1)) ya da bölgeye verileri oranlama yoluyla, spektral normalleşme gerçekleştirin. "Absorbans Spectra" menü seçenekleri altında "Normal spektrumları" seçerek yapın.
   NOT: spektrumları herhangi bir farklılık gerçek biyokimyasal farklılıklar ve kalın nedeniyle veya numune arasındaki yoğunluk farkı böylece spektral normalleşme yapılır.
4. Gerekli ²⁸ ise spektrumları gürültü çıkarmak için bir gürültü azaltma algoritması kullanın.
   . Başlangıç ​​düzeltme, spektral normalleşme ve gürültü azaltma çoğu yazılım inşa otomatik algoritmalar sahip, elde edilebilir ulaşabilirsiniz birden yaklaşımlar vardır ek olarak, düzeltmek olacak yaklaşımlar ortaya çıkan bir sayısı vardır: NOTdetaylı ^29-42 tartışılmıştır spektral sapmaları; Ancak, toplum henüz gerekli bu hangi kabul etmez.
5. (Tipik olarak 900 ile 4000 cm spektral aralıkta ^-1) görüntü içinde toplanan tüm IR frekansları listesi gözlemleyin. Seçilen frekansta doku bir görüntü gözlemlemek için özel biyomoleküllerin karşılık frekanslarda tıklayın.
   1. Örneğin, numunedeki protein dağılımını gözlemlemek için 1650 cm ^-1 bant tıklayın. Alternatif olarak numune nükleik asitlerin dağılımını gözlemlemek için 1080 cm ^-1 bant tıklayın. 1.650 cm dalgasayısı kullanın ^-1.
6. Farklı biyomoleküler bileşenlerin görünüm için izin verecek vb spektral pik yükseklik oranları, pik alanı oranları hesaplanarak ek görüntüler oluşturun. 'Spektral Araçlar' üzerine tıklayın ve ardından seçin ya 'Tepe Yükseklik Oranlarını' veya 'Görüntü Alan hesaplayın'görüntüler oluşturmak için.
7. Aydınlık görüntüleri yakalar ayrı bir bütün slayt görüntüleyici sistemi kullanılarak lekeli karşılık gelen komşu doku bölümü tarayın. IR görüntüsünün yanı sıra, görünür bir görüntü programı ile boyanmış doku dijital görüntüsünü getirmek.
8. Sağ ilgi bölgede resmin üzerine tıklayın ve 'Z profili' seçeneğini seçin. Bu seçilen piksel spektral bilgi verecektir.
9. Bu hücre tipleri, hastalık durumlarını karşılaştırılması gibi çeşitli sınıflar, birden fazla piksel IR spektrumları bak. 'İlgi Bölgeler' (ROI) aracını kullanarak resmin Mark belirli piksel. Bu gerçekleştirmek için, resmin üzerine sağ tıklayın ve 'ROI aracını' seçeneğini seçin. Normal örneğin, displazi ve kanser sınıfları için, etiketlenmesine sınıfları oluşturun. 'Nokta' - Sonra, 'ROI türünü' seçin. Ardından için piksel seçmek ve IR görüntüsünün uygun piksel çizmek için sınıfı seçin. Ortalama spektrumları f türetveya 'Ortalama ROI' aracını kullanarak sınıfların her.
10. Grafik yazılımı komplo ile elde spektrumları karşılaştırın.

Sonuçlar

FT-IR görüntüleme ilgi IR frekansına bağlı olarak farklı kontrastlar verebilir doku IR görüntülerinin türetilmesi için izin verir. Buna ek olarak, bir IR görüntüsü ile, her bir piksel hücresi türleri veya hastalık hallerinin (Şekil 1) biyokimyasal özellikleri hakkında bilgi verebilir farklı biyomoleküllerin karşılık gelen farklı zirveleri ile tüm İR spektrumu içerir. Burada, biz ancak daha gelişmiş otomatik sınıflandırma yapılabilir gibi Bayes sınıflandırma, Rastgele Orman, Yapay Sinir Ağları, ve Hiyerarşik Kümeleme Analizi gibi ek algoritmaları ^3,43-50 kullanarak mümkündür, sınıflar arasındaki spektral imza karşılaştırmak nasıl göstermiştir Eldeki. Kontrollü Sınıflandırma yaklaşımlar hücre tipi veya hastalık durumunun otomatik tanıma izin verecek şekilde eğitilmiş bir sınıflandırıcı yapımı için izin verir. Denetimsiz sınıflandırma yaklaşımları doğal dif oluşan bakmak için kullanılabilirdokuda farklar veya biyokimyasal varyans nedeniyle hücreler.

FT-IR enstrümantasyon, Cassegrain hedeflerini kullanarak görüntüleme modu IR opak delikleri kullanarak tek bir nokta / eşleme modunda ölçüm kullanarak ya da iletim modunda bir toplama amaç ya da tek bir amacı ile birleştiğinde bir aydınlatıcı objektif gelen, son birkaç on yıl içinde gelişti yanar ve yansıma modda toplar (Şekil 2), hem o. Son zamanlarda iletim modunda toplama hedefi toplanan IR görüntülerin ^4,5 mekansal çözünürlükte önemli artışlara yol açar kırılma sınırlı IR görüntüleme için izin vermek için daha yüksek büyütme ve sayısal açıklık hedefi için dışarı açık olması ispatlandı. Şimdi, örneğin, böbrek, glomerüllerinde fonksiyonel birimleri hücre tiplerini ve doku yapıları belirlemek gibi doku görüntüleme için mekansal çözünürlükte gelişmeler içi uyarlanmış kullanarak, kritik öneme olmuşturFT-IR sistemleri (Şekil 3).

Yüksek çözünürlüklü FT-IR görüntüleme anormal bölgeleri tespit etmek ve farklı hücre tipleri arasındaki biyokimyasal farklılıkları belirlemek için incelenecek dokuların ayrıntılı görüntüler sağlar. Bir karaciğer dokusu çekirdek olarak, displazi ve olmayan displastik siroz (Şekil 4) iki farklı alanlarını ayıran fibrozis infiltratif hepatositlerin ve bölgeleri görselleştirmek mümkündür. Biz karaciğer hastalığı zor durumlarda kullanılmak üzere otomatik tanı araçları haline getirme yolunda bu yararlanabilmesi için çalışıyoruz.

Önemlisi, artan uzaysal çözünürlüğü şimdi bize histolojik değişiklikler belirgindir önce kimyasal hastalık modifiye edilebilir spesifik yapısal özellikleri izole etmek izin verebilirsiniz. Örneğin, daha önce, böyle Bowman kapsül, mesangium, glomerüler bazal membran ve boru şeklindeki bazal membran olarak böbrek glomerüler yapılarında biyokimyasal değişikliklerin belirlenmesi odaklandık patolog tarafından belirlenen değişiklikler (Şekil 5) görülebilir. Özellikle, biz mevcut teknikler başarılı müdahale için erken yeterli şekilde değişiklikleri tanımlamak için başarısız transplant hastalarında, diyabetik nefropati ve kronik rejeksiyon ilerlemesi ile ilişkili değişikliklerin belirlenmesi ilgilendi.

(A), H & E (B) karaciğer biyopsisi ve aynı iç bölmede seri IR absorbans görüntülerden çekirdek lekeli 3286 ^cm-1 ve (C) 2603 bir karaciğer çekirdek Şekil 1. FT-IR görüntü ve spektrumu. Resim farklı yapısal özellikler vurgulanan cm ^-1. Etiketli önemli tepe noktalarının (D) doku Tipik IR spektrumu,. Ölçek çubuğu = 100 mikron.fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 2. Optik şematik detaylandırma FT-IR mikroskop çalışma modları. (A) iletim modunda, numune alt amaç ile aydınlatılmış ve numune geçen ışık üst hedefi ile toplanır. Yansıma modunda (B), üst amacı hem örnek aydınlatmak ve yansıyan ışık toplamak için hizmet vermektedir. Alt amaç kullanılmaz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ayırıcı Şekil 3. Karşılaştırılması2,925 cm ^-1 NA ile. (A) 15X toplama hedefi = 0.5 (5.5 x 5.5 mikron piksel boyutu) bir böbrek glomerül FT-IR görüntüleri t mikroskop hedefleri. NA ile (B) 36X toplama amacı = 0.5 (2.2 x 2.2 mikron piksel boyutunda). NA ile objektif toplama (C) YOK 74X 0.65 (1.1 x 1.1 mikron piksel boyutu) =. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil karaciğer çekirdeğinde fibrozis ve hepatositler arasında 4. spektral farklılıklar. Karaciğer biyopsisi (A) H & E boyalı çekirdek. (B) FT-IR taranan bir seri bölüm çekirdek (36X objektif kurulum) resmi. (C) Tecrüberesentative (A) 'de oklarla gösterilmektedir doku bölgelerden alınan hepatositlerin ve fibrozis spektrumu ve (B). Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yüksek çözünürlüklü bir FT-IR görüntüleme kullanılarak böbrek doku biyopsisi özellikler Şekil 5 farklılaşması. Özelliklere sahip, (A) periyodik asit-Schiff Kesitler etiketli ekstre edilecek. (B), aynı doku seri bölümünün CH ₂ asimetrik uzanan coğrafyada (36X objektif kurulum) Yüksek çözünürlüklü FT-IR görüntü. (C), (A) kimyasal dif edebilmek için (B) FT-IR görüntü kullanılarak ekstre etiketli ÖzelliklerDört doku özelliklerini farklılaştıran. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

FT-IR patoloji tanı mevcut standart iyileştirmede önemli bir role sahip potansiyeline sahip, doku kesitlerinin etiket ücretsiz biyokimyasal görüntüleme için gelişmekte olan bir yöntemdir. patoloji mevcut altın standart dokular, parafin gömülü, formalin sabit, biopsi birden çok kez kesitli ve birden fazla lekeler ile boyanmış gerektirir. Bir yüksek eğitimli patolog öznel görsel bir tanıyı belirlemek için doku yapısı ve hücresel morfoloji değerlendirmek zorundadır. Burada bölümlerin aynı tip yüksek çözünürlüklü kızılötesi görüntüleri toplamak ve hücre tipleri ve hastalık durumlarında arasındaki kimyasal farklılıkları incelemek için hesaplamalı yaklaşımlar bazı tartışmak nasıl gösterir.

Bu protokol kapsamında kritik adımlar dokular çok dikkatli odaklı olmasını sağlamak için vardır ve sistem de çok kaliteli spektroskopik verileri sağlamak için kalibre edilir. sisteminin kurulması bakım özellikle criti olduğunu cal yüksek büyütme hedefleri ile çalışırken. Sorun giderme yardımcı olmak için, aşağıdaki liste karşılaşılan olası bazı zorlukları kapsar;

Sorun: yansıma görüntüleme Düşük IR şiddeti. Çözüm: yansıtıcı kaplama slayt yanlış tarafında olabilecek IR slayt yönünü kontrol edin.

Sorun: Lancer Kontrol Düşük sinyal / Kırmızı uyarı işareti. Çözüm: LN2 ile serin dedektörler. Sıvı azot çalışması FPA dedektörler için gereklidir ve periyodik tepesinde olmak gerektirir.

Sorun: Hız hatası / hareket hataları. Çözüm: spektrometre Reset ve titreşimleri azaltır. Titreşimler interferometreye hareketli ayna rahatsız neden olur.

Sorun: veri Su buharı ani. Çözüm: sistemde tasfiye artırın ve havadan örnek korumak.

Sorun: Geçersiz centerburst. Çözüm: centerburst bulun.

e_content "> Sorun:. iletim Düşük akı fark odaklı olsa Çözüm:. kızılötesi ışık örnek üzerinde bir noktaya odaklanmış değil gibi alt kondansatörü ayarlayın Bu oluşacaktır.

Bu yazıda, iletim veya transflectance modunda ya dokuların yüksek çözünürlüklü kızılötesi görüntüleri elde etmek için nasıl odaklanmıştır. FT-IR görüntüleme doğası, bu tür alt-tabaka tipine tespit tekniği, örnek kalınlığı, spektral çözünürlük, interferometre ayna hızı vb Bu parametrelerin etkisi olarak veri toplama ile yapılabilir çok modifikasyonlar olmasıdır var Son zamanlarda ^4,5,17,51 geniş detaylı olarak tartışılmıştır.

ATR modunda ^10,24,26 içinde görüntüleme de dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü IR görüntüleme sağlamak için nano ölçekli termal yaklaşımlar ^52,53 kullanılarak görüntüleme sistemi yapılabilir değişiklikler vardır. yüksek çözünürlüklü kızılötesi görüntüleme ile ana sınırlama ti olduğunussues (tipik olarak 4 um kalınlığında) üzerinden geçmesi için dikkatli bir şekilde hazırlanan ve IR için yeterince ince olması gerekir. Buna ek olarak, iletim ve yansıtma FT-IR görüntüleme nedeniyle su IR absorbans kuru olmasını örnekleri gerektirir. Ancak, FT-IR görüntüleme ki, diğer tekniklere göre önemli avantajlara sahiptir it can doku çok hızlı görüntü büyük alanlar, zengin ve ayrıntılı biyokimyasal bilgi türetmek ederken. Bir etiket-serbest bir şekilde biyokimyasal bilgileri elde Diğer benzer teknikler Raman spektroskopisi, ancak veri toplama zamanı görüntüleri elde etmek için çok daha yavaş olduğunu bulunmaktadır. Yeni Raman görüntüleme yaklaşımları Uyarılmış Raman saçılımı (SRS) ve Tutarlı Antistokes Raman saçılımı (CARS) dahil ortaya çıkıyor; Ancak, onlar erişim sınırlı spektral aralığı veya tek frekanslı görüntüleme var.

veri toplama, uzamsal çözünürlük ve hesaplamalı yaklaşımlar durumu hızındaki gelişmeler FT-IR imag yapımında büyük değeri olmuşturpatolojide yeni bir görüntüleme aracı olarak çeviri için bir daha uygun bir yaklaşım ing. mekansal çözünürlükte son gelişmeler nedeniyle konvansiyonel FT-IR görüntüleme sistemleri kullanılarak çözülebilir olmayan anahtar hücre tiplerine doku patolojisi için özellikle önemli olmuştur. Reddy ve ark son kağıt. FT-IR görüntüleme sisteminin ⁵ optimum uzaysal çözünürlüğü elde etmek için ideal bir sistemi modellemek için nasıl gösterdi. Bu yazıda sunulan böbrek doku örneği glomerüler yapılar (Şekil 3 ve Şekil 5) biyokimyasal bilgileri ayıklamak amacıyla daha yüksek uzaysal çözünürlükte önemini ortaya koymaktadır. Gelecekte, Kuantum Cascade Lazerler çok parlak kızılötesi ışık kaynaklarının yeni gelişmeler ^54-57, 3D spektral görüntüleme ^58, ve nano ölçekli IR teknolojileri alanında devrimler ^52,53,59,60 olabilir araştırma heyecan verici yeni yollar tutun doku görüntüleme gelecekte büyük etkileri.

ve karaciğer ve böbrek hastalığı uygulama örnekleri sunulmuştur. Chicago Illinois Üniversitesi Patoloji Anabilim spektral Patoloji Laboratuarı hastalığı tanısı iyileştirilmesine yönelik IR görüntüleme teknolojilerinin çeviri odaklı ve hasta sonucun tahmin artırıldı. FT-IR görüntüleme kantitatif ve objektif bilgiler gerekli patoloji uygulamada mevcut sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek olabilir. Özellikle, gelecekteki iş akım teknikleri yeterli tanı duyarlılığını sağlamak veya sınırlı bilgi sağlamak için başarısız mevcut patoloji uygulamada alanların belirlenmesi üzerine odaklanmıştır. Bir açık bir ihtiyaç patoloji mevcut uygulamaların iyileştirilmesi ve yüksek çözünürlüklü FT-IR görüntüleme kullanarak ulaşılabilir olabilecek bir hastanın hastalık durumu hakkında patolog, daha fazla bilgi vererek doğru var.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 600 Series FT-IR system	Agilent	Multiple configurations	Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR	Edmund Optics	66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR	Edmund Optics	66-586
MirrIR slide	Kevley Technologies	CFR	For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides	International Crystal Laboratories	Multiple sizes	For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides	International Crystal Laboratories	Multiple sizes	For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas	Multiple gas suppliers	Multiple sizes
Hexane	Sigma Aldrich	Multiple sizes	For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen	Multiple cryogenic liquid suppliers	Multiple sizes
ENVI-IDL software	Exelis-Vis		Other software packages available
Whole slide Imager	Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)		To image stained slides