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* Estos autores han contribuido por igual
Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
De alta definición Transformada de Fourier de infrarrojos (FT-IR) imágenes espectroscópicas es un enfoque emergente para obtener imágenes detalladas que se han asociado información bioquímica. Imágenes FT-IR de tejido se basa en el principio de que las diferentes regiones de las infrarrojo medio son absorbidos por diferentes enlaces químicos (por ejemplo, C = O, CH, NH) dentro de las células o tejidos que luego pueden estar relacionados con la presencia y composición de biomoléculas (por ejemplo, lípidos, DNA, glucógeno, proteínas, colágeno). En una imagen FT-IR, cada píxel dentro de la imagen comprende un espectro de infrarrojos (IR) que puede dar información sobre el estado bioquímico de las células que a continuación pueden ser explotadas para el tipo celular o de tipo enfermedad de clasificación. En este artículo, nos muestran: cómo obtener imágenes infrarrojas de los tejidos humanos utilizando un sistema FT-IR, como modificar la instrumentación existente para permitir capacidades de imagen de alta definición, y cómo visualizar imágenes FT-IR. A continuación, presentamos algunas aplicaciones de FT-IRde la patología utilizando el hígado y el riñón como ejemplos. Imágenes FT-IR tiene aplicaciones interesantes en la prestación de una ruta nueva para obtener información bioquímica de las células y tejidos en una ruta que no cause interferencias enteramente etiqueta-libre hacia dar una nueva visión de los cambios biomoleculares como parte de los procesos de enfermedad. Además, esta información bioquímica potencialmente puede permitir un análisis objetivo y automatizado de ciertos aspectos de diagnóstico de la enfermedad.
Espectroscopia IR ha sido una herramienta de análisis disponible en alguna forma desde la década de 1930; Sin embargo, sólo se ha sido en la última década que el área de formación de imágenes de tejido con FT-IR se ha disparado. Los avances de la FT-IR para obtener imágenes de tejidos se han impulsado en gran parte por tres acontecimientos fundamentales: 1) aumento de la velocidad de adquisición de datos debido a la disponibilidad de un gran conjunto de plano focal (FPA) detectores que típicamente tienen miles de infrarrojos detectores sensibles 1 , 2, 2) el desarrollo de algoritmos de procesamiento de avanzada y capacidad de cálculo para manejar grandes datos hiperespectrales establece 3, y 3) el modelado de sistemas de imágenes FT-IR para maximizar la resolución espacial de 4,5. Ha habido numerosos alta calidad y muy extensos artículos que analizan el campo de la espectroscopia FT-IR recientemente 6-16, además de un artículo de Nature Protocolos que detalla los pasos para obtener el punto espectros o mapas de los tejidos 17. En este artículo, nos centraremos en la protocol para obtener imágenes de los tejidos utilizando un detector de 128 x 128 FPA en un sistema de FT-IR modificado con capacidades de alta definición.
Imágenes FT-IR mucho tiempo se ha sugerido que es una herramienta potencialmente deseables para celular y imágenes de tejidos debido a la capacidad de obtener imágenes en las que cada píxel tiene una gran cantidad de información bioquímica. Formación de imágenes FT-IR se basa en el principio de que diferentes biomoléculas en una muestra absorberán cuantitativamente diferentes regiones del infrarrojo medio; esto permite la derivación de una "huella digital bioquímica '. Esta huella digital había sido demostrado en muchos estudios para alterar entre los diferentes tipos de células y estados de enfermedad. A diferencia de la patología en la práctica convencional, donde las manchas y marcadores inmunohistoquímicos necesitan ser utilizado para visualizar e identificar tipos de células y estructuras de tejido que se utilizan para guiar las opciones de diagnóstico y tratamiento, las imágenes de FT-IR se forman sobre la base de la bioquímica inherente del tejido. El techniq actualue tinción de tejido para el diagnóstico es que consume tiempo, destructivo, laborioso, y requiere experiencia subjetiva del patólogo, mientras que FT-IR ofrece el potencial para hacer de este proceso rápido, no destructivo, altamente automatizada, y más objetiva. Además, FT-IR proporciona una nueva ruta para la obtención de información bioquímica adicional que puede no ser fácilmente accesible a través de técnicas de tinción convencionales.
Uno de los avances más emocionantes en los últimos años ha sido la disponibilidad de métodos de formación de imágenes de alta resolución que ahora se puede permitir la visualización y caracterización de los tipos de células y estructuras de tejido que son críticos para el diagnóstico de enfermedades integral. Una de estas técnicas es de reflectancia total atenuada (ATR) FT-IR que incorpora una lente de inmersión sólido (SIL) de un alto índice de refracción que permite la formación de imágenes de alta resolución 18, con muchos estudios muy interesantes que muestra sus aplicaciones 19-25. Además, wcomo ha demostrado recientemente que el aumento de la resolución espacial asociada con las imágenes de ATR puede permitir la visualización y clasificación de células endoteliales y mioepiteliales en el tejido mamario que forman un componente clave de diagnóstico de cáncer de mama 26. Mientras que las imágenes ATR es muy útil, esta técnica requiere que el SIL para hacer contacto con el tejido para formar imágenes FT-IR; por lo tanto, su uso es algo limitada para patología del tejido donde grandes regiones de tejidos deben ser reflejados rápidamente.
Un segundo enfoque se demostró mediante el acoplamiento de un objetivo de gran aumento a un sistema de FT-IR existente que utiliza un sincrotrón como fuente luminosa de IR, es posible iluminar plenamente de FPA y la imagen con un tamaño efectivo de píxel de 0,54 x 0,54 m. Esto permitió a visualizar las estructuras clave en tejidos de mama y de próstata que no se puede resolver utilizando sistemas de FT-IR convencional 4. Si bien estos aumentos dramáticos en la imagen IR resolutio espacialn eran alucinantes, su uso sigue siendo limitado debido a que requiere un sincrotrón. Posteriormente, un sistema óptimo fue diseñado, que también podría permitir capacidades de imagen de alta definición con un tamaño de 1,1 x 1,1 m píxeles sin el requisito de una fuente de sincrotrón, sino más bien el uso de una fuente de IR GLOBAR tradicional 5. En este artículo, mostramos cómo modificar un sistema de imagen existente comercial FT-IR para permitir la difracción de imágenes IR limitado de tejidos con una señal aceptable a ruido utilizando múltiples objetivos IR (15X, 36X, 74X y). El tamaño efectivo de píxeles con los tres objetivos es de 5,5 x 5,5 m (15X), 2,2 x 2,2 m (36X) y 1,1 x 1,1 m (74X). A continuación damos algunos ejemplos de la importancia de los avances en la resolución espacial para la detección de la enfermedad en el hígado y el riñón biopsias 27.
1. La creación de un FT-IR Microscopio y adquisición de tejidos Imágenes
2. Adaptación de un microscopio FT-IR para capacidades de alta definición
NOTA: La mayoría de los sistemas de FT-IR están equipadas con un objetivo aproximadamente con un aumento de 15x y 0,5 apertura numérica (NA). Para la imagen en modo de alta definición, un IR compatible 36X o 74X objetivo puede ser usado para dar difracción capacidades de imagen limitados.
3. Visualización de y clasificar al espectro IR Conjuntos de datos
NOTA: En esta sección, vamos a discutir la forma de visualizar y extraer datos de imágenes espectrales utilizando el procesamiento de imágenes geoespaciales y análisis de software tales como ENVI + IDL, sin embargo, el proceso es muy similar para cualquier software alternativo, como MATLAB, el software libre como Cytospec o el propio software del desarrollador instrumento. Hay algunas diversas técnicas de procesamiento espectral que se pueden realizar en los datos infrarrojos.
Formación de imágenes FT-IR permite la derivación de imágenes IR de tejido que pueden dar diferentes contrastes dependiendo de la frecuencia IR de interés. Además, en una imagen IR, cada píxel se compone de todo el espectro IR, con diferentes picos correspondientes a diferentes biomoléculas que pueden dar información acerca de las propiedades bioquímicas de tipos de células o estados de enfermedad (Figura 1). Aquí, hemos demostrado cómo comparar las firmas espectrales entre las clases, clasificación automatizada sin embargo más avanzado es posible el uso de algoritmos adicionales 3,43-50, como la clasificación bayesiana, Random Forests, Redes Neuronales Artificiales y Análisis Cluster Jerárquico se puede realizar en la datos. Enfoques clasificación supervisada permitirán la construcción de un clasificador que puede ser entrenado para permitir el reconocimiento automático de tipos de células o estados de enfermedad. Enfoques de clasificación no se pueden utilizar para buscar natural difconferencias en el tejido o células debido a la variación de bioquímica.
Instrumentación FT-IR ha evolucionado a lo largo de las últimas décadas, a partir de la medición en un punto único modo / mapeo usando IR aberturas opacos a modo de imagen usando objetivos Cassegrain, utilizando un objetivo que ilumina junto con un objetivo recolectar en el modo de transmisión o un solo objetivo que ambos se ilumina y se acumula en-modo de reflexión (Figura 2). Se ha demostrado recientemente que el objetivo recoger en el modo de transmisión podría ser cambiado para un mayor aumento y objetivo numérico de abertura para permitir la formación de imágenes IR de difracción limitada, que conduce a aumentos sustanciales en la resolución espacial de las imágenes IR recogidos 4,5. Los avances en la resolución espacial de las imágenes de tejidos han sido de vital importancia ya que ahora podemos identificar los tipos de células y estructuras de tejido, por ejemplo, las unidades funcionales del riñón, los glomérulos, mediante la adaptación de la casaSistemas de FT-IR (Figura 3).
De alta definición de imagen FT-IR permite obtener imágenes más detalladas de los tejidos para ser examinados para identificar las regiones anormales e identificar diferencias bioquímicas entre diferentes tipos de células. En un núcleo de tejido hepático, es posible visualizar los hepatocitos y las regiones de la infiltración de fibrosis que divide dos áreas distintas de la displasia y cirrosis no displásico (Figura 4). Estamos trabajando para explotar este hacia la fabricación de herramientas de diagnóstico automatizados para uso en casos difíciles de enfermedad hepática.
Es importante destacar que el aumento de la resolución espacial puede ahora nos permitirá aislar las características estructurales específicas que pueden ser modificados químicamente por la enfermedad antes de los cambios histológicos son evidentes. Por ejemplo, estamos enfocados en la identificación de los cambios bioquímicos en las estructuras glomerulares del riñón como la cápsula de Bowman, mesangio, la membrana basal glomerular y la membrana basal tubular, antes cambios identificados por el patólogo se pueden observar (Figura 5). En particular, estamos interesados en la identificación de los cambios asociados con la progresión de la nefropatía diabética y el rechazo crónico en pacientes trasplantados, donde las técnicas actuales no logran identificar los cambios de una manera lo suficientemente temprano para una intervención exitosa.
Figura 1. imágenes FT-IR y el espectro de un núcleo de hígado. Imagen de (A) H & E manchadas núcleo de la biopsia hepática e imágenes de absorbancia IR de la sección de serie del mismo núcleo en (B) 3286 cm -1 y (C) 2603 cm-1, que puso de relieve las diferentes características estructurales. (D) Espectro de IR típico de tejido, con picos importantes rotulados. Barra de escala = 100 micras.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Óptica detallan los modos de operación del microscopio FT-IR esquemáticos. (A) En el modo de transmisión, la muestra se ilumina a través del objetivo de fondo, y la luz que pasa a través de la muestra se recoge por el objetivo superior. (B) En el modo de reflexión, el objetivo superior sirve para iluminar la muestra y para recoger la luz reflejada. El objetivo final no se usa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación de diferencamisetas objetivos de microscopio en las imágenes FT-IR de un glomérulo renal en 2925 cm -1. (A) 15X objetivas recogiendo con NA = 0,5 (tamaño 5.5 x 5.5 m pixel). (B) 36X objetivo de recogida con NA = 0,5 (tamaño 2.2 x 2.2 m pixel). (C) 74X recogiendo objetivo con NA = 0,65 (tamaño de 1,1 x 1,1 m píxeles). La barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. diferencias espectrales entre fibrosis y hepatocitos en un núcleo de hígado. (A) H & E manchadas núcleo de biopsia de hígado. (B) Imagen de una sección de núcleo en serie escaneada en FT-IR (36X configuración objetiva). (C) Repespectros repre- de los hepatocitos y fibrosis, tomada desde regiones de tejido indicadas por las flechas en (A) y (B). Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Diferenciación de las características de la biopsia de tejido renal mediante el uso de alta definición de imagen FT-IR. (A) sección teñida de ácido periódico de Schiff con las características que se extrae la etiqueta. (B) de alta definición de imagen FT-IR de la región CH 2 estiramiento asimétrico (36X configuración objetiva) de una sección de serie del mismo tejido. (C) Características etiquetado en (A) extraído por medio de la imagen de FT-IR en (B) para poder químicamente differentiate las cuatro características del tejido. La barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
FT-IR es una modalidad emergente de libre de etiquetas de imágenes bioquímica de las secciones de tejido, con el potencial de tener un papel importante en la mejora del nivel actual de diagnóstico en la patología. El actual estándar de oro para la patología requiere tejidos para realizar una biopsia, se fijaron en formol, embebidos en parafina, seccionadas varias veces, y se tiñeron con múltiples manchas. Un patólogo altamente capacitado tiene que evaluar subjetivamente visualmente la estructura del tejido y la morfología celular para determinar un diagnóstico. Aquí te mostramos cómo recoger imágenes infrarrojas de alta resolución desde el mismo tipo de secciones y discutir algunos de los enfoques computacionales para examinar las diferencias químicas entre los tipos de células y estados de enfermedad.
Los pasos críticos dentro de este protocolo son asegurar que los tejidos se centran mucho cuidado y que el sistema está bien calibrados para asegurar que los datos espectroscópicos de muy alta calidad. El cuidado al configurar el sistema es particularmente criti cal cuando se trabaja con objetivos de gran aumento. Para ayudar en la solución de problemas, la siguiente lista cubre algunos de los potenciales dificultades encontradas;
Problema: Baja intensidad de IR cuando se generan imágenes en la reflexión. Solución: Compruebe la orientación de diapositivas IR como el revestimiento reflectante puede estar en el lado equivocado de la diapositiva.
Problema: Baja señal / señal de alerta roja en el Control de Lancer. Solución: detectores frescos con LN2. Se requiere de nitrógeno líquido para los detectores FPA para funcionar y requiere periódicamente rellenada.
Problema: Velocity errores error / movimiento. Solución: Cambiar espectrómetro y reducir las vibraciones. Las vibraciones harán que el espejo móvil en el interferómetro a ser perturbado.
Problema: los picos de vapor de agua en los datos. Solución: Aumentar la purga del sistema y proteger la muestra de aire.
Problema: centerburst válido. Solución: Encuentra centerburst nuevo.
e_content "> Problema:. diferencia de bajo flujo en la transmisión, a pesar de que se centró Solución:. Ajuste condensador inferior Esto ocurrirá cuando la luz IR no se está enfocada a un punto en la muestra.En este trabajo, nos hemos centrado en la forma de adquirir imágenes de alta definición IR de los tejidos, ya sea en el modo de transmisión o transflectancia. La naturaleza de las imágenes FT-IR, es que hay múltiples modificaciones que se pueden hacer a la adquisición de datos, tales como, el tipo de sustrato, la técnica de fijación, espesor de la muestra, la resolución espectral, interferómetro velocidad Espejo etc. El efecto de estos parámetros tiene ha discutido en extenso detalle recientemente 4,5,17,51.
Hay una serie de modificaciones que pueden introducirse en el sistema de formación de imágenes incluyendo imágenes en modo ATR 10,24,26 y el uso de enfoques térmicas nanoescala 52,53 para permitir la formación de imágenes IR de alta resolución. La principal limitación con imágenes de infrarrojos de alta resolución es que el tiEMAS deben ser cuidadosamente preparados y lo suficientemente delgada para IR para pasar a través (típicamente 4 micras de espesor). Además, las imágenes de FT-IR de transmisión y reflectancia requiere las muestras a ser seco debido a la absorbancia de IR por el agua. Sin embargo, las imágenes de FT-IR tiene ventajas significativas sobre otras técnicas, ya que puede imagen muy rápidamente grandes áreas de tejido mientras que se derivan información bioquímica rica y detallada. Otras técnicas similares que se derivan información bioquímica de una manera libre de etiquetas incluyen la espectroscopia Raman, sin embargo el tiempo de adquisición de datos es mucho más lento para adquirir imágenes. Están surgiendo enfoques de imagen Nueva Raman incluyendo la dispersión Raman estimulada (SRS) y coherente Antistokes dispersión Raman (CARS); sin embargo, tienen rango espectral de acceso limitado o imágenes de una sola frecuencia.
Los avances en la velocidad de adquisición de datos, la resolución espacial, y la disponibilidad de métodos de cálculo han sido de gran valor en la toma de FT-IR imaging un enfoque más factible para la traducción como una nueva herramienta de imagen en patología. Los recientes avances en la resolución espacial han sido especialmente importantes para la patología del tejido debido a tipos de células clave no son resolubles mediante sistemas de imágenes de FT-IR convencionales. El trabajo reciente de Reddy et al. mostró cómo modelar un sistema ideal para obtener la resolución espacial óptima de un sistema de imagen FT-IR 5. El ejemplo tejido renal se presenta en este trabajo se demuestra la importancia de una mayor resolución espacial con el fin de extraer información bioquímica de las estructuras glomerulares (Figura 3 y Figura 5). En el futuro, los nuevos avances en Quantum Cascade Lasers como muy brillantes fuentes de luz IR 54-57, imagen espectral 3D de 58 años, y los avances en el campo de las tecnologías de nanoescala IR 52,53,59,60 sostienen emocionantes nuevas vías de investigación que pueden tener enormes implicaciones en el futuro de la imagen de tejidos.
Hemos presentado ejemplos de aplicaciones en enfermedades hepáticas y renales, donde hay una necesidad de información bioquímica adicional que puede ser de valor diagnóstico. La espectral Patología Laboratorio en el Departamento de Patología de la Universidad de Illinois en Chicago se centra en la traducción de las tecnologías de imágenes IR a mejorar el diagnóstico de enfermedades y la mejora de la predicción de la evolución del paciente. Imágenes FT-IR puede superar algunas de las limitaciones actuales en la práctica patología donde se requiere información cuantitativa y objetiva. En particular, el trabajo futuro se centra en la identificación de áreas en la práctica la patología actual donde las técnicas actuales no proporcionan sensibilidad diagnóstica adecuada o proporcionar información limitada. Existe una clara necesidad en la mejora de la práctica actual de la patología y hacia dar más información al patólogo sobre el estado de la enfermedad de un paciente, que puede ser alcanzable usando formación de imágenes de alta definición FT-IR.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |
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