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Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
Transformée de Fourier à haute définition infrarouge (FT-IR) imagerie spectroscopique est une approche émergente d'obtenir des images détaillées qui ont associés informations biochimiques. Imagerie FT-IR de tissu est basé sur le principe selon lequel les différentes régions de l'infrarouge moyen sont absorbés par différentes liaisons chimiques (par exemple, C = O, CH, NH) à l'intérieur des cellules ou des tissus qui peuvent ensuite être liées à la présence et de la composition des biomolécules (par exemple, les lipides, l'ADN, le glycogène, la protéine, le collagène). Dans une image FT-IR, chaque pixel dans l'image comprend l'ensemble d'un spectre infrarouge (IR) qui peuvent donner des informations sur l'état biochimique des cellules qui peuvent ensuite être exploités pour cellule de type ou de type maladie classification. Dans cet article, nous montrons: comment obtenir des images infrarouges de tissus humains en utilisant un système FT-IR, comment modifier l'instrumentation existante pour permettre haute définition des capacités d'imagerie, et la façon de visualiser les images FT-IR. Nous présentons ensuite certaines applications de FT-IRpour la pathologie en utilisant le foie et les reins à titre d'exemples. Imagerie FT-IR détient applications passionnantes en fournissant une nouvelle voie pour obtenir des informations biochimiques à partir de cellules et de tissus dans un non-perturbant itinéraire entièrement sans étiquette en vue de donner un nouvel éclairage sur les changements biomoléculaires dans le cadre du processus de la maladie. En outre, cette information biochimique peut potentiellement permettre une analyse objective et automatisée de certains aspects du diagnostic de la maladie.
spectroscopie IR a été un outil d'analyse disponibles dans une certaine forme depuis les années 1930; cependant, il ne est fait à l'intérieur de la dernière décennie que le domaine de l'imagerie des tissus avec FT-IR a explosé. Les progrès de la FT-IR pour l'imagerie des tissus ont été entraînée en grande partie par trois développements clés: 1) augmentation de la vitesse d'acquisition de données en raison de la disponibilité de grande matrice de plan focal (FPA) détecteurs qui ont généralement des milliers de détecteurs IR sensibles 1 , 2, 2) le développement d'algorithmes de traitement avancés et puissance de calcul pour gérer de grandes données hyperspectrales fixe 3, et 3) la modélisation de systèmes d'imagerie FT-IR pour maximiser résolution spatiale 4,5. Il ya eu de nombreux haute qualité et très étendues des articles examinant le domaine de la spectroscopie FT-IR récemment 6-16, en plus d'un article de Nature protocoles qui détaille les étapes pour obtenir les spectres de points ou des cartes à partir de tissus 17. Dans cet article, nous allons nous concentrer sur la protocol d'obtenir des images de tissus à l'aide d'un détecteur 128 x 128 FPA dans un système FT-IR modifiée avec des capacités haute définition.
Imagerie FT-IR a longtemps été suggéré d'être un outil potentiellement souhaitable pour l'imagerie cellulaire et tissulaire due à la capacité d'obtenir des images où chaque pixel possède une mine d'informations biochimique. Imagerie FT-IR est basé sur le principe selon lequel les différentes biomolécules dans un échantillon vont absorber quantitativement différentes régions de l'infrarouge moyen; ce qui permet pour la dérivation d'une «empreinte biochimique». Cette empreinte a été démontré dans de nombreuses études pour changer entre différents types de cellules et des états pathologiques. Contrairement à la pratique de la médecine conventionnelle où les taches et les marqueurs immunohistochimiques ont besoin d'être utilisé pour visualiser et identifier des types de cellules et des structures de tissus qui sont utilisés pour guider le diagnostic et les options de traitement, les images de FT-IR sont formés sur la base de la biochimie inhérente du tissu. La techniq actuelleue coloration de tissu pour le diagnostic prend du temps, destructeur, laborieux et nécessite une expertise subjective du pathologiste, alors que FT-IR offre la possibilité de rendre ce processus rapide, non destructive, hautement automatisée et plus objective. En outre, FT-IR fournit une nouvelle voie d'obtenir des informations supplémentaires biochimique qui peuvent ne pas être facilement accessibles en utilisant des techniques classiques de coloration.
L'un des progrès les plus passionnants de ces dernières années a été la disponibilité de méthodes d'imagerie à haute résolution qui peut maintenant permettre pour la visualisation et la caractérisation de types de cellules et des structures tissulaires qui sont essentiels pour le diagnostic de la maladie complète. Une de ces techniques est réflectance totale atténuée (ATR) FT-IR qui comprend une lentille à immersion solide (SIL) d'un indice de réfraction élevé qui permet une imagerie à haute résolution 18, avec de nombreuses études très intéressantes montrant ses applications 19-25. En outre, il wcomme démontré récemment que la résolution spatiale accrue associée à l'imagerie ATR peut permettre la visualisation et la classification des cellules endothéliales et les cellules myoépithéliales dans le tissu du sein qui forment un élément clé de diagnostic du cancer du sein 26. Alors que l'imagerie ATR est très utile, cette technique nécessite l'SIL de prendre contact avec le tissu pour former des images FT-IR; par conséquent, son utilisation est quelque peu limitée pour la pathologie des tissus où de grandes régions de tissus doivent être rapidement imagés.
Une deuxième approche a été démontrée par le couplage d'un objectif à fort grossissement à un système FT-IR existant qui utilise un rayonnement synchrotron en tant que source lumineuse de IR, il est possible d'illuminer complètement un FPA et image avec une taille de pixel effective de 0,54 x 0,54 um. Cela a permis de visualiser les structures clés dans les tissus du sein et de la prostate qui ne ont pas été résolu en utilisant des systèmes FT-IR conventionnels 4. Bien que ces augmentations spectaculaires en image IR resolutio spatialen était excitant, son utilisation reste limitée en raison d'exiger un synchrotron. Par la suite, un système optimal a été conçu qui pourrait également permettre haute définition des capacités d'imagerie avec une taille de pixel de 1,1 x 1,1 um sans l'exigence d'une source de rayonnement synchrotron, mais plutôt en utilisant une source infrarouge de 5 Globar traditionnel. Dans cet article, nous montrons comment modifier un système d'imagerie existante commerciale FT-IR pour permettre la diffraction IR limitée imagerie des tissus avec un signal acceptable pour bruit utilisant objectifs multiples (IR 15X, 36X, 74X) et. La taille de pixels effectifs avec les trois objectifs est de 5,5 x 5,5 um (15X), 2,2 x 2,2 um (36X) et 1,1 x 1,1 um (74X). Nous donnons ensuite quelques exemples de l'importance des gains de la résolution spatiale pour la détection de la maladie dans le foie et les reins des biopsies 27.
1. Mise en place d'un microscope à FT-IR et acquisition tissus Images
2. Adapter un microscope à FT-IR pour les capacités haute définition
REMARQUE: La plupart des systèmes FT-IR sont équipés d'un objectif d'environ un grossissement 15X et 0,5 ouverture numérique (NA). Pour l'image en mode haute définition, un IR compatible 36X ou 74X objectif peut être utilisé pour donner des capacités d'imagerie de diffraction limitées.
3. Visualisation et de classer les ensembles de données spectrales IR
NOTE: Dans cette section, nous allons discuter de la façon de visualiser et extraire des données à partir d'images spectrales en utilisant le traitement d'image géospatiales et l'analyse des logiciels tels que ENVI + IDL, mais le processus est très similaire pour tout logiciel alternatif tels que MATLAB, logiciels libres tels que CytoSpec ou propre logiciel de l'instrument développeur. Il ya quelques différentes techniques de traitement spectrale qui peuvent être effectuées sur les données IR.
FT-IR imagerie permet la dérivation d'images infrarouges de tissus qui peuvent donner des contrastes différents en fonction de la fréquence infrarouge d'intérêt. En outre, dans une image d'IR, chaque pixel comprend de l'ensemble du spectre IR, avec des pics correspondant aux différentes biomolécules qui peuvent donner des informations sur les propriétés biochimiques des types cellulaires ou états maladifs (figure 1). Ici, nous avons montré comment comparer les signatures spectrales entre les classes, mais plus avancé classement automatisé est possible en utilisant des algorithmes supplémentaires 3,43-50, telles que la classification bayésienne, les forêts aléatoires, réseaux de neurones artificiels, et Hiérarchique Cluster Analysis peut être effectuée sur le données. Approches de classification supervisée permettront la construction d'un classificateur qui peuvent être formés pour permettre la reconnaissance automatique des types de cellules ou états pathologiques. Méthodes de classification non supervisées peuvent être utilisés pour rechercher des dif naturelleconférences dans les tissus ou cellules en raison de la variance biochimique.
Instruments FT-IR a évolué au cours des dernières décennies, de la mesure dans un simple / mode de mappage de point à l'aide IR ouvertures opaques en mode d'imagerie utilisant objectifs Cassegrain, en utilisant soit un objectif d'éclairage couplé avec un objectif de collecte dans la transmission-mode ou un seul objectif que les deux se allume et se accumule dans la réflexion en mode (Figure 2). Il a été récemment démontré que l'objectif de collecte dans le mode de transmission peut être commutée pour un plus fort grossissement et l'ouverture numérique de l'objectif pour permettre la formation d'images IR diffraction limitée, qui conduit à des augmentations substantielles de la résolution spatiale des images infrarouges collectées 4,5. Les progrès de la résolution spatiale pour l'imagerie de tissus ont été d'une importance critique comme on peut maintenant déterminer les types de cellules et des structures tissulaires, par exemple les unités fonctionnelles du rein, les glomérules, en utilisant adapté à l'interneSystèmes FT-IR (Figure 3).
Haute définition imagerie FT-IR permet des images détaillées des tissus à examiner pour identifier les régions anormales et d'identifier les différences biochimiques entre les différents types de cellules. Dans une âme en tissu de foie, il est possible de visualiser les hépatocytes et les régions de l'infiltration fibrose qui divise deux zones distinctes de la dysplasie et la cirrhose non dysplasique (figure 4). Nous travaillons à exploiter cette direction la fabrication d'outils de diagnostic automatisés pour une utilisation dans les cas difficiles de maladie du foie.
Fait important, la résolution spatiale accrue peut désormais nous permettre d'isoler les caractéristiques structurelles spécifiques qui peuvent être modifiés chimiquement par la maladie avant que des changements histologiques sont apparents. Par exemple, nous nous concentrons sur l'identification des changements biochimiques dans les structures rénale glomérulaire tels que la capsule de Bowman, mésangium, membrane basale glomérulaire et la membrane basale tubulaire, avant changements identifiés par le pathologiste peuvent être observées (Figure 5). En particulier, nous sommes intéressés à identifier les changements associés à la progression de la néphropathie diabétique et le rejet chronique chez les patients transplantés, où les techniques actuelles ne parviennent pas à identifier les changements dans un mode assez tôt pour une intervention réussie.
Figure 1. images FT-IR et le spectre d'un noyau de foie. Image de (A) H & E colorées base de biopsie du foie et des images d'absorbance IR de l'article de série du même noyau en (B) 3286 cm -1 et (C) 2603 cm -1, ce qui a mis en évidence différentes caractéristiques structurelles. (D) du spectre IR typique du tissu, avec des pics importants marqués. Barre d'échelle = 100 um.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Optique détaillant __gVirt_NP_NNS_NNPS<__ modes de fonctionnement du microscope FT-IR schématiques. (A) dans le mode de transmission, l'échantillon est illuminé à travers l'objectif de fond, et la lumière traversant l'échantillon est recueilli par l'objectif prioritaire. (B) En mode de réflexion, l'objectif prioritaire sert à la fois pour éclairer l'échantillon et pour recueillir la lumière réfléchie. L'objectif de fond ne est pas utilisé. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Comparaison des différenobjectifs de microscope sur les images t FT-IR d'un glomérule rénal à 2925 cm -1. (A) 15X collecte objectifs avec NA = 0,5 (taille 5,5 x 5,5 um de pixel). (B) l'objectif 36X de collecte avec NA = 0,5 (taille 2,2 x 2,2 um de pixel). (C) la collecte objectif 74X avec NA = 0,65 (taille 1,1 x 1,1 um de pixel). La barre d'échelle = 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. différences spectrales entre fibrose et hépatocytes dans un noyau du foie. (A) H & E teinté coeur de la biopsie hépatique. (B) l'image d'une section noyau en série numérisée dans FT-IR (configuration objectif 36X). (C) RepLes spectres représen- des hépatocytes et la fibrose, pris à partir de régions de tissus indiqués par des flèches (A) et (B). Barre d'échelle = 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Différenciation des caractéristiques de biopsie de tissu rénal par l'utilisation de l'imagerie haute définition FT-IR. (A) section acide périodique de Schiff colorées avec les caractéristiques à extraire étiqueté. (B) à haute définition d'image FT-IR de la région CH 2 asymétrique étirement (36X d'installation objectif) d'une section de série du même tissu. (C) Caractéristiques étiqueté (A) extrait en utilisant l'image FT-IR (B) pour pouvoir chimiquement differentiate les quatre caractéristiques du tissu. La barre d'échelle = 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
FT-IR est une modalité émergente pour sans étiquette biochimique imagerie des coupes de tissus, avec le potentiel d'avoir un rôle important dans l'amélioration de la norme actuelle de diagnostic en pathologie. La norme de référence actuelle pour la pathologie nécessite tissus à biopsie, fixe dans le formol, inclus en paraffine, sectionnés à plusieurs reprises, et colorés avec plusieurs taches. Un pathologiste hautement qualifié doit évaluer subjectivement visuellement la structure de tissu et de la morphologie cellulaire pour déterminer un diagnostic. Ici, nous montrons comment recueillir les images infrarouges haute résolution à partir du même type de sections et de discuter de certaines des approches informatiques pour examiner les différences chimiques entre les types de cellules et états pathologiques.
Les étapes critiques au sein de ce protocole doivent se assurer que les tissus sont très soigneusement ciblées et que le système est bien calibrés pour assurer que les données spectroscopiques de très haute qualité. La prise en charge lors de la configuration du système est particulièrement Criti cal lorsque vous travaillez avec des objectifs à fort grossissement. Pour faciliter le dépannage, la liste suivante couvre certaines des difficultés rencontrées potentiels;
Problème: Faible intensité IR lors de l'imagerie en réflexion. Solution: Vérifiez IR diaporama orientation que le revêtement réfléchissant peut être du mauvais côté de la glissière.
Problème: Signal faible / Rouge panneau d'avertissement dans le contrôle Lancer. Solution: détecteurs Refroidir les LN2. L'azote liquide est nécessaire pour les détecteurs FPA pour fonctionner et nécessite d'être régulièrement complété.
Problème: Velocity erreurs erreur / de mouvement. Solution: Réinitialiser spectromètre et réduire les vibrations. Vibrations causeront le miroir se déplaçant dans l'interféromètre être dérangé.
Problème: les pointes de vapeur d'eau dans les données. Solution: Augmentez purge sur le système et protéger l'échantillon de l'air.
Problème: centerburst valide. Solution: Trouver centerburst nouveau.
e_content "> Problème:. Faible différence de flux de transmission, même si concentré. Solution: Ajustez condenseur fond Cela se produira comme la lumière infrarouge ne est pas focalisé sur un point de l'échantillon.Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur la façon d'acquérir des images haute définition IR de tissus de transmission ou de mode de transflectance. La nature de l'imagerie FT-IR, est qu'il existe de multiples modifications qui peuvent être apportées à l'acquisition de données, tels que, type de substrat, technique de fixation, l'épaisseur de l'échantillon, la résolution spectrale, interféromètre vitesse au miroir etc. L'effet de ces paramètres a été discuté de façon très détaillée récemment 4,5,17,51.
Il ya un certain nombre de modifications qui peuvent être apportées au système d'imagerie y compris l'imagerie en mode ATR 10,24,26 et thermiques utilisant des approches à l'échelle nanométrique 52,53 pour permettre l'imagerie infrarouge haute résolution. La principale limitation à l'imagerie infrarouge haute résolution est que le tiProblèmes et doivent être soigneusement préparés et assez mince pour IR pour passer à travers (généralement 4 um d'épaisseur). En outre, la transmission et la réflexion FT-IR imagerie exige que les échantillons à être sec en raison de l'absorption de IR par l'eau. Cependant, l'imagerie FT-IR a des avantages significatifs par rapport aux autres techniques, en ce qu'elle peut très rapidement l'image de grandes zones de tissu tout en découlant informations biochimiques riche et détaillé. D'autres techniques similaires qui dérivent informations biochimiques dans un mode sans marquage comprennent la spectroscopie Raman, mais le moment de l'acquisition des données est beaucoup plus lente pour acquérir des images. Approches d'imagerie Raman New émergent y compris la diffusion Raman stimulée (SRS) et cohérente antistokes diffusion Raman (CARS); cependant, ils ont une portée un accès limité ou imagerie spectrale à fréquence unique.
Les progrès de la vitesse d'acquisition de données, la résolution spatiale, et la disponibilité des approches computationnelles ont été d'une valeur inestimable dans la prise imag FT-IRment une approche plus réalisable pour la traduction comme un nouvel outil d'imagerie dans la pathologie. Les progrès récents de la résolution spatiale ont été particulièrement importantes pour la pathologie tissulaire due à des types de cellules clés ne étant pas résolu en utilisant des systèmes classiques d'imagerie FT-IR. L'étude récente de Reddy et al. a montré comment modéliser un système idéal pour obtenir la résolution spatiale optimale d'un système d'imagerie 5 FT-IR. L'exemple de tissu rénal présentée dans cet article démontre l'importance des résolutions spatiales plus élevées afin d'en extraire des informations à partir de structures biochimique glomérulaire (de la figure 3 et la figure 5). Dans l'avenir, de nouvelles avancées dans Quantum Cascade Lasers comme très vives sources de lumière IR 54-57, imagerie spectrale 3D 58, et des percées dans le domaine des technologies à l'échelle nanométrique IR 52,53,59,60 détiennent de nouvelles avenues passionnants de la recherche qui peuvent avoir énormes implications dans l'avenir de l'imagerie des tissus.
Nous avons présenté des exemples d'applications dans le foie et les maladies rénales où il ya un besoin d'information biochimique supplémentaire qui peut être de valeur diagnostique. Le laboratoire de pathologie spectrale dans le département de pathologie à l'Université de l'Illinois à Chicago est axée sur la traduction des technologies d'imagerie infrarouge vers l'amélioration du diagnostic de la maladie et la prévision des résultats pour les patients améliorée. Imagerie FT-IR peut surmonter certaines des limitations actuelles dans la pratique de la pathologie où l'information quantitative et objective est nécessaire. En particulier, les travaux futurs se concentre sur l'identification des domaines dans la pratique de la pathologie actuelle, où les techniques actuelles ne parviennent pas à fournir une sensibilité diagnostiques adéquates ou de fournir des informations limitées. Un besoin évident existe dans l'amélioration de la pratique actuelle de la pathologie et en vue de donner plus d'informations au médecin sur l'état de la maladie d'un patient, qui peut être obtenue en utilisant l'imagerie haute définition FT-IR.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |
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