الكهربية والمورفولوجية توصيف العصبية الحادة رقائق في الدماغ عن طريق شرائح الموثوقة التصحيح، المشبك التسجيلات

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

مزيج من التصحيح تسجيلات المشبك من اثنين (أو أكثر) الخلايا العصبية إلى جانب synaptically (تسجيلات تقرن) في الحادة الاستعدادات شريحة الدماغ مع الخلايا في وقت واحد biocytin ملء يسمح تحليل مترابطة من الخصائص الهيكلية والوظيفية. مع هذا الأسلوب أنه من الممكن تحديد وتوصيف كل من الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي من قبل التشكل ونمط استجابة الكهربية. التسجيلات يقترن تسمح بدراسة أنماط الاتصال بين هذه الخلايا العصبية فضلا عن خصائص كل من انتقال متشابك الكيميائية والكهربائية. هنا، نقدم وصفا خطوة بخطوة الإجراءات المطلوبة للحصول على تسجيلات يقترن موثوقة جنبا إلى جنب مع الانتعاش الأمثل للمورفولوجيا الخلايا العصبية. سنقوم بشرح كيف يتم تحديد أزواج من الخلايا العصبية المتصلة عبر نقاط الاشتباك العصبي الكيميائي أو تقاطعات الفجوة في الأعمال التحضيرية شريحة الدماغ. وسوف يحدد كيفية إعادة بناء الخلايا العصبية للحصول على التشكل 3D من dendritويتم تحديد جيم ونطاق محور عصبي وكيف الاتصالات متشابك والمترجمة. وسوف نناقش أيضا المحاذير والقيود المفروضة على تقنيات التسجيل المقترنة، ولا سيما تلك المرتبطة truncations شجيري ومحور عصبي أثناء إعداد شرائح الدماغ لأن هذه تؤثر بقوة التقديرات الاتصال. ومع ذلك، ونظرا للتنوع النهج تسجيل يقترن ذلك ستبقى أداة قيمة في تشخيص جوانب مختلفة من انتقال متشابك في تحديد رقائق الخلايا العصبية في الدماغ.

Introduction

رقائق العصبية بين الخلايا العصبية إلى جانب اثنين من synaptically هي لبنات بناء شبكات واسعة النطاق في الدماغ وهي الوحدات الأساسية لمعالجة المعلومات متشابك. ومن الشروط الأساسية لتوصيف هذه رقائق الخلايا العصبية هو معرفة مورفولوجيا والخصائص الفنية لكل من الخلايا العصبية شريك قبل وبعد المشبكي، ونوع من الاتصال متشابك (ق) وهيكلها وآلية وظيفية. ومع ذلك، في العديد من الدراسات من الاتصالات متشابك واحد على الأقل من الخلايا العصبية في المتناهية الصغر لا يتميز أيضا. هذه النتائج من بروتوكولات التحفيز غير محددة نسبيا غالبا ما تستخدم في دراسات الاتصال متشابك. لذلك، يتم إما لم تحدد الخصائص الهيكلية والوظيفية للعصبون قبل المشبكي على الإطلاق، أو فقط إلى حد صغير إلى حد ما (أي، والتعبير عن البروتينات علامة الخ). التسجيلات يقترن في تركيبة مع تلطيخ الخلايا بواسطة علامات الصورةاوك وbiocytin، neurobiotin أو الأصباغ الفلورية هي أكثر ملاءمة لدراسة رقائق الخلايا العصبية الصغيرة. هذا الأسلوب يسمح احد لتحقيق العديد من المعلمات الهيكلية والوظيفية للاتصال متشابك تحديدها شكليا في نفس الوقت.

وقد تم التحقيق في ما يسمى وصلات الأحادي المشبك "وحدوية" بين الخلايا العصبية في كل مناطق الدماغ القشرية وتحت القشرية ^1-10 باستخدام الاستعدادات شريحة الحادة. في البداية، استخدمت الميكروية حادة في هذه التجارب. في وقت لاحق، كان يعمل تسجيل المشبك التصحيح من أجل الحصول على تسجيلات لإشارات متشابك مع انخفاض مستوى الضجيج وتحسين القرار الزماني.

وكان التقدم التقني الكبير في استخدام الأشعة تحت الحمراء على النقيض تدخل الفرق (IR-DIC) البصريات ^11-14، وهي تقنية المجهرية التي تحسن كبير في وضوح وتحديد الخلايا العصبية في الدماغ شريحة بحيث أصبح من الممكن رس الحصول على تسجيلات من التعرف بصريا الاتصالات المشبكية ^15-17. بشكل عام، وتتم التسجيلات يقترن في الأعمال التحضيرية شريحة الحادة؛ فقط عدد قليل جدا من المنشورات تسجيلات التقارير المتاحة من الخلايا العصبية مرتبطة synaptically في الجسم الحي ^18-20.

أهم ميزة من التسجيلات يقترن هو حقيقة أن توصيف وظيفي يمكن جنبا إلى جنب مع التحليل الصرفي في كل من الضوء والإلكترون المستوى المجهري (انظر على سبيل المثال، ^7،16،21). بعد المعالجة النسيجية، وتتبع مورفولوجية شجيري ومحور عصبي من الزوج الخلايا العصبية مرتبطة synaptically. وفي وقت لاحق، فمن الممكن لتحديد معالم شكلية مثل الطول، الكثافة المكانية، والتوجه، المتفرعة نمط الخ ويمكن لهذه المعلمات ثم توفر أساسا لتصنيف موضوعي للاتصال متشابك محدد. وعلاوة على ذلك، على النقيض من معظم التقنيات الأخرى المستخدمة لدراسة connecti العصبيةvity، وإرفاقها التسجيلات يسمح أيضا تحديد من الاتصالات المشبكية للاتصالات متشابك وحدوية. ويمكن القيام بذلك مباشرة باستخدام مزيج من الضوء والمجهر الإلكتروني ^16،21-27 أو باستخدام التصوير الكالسيوم ^28،29 من العمود الفقري شجيري. ومع ذلك، مع النهج الأخير مثير فقط ولكن لا اتصالات المثبطة يمكن دراستها لأنه يتطلب تدفق الكالسيوم عن طريق القنوات مستقبلات بعد المشبكي.

بالإضافة إلى تحليل مفصل للانتقال متشابك في المتناهية الصغر يقترن التسجيلات العصبية يعرف أيضا السماح دراسة قواعد اللدونة متشابك ^30،31 أو - في تركيبة مع تطبيق ناهض / خصم - التشكيل من انتقال متشابك من قبل الناقلات العصبية مثل أستيل ³² و الأدينوزين ^33.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي لحماية الحيوانات، وقانون رعاية الحيوان الألمانية (Tierschutzgesetz) والمبادئ التوجيهية للاتحاد من جمعية علم الحيوان مختبر الأوروبي.

1. مجموعة المتابعة لالكهربية

قبل البدء مع تسجيل تقرن، وهو الكهربية انشاء أن تكون مبنية. لمحة موجزة كيف يتم تجميع مثل هذه مجموعة المتابعة يرد أدناه:

1. تثبيت جدول مضادة للاهتزاز والتي سيتم وضع المجهر، المتلاعبين وجميع المعدات الأخرى.
   ملاحظة: الاهتزاز أو أي نوع آخر من الحركة تحتاج إلى أن تكون صغيرة قدر الإمكان عند التسجيل من الاتصالات المشبكية لأن هذا يتطلب تغييرا في الماصات (البحث الكهربائي محله تسجيل القطب).
2. ضع قفص فاراداي حول طاولة مضادة للاهتزاز للحد من الضوضاء الكهربائية. ربط جميع المعدات داخل كاليفورنيا فارادايجنرال الكتريك مع الأرض الكهربائية.
3. تثبيت المجهر مع محور التركيز الآلية التي تقوم على طاولة س ص بمحركات على الطاولة مضادة للاهتزاز وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة. وهذا يسمح للتحرك بشكل موثوق المجهر لالخلايا العصبية التي ليست في نفس مجال الرؤية كما هو الحال بالنسبة لاتصالات translaminar في القشرة المخية الحديثة.
4. تثبيت كاميرا فيديو على منفذ الكاميرا المجهر وذلك لربط التناظرية وشاشات / أو رقمية لمراقبة إعداد شريحة والحركة من الأقطاب الكهربائية. استخدام الكاميرا، والتي يمكن أن تنتقل بين المنخفضة والتكبير عالية الطاقة للحصول على نظرة عامة وصورة عن قرب، على التوالي، من الزوج الخلايا العصبية إلى جانب synaptically. وهذا يساعد أيضا في السيطرة على حركة الأقطاب التصحيح.
5. تثبيت الجدول عينة تحتوي على أقحم لغرفة الحمام (حفر في المنزل من كتلة البرسبيكس) لإعداد شريحة الدماغ. لا يجب أن تكون متصلا هذا الجدول عينة لالمجهر، أي يجب أن تكون ثابتة إلى طاولة الهواء ويجب أن يكون المجهر المناورة تحته.
6. جبل اثنين (أو أكثر إذا لزم الأمر) micromanipulators عالية الدقة التي يمكن نقلها في جميع الأبعاد الثلاثة. تثبيت التصحيح، المشبك مكبر للصوت قبل على المتلاعبين وربطها مكبر للصوت الرئيسي.
   ملاحظة: إذا كان من الممكن تثبيت المتلاعبين الإضافي اللازم لمثل أكثر من اثنين من مكبرات الصوت مسبقا، أقطاب التحفيز خارج الخلية، وأنظمة المخدرات التسليم، الخ.
7. ضع غرفة حمام في الجدول العينة. تثبيت مدخل حل ومخرج وربطها لنظام الارواء.
8. استخدام مضخة تمعجية للحفاظ على نضح من غرفة تسجيل مع السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF، الجدول 1) بمعدل تدفق ثابت من 4-6 مل / دقيقة لالأمثل الجدوى شريحة.
   ملاحظة: لا يتجاوز هذا المعدل تدفق كبير كما انه سيؤدي الى اضطراب في ASCF وبالتالي حركة شريحة.
9. تثبيت أصحاب لتحقيق درجة الحرارة وحج / أجكل القطب الأرض على الطاولة العينة. وهذا أمر ضروري للسماح التحقيق والقطب لأخذ عينات من الحمام في الغرفة.
10. لرؤية جيدة من الخلايا العصبية في إعداد شريحة استخدام الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء في المجهر. وهذا يقلل حيود الضوء، وبالتالي طمس الصورة. ضمان أن يتم تجهيز المجهر مع التفاضلية البصريات التدخل النقيض لتحقيق "3D' مثل التصور. وهذا سوف يساعد ترميم الخلايا العصبية والسماح استهداف الخلايا العصبية العميقة في شريحة (60 ميكرون أو أعمق).
11. خلال التجربة، والحفاظ على شرائح الدماغ في غرفة تجريبية مع ساترة الزجاج في الجزء السفلي. وضع "القيثارة البلاتين" في الجزء العلوي من شريحة لمنع شرائح من العائمة. يتم إجراء القيثارة البلاتين من على شكل حرف U، سلك البلاتين بالارض مع سلاسل من خيط تنظيف الأسنان لصقها على ذلك.
12. الحفاظ على ACSF perfusing شريحة عند درجة حرارة 32-35 ° C لضمان التقيدالسيطرة IMAL من الأوكسجين ودرجة الحموضة. ويمكن القيام بذلك عن طريق تسخين حل مع جهاز بلتيير المثبتة على مقربة من تدفق ACSF في غرفة الحمام.
    ملاحظة: استخدام غطاء سامسونج زلات لدرجة أنه حتى المكثفات المجهر مع الفتحة العددية العالية والعمل لمسافات قصيرة يمكن أن تركز على العينة. وهذا أمر ضروري لإضاءة الأمثل للشريحة.
    للحصول على صورة ووصفا لالكهربية انشاء الأمثل لتسجيلات المقترنة في إعداد شريحة الدماغ انظر الشكل 4 في المرجع. ^34.

2. الدماغ شريحة التحضير

1. أقل ما يقال تخدير الحيوان من الذي ينبغي أن تؤخذ في أنسجة المخ مع isoflurane (تركيز النهائي <0.1٪).
   ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم المسكنات الأخرى. استخدام مخدر ينبغي أن تتوافق مع توصيات وقواعد لجنة الحيوانية منها و. تأكد دائما أن الحيوان ليس غضب أو تحت الضغط بعد إضافةتأثير المخدر.
2. قطع رأس الحيوان، وفتح الجمجمة وإزالة الدماغ في أسرع وقت ممكن باستخدام الإجراء الموضح في المرجعان ^34،35.
3. نقل الدماغ إلى تبريد (4 ° C) السائل النخاعي الاصطناعي الغازي مع خليط من الغاز كربوجين مع 95٪ O ₂ و 5٪ CO _2.
4. عزل منطقة الدماغ التي ينبغي دراستها.
   ملاحظة: المعلمات للحصول على الحفاظ الأمثل والحد الأدنى من الاقتطاع من التشعبات ومحاور الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي ينبغي أن تحدد مقدما لكل اتصال الخلايا العصبية والمرحلة التنموية قيد التحقيق. في شريحة الدماغ تشريح على النحو الأمثل، غير مطلوب محور عصبي من عصبون قبل المشبكي أن تكون موازية لسطح شريحة. بدلا من ذلك، ينبغي أن نشير إلى شرائح مع زاوية الضحلة. وينطبق على التغصنات قمية من الخلايا العصبية الهرمية بعد المشبكي. هذا يجب أن يتم التحقق تحت المجهر الضوئي. هذا مهم بشكل خاص لغير المحلية أو تيالاتصالات المشبكية ranslaminar، أي، حيث somata قبل وبعد المشبكي أكثر من 200 ميكرون، وبصرف النظر عن احتمال truncations شجيري ومحور عصبي من المرجح أن يكون أعلى بكثير للاتصالات المحلية.
5. نقل الدماغ إلى غرفة مبضع للفحص المجهري. وبناء على النتائج التجريبية، وتستخدم مختلف الحلول تشريح خارج الخلية اعتمادا على عمر الحيوان (انظر الجدولين 2 و 3، ويمكن أيضا الحصول على معلومات مفيدة تحت عنوان " http://www.brainslicemethods.com/ ').
6. تقليم الدماغ حتى المنطقة المستهدفة هي مرئية.
7. للحصول على شرائح مع الرؤية خلية جيد، وقطع 300-400 ميكرون شرائح سميكة الدماغ إذا كان الحيوان الناضج (> 3 أسابيع). إذا كان الحيوان غير ناضجة ⁽¹ حتى 2 ^{الثانية} الأسبوع ما بعد الولادة بالنسبة للفئران والجرذان) شرائح يمكن خفض ما يصل الى سمك ~ 600-800 ميكرون دون المساس بشكل كبير visib خليةility.
   ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى تحسين استقرار شرائح "غير ناضجة" وتقليل عدد truncations الممكنة من بعيدة المدى شجيري والضمانات محور عصبي.
8. نقل شرائح من الغرفة مبضع للفحص المجهري إلى غرفة الحضانة مليئة حل تشريح الغازي مع خليط من 95٪ O ₂ و 5٪ CO _2. الحفاظ على شرائح في غرفة الحضانة للا يقل عن 30 دقيقة إلى 1 ساعة إما في RT أو في ~ 30 ° C، وهذا يتوقف على نوع من التجربة.

3. الموثوقة التصحيح، المشبك تسجيل وتعبئة Biocytin

اعتمادا على نوع الاتصال متشابك وتستخدم ثلاثة نهج مختلفة للعثور على الخلايا العصبية إلى جانب synaptically. إذا كان احتمال اتصال منخفضة (كما يمكن أن يتوقع للاتصالات الأكثر مثير)، والمضي قدما على النحو التالي:

1. الوصلات العصبية مع الربط المنخفض
   1. ملء ماصات التصحيح مع حل داخلي للتكوين المدرجةفي الجدول رقم 4 لجميع التسجيلات في تكوين خلية كاملة إضافة biocytin بتركيزات تتراوح بين 3 - 5 ملغ / مل إلى (ماصة) حل داخلي للحصول على نتائج جيدة لتلطيخ الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي. السماح biocytin منتشر في الخلية لا يقل عن 15 - 30 دقيقة (اعتمادا على حجم الخلايا العصبية).
      ملاحظة: لا إضافة biocytin إلى حل المستخدمة في 'البحث' الماصات المذكورة أدناه.
   2. تصحيح عصبون بعد المشبكي المفترضة في وضع خلية كاملة. استخدام ماصات التصحيح مع عرقوب طويلة ونحيلة. وهذا يسهل على المناورة من ماصة تحت الهدف ويقلل من القطع الأثرية الحركة التي قد تحدث عند تقديم القطب في شريحة.
   3. ثم، والتصحيح عصبون قبل المشبكي المحتملة في تكوين الخلية المرفقة باستخدام "البحث" ماصة التصحيح من 8-10 المقاومة MΩ وقطر الحافة الصغيرة. مع هذه الماصات تأسيس "فضفاضة" التصحيح الخلية المرفقة. سن الفيلل في "البحث" ماصة مع الحل الداخلي الذي يتم استبدال K ⁺ التي كتبها نا ⁺ (جدول رقم 5) لكي لا يزيل الاستقطاب الخلايا العصبية أثناء البحث عن خلية قبل المشبكي.
      ملاحظة: "فضفاضة" المقاومة ختم ليست في نطاق GΩ لكن عادة حوالي 30-300 MΩ.
   4. عقد غشاء المحتملة تحت ختم "فضفاضة" إلى حوالي -30 إلى -60 بالسيارات في وضع المشبك الحالي. ثم، وتطبيق البقول الحالية كبيرة (0،2-2 NA) للحصول على إمكانات العمل في الخلية قبل المشبكي المحتملة. مراقبة هذا إمكانات العمل باعتباره السنيبلات صغيرة على استجابة الجهد.
   5. ضبط التردد التحفيز إلى 0.1 هرتز لمنع متهدم من استجابة بعد المشبكي. استخدام أقل ترددات التحفيز في حالة أنسجة المخ هي غير ناضجة جدا أو اتصال متشابك لا يمكن الاعتماد عليها للغاية.
   6. في حال لم يستجب الخلايا العصبية "بعد المشبكي" لتحفيز NEU اختبار "قبل المشبكي"رون، والتصحيح الخلايا العصبية الجديدة في "فضفاضة" وضع الختم. لا يحل محل "البحث" القطب التصحيح طالما الختم مع مقاومة> تم تأسيس 30 MΩ. اختبار ما يصل إلى 30 الخلايا العصبية قد تكون قبل المشبكي في هذا السبيل.
      ملاحظة: لمنع إتلاف الخلايا العصبية أثناء إجراء البحث مع المشبك التصحيح فضفاضة، بلطف فقط ينبغي تطبيق الشفط إلى ماصة البحث مقارنة مع تلك المطبقة على التصحيح ماصة خلية كاملة.
   7. إذا التحفيز في 'فضفاضة' نتائج وضع ختم في الكامن الاستثاري بعد المشبكي / IPSP مع الكمون <5 ميللي ثانية في الخلايا العصبية بعد المشبكي إزالة "البحث" ماصة من الخلايا العصبية قبل المشبكي.
   8. استبدال "البحث" ماصة التصحيح مع القطب التصحيح مليئة التي تحتوي على biocytin، حل داخلي منتظم. ضمان هذا ماصة تسجيل التصحيح لديه مقاومة للمن 4 - 8 MΩ. وأكبر حجم سوما وانخفاض مقاومة القطب يمكن أن يكون.
   9. تصحيح قبل المشبكيالخلايا العصبية وسجل في خلية كاملة، ووضع المشبك الحالي. انتزاع امكانات العمل عن طريق الحقن الحالي في الخلايا العصبية قبل المشبكي وتسجيل استجابة بعد المشبكي. تخزين البيانات على جهاز كمبيوتر في وقت لاحق خارج الخط التحليل.
2. الوصلات العصبية مع الربط عالية
   ملاحظة: للحصول على رقائق الخلايا العصبية مع نسبة توصيلية عالية (> 30٪) استخدام إجراء مختلف لإيجاد صلات متشابك. ويرد هذا الإجراء أدناه وغالبا ما يستخدم للاتصال متشابك المثبطة التي لديها في المتوسط ​​نسبة الربط أعلى من اتصالات مثير ^36. لا ينبغي أن تستخدم أنه عندما تنخفض نسبة الربط أقل من هذه القيمة.
   1. تصحيح عصبون قبل المشبكي مباشرة في وضع خلية كاملة. ثم، والتصحيح عصبون بعد المشبكي المحتملة، وأيضا في وضع خلية كاملة. يجب أن يكون كل من الخلايا تحت السيطرة المشبك الحالية. انتزاع إمكانات العمل في الخلية قبل المشبكي. مراقبة الخلايا العصبية بعد المشبكي المحتملين لpostsyإمكانية naptic.
   2. في حالة لا تظهر الخلايا العصبية ردا على التحفيز قبل المشبكي، والتصحيح الخلايا العصبية الجديدة في وضع خلية كاملة باستخدام القطب التصحيح مليئة حل داخلي منتظم. إذا تم العثور على اتصال، لا تغيير ماصة التصحيح ولكن المضي قدما في التسجيل. ثم، والمضي قدما كما في الخطوة 3.1.9.
3. الوصلات العصبية عبر الفجوة تقاطعات
   ملاحظة: للبحث الكهربائية (الفجوة تقاطع) وصلات استخدم الإجراء التالي الذي هو نسخة معدلة من تلك المستخدمة للاتصالات المنخفض الاحتمالات.
   1. تصحيح عصبون بعد المشبكي في خلية كاملة التكوين المشبك التصحيح.
   2. وفي وقت لاحق، والتصحيح الخلايا العصبية المفترضة قبل المشبكي في تكوين فضفاض ختم (منخفض المقاومة ختم 30-300 MΩ) باستخدام "البحث" ماصة التصحيح من 7 - 10 MΩ المقاومة. ينبغي أن تملأ هذا ماصة مع ارتفاع الحل نا ⁺ الداخلي المعدل لتحفيز فضفاض الختم.
   3. Injecر 100-300 ميللي ثانية البقول الحالية hyperpolarizing طويلة عن طريق ختم "فضفاضة". يجب تعيين إمكانات القيادة ماصة إلى حوالي -60 إلى -70 بالسيارات. نلاحظ اتصال الفجوة مفترق إذا كان هذا النتائج التحفيز في رد hyperpolarizing صغيرة في الخلايا العصبية "بعد المشبكي.
   4. Repatch الخلايا العصبية "قبل المشبكي" في وضع خلية كاملة والمضي قدما كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: لضمان تلطيخ الجيد للعمليات محور عصبي وشجيري، استخدام بروتوكول الواردة أدناه. يوصف هذا البروتوكول باختصار هنا، ومع ذلك، ونظرا بروتوكول مفصلة لمعالجة النسيجية المستخدمة في المختبر لدينا في المرجع. ^37.

4. تجهيز الكيمو

1. نقل شريحة الدماغ مع زوج من الخلايا العصبية إلى جانب synaptically إلى قارورة تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد الذائبة في 0.1 M عازلة الفوسفات ويحملق شريحة لمدة 24 ساعة. لالمجهر الإلكتروني، يحملق شريحة باستخدام 2.5٪ glutarألدهيد و 1٪ بارافورمالدهيد.
2. في اليوم التالي، ونقل إلى شرائح عازلة الفوسفات العادي لا تحتوي على مثبت. تغسل شرائح مع العازلة الفوسفات ل6-8 مرات لمدة 10 - 15 دقيقة لكل لإزالة تثبيتي الزائد.
3. احتضان شرائح لمدة 20 دقيقة في 3٪ H ₂ O ₂ الحل في 0.1 M الفوسفات العازلة للحد من رد فعل البيروكسيداز الذاتية. نلاحظ تشكيل فقاعة قوية. مواصلة التفاعل حتى يتم إنتاج أي فقاعات أخرى. ثم، وشطف الشرائح في 0.1 M عازلة الفوسفات ل6-8 مرات (لمدة 10 دقيقة لكل منهما) لإزالة أي H ₂ O ₂ المتبقية.
4. ردود الفعل Immunocytochemical واللونية
   ويستند التصور من الخلايا العصبية مليئة biocytin على الفجل البيروكسيديز رد فعل streptavidin المعقدة البيروكسيديز حفز مع diaminobenzidine. وهذا ينتج راسب الظلام التي تنتج وصمة عار هش مع قرار مكانية عالية. وتستخدم الإجراءات التالية للتفاعل مولد اللون: <رأ>
5. إعداد الحل ABC حسب بروتوكول للتصنيع. أضف إلى 14.55 مل الفوسفات عازلة تستكمل مع 150 ميكرولتر 10٪ تريتون X100 (الجدول 6؛ فقط لالمجهر الضوئي) والحفاظ على حل لحوالي 30 دقيقة في الظلام. احتضان الشرائح في هذا الحل O / N قبل الاستخدام.
6. احتضان شرائح في حل ABC على شاكر لمدة 1 ساعة على RT وفي الظلام. وفي وقت لاحق، والحفاظ على شرائح O / N عند 4 درجات مئوية في الثلاجة. على صباح اليوم التالي، واحتضان شرائح في RT لمدة ساعة إضافية.
7. بعد هذا، وشطف شرائح أربع مرات على الأقل لمدة 10 دقيقة لكل منهما في المخزن الفوسفات. ثم، واحتضان على شاكر لمدة 30 دقيقة في الظلام في 2 مل من محلول 3-3'-diaminobenzidine-تكثيف النيكل (الجدول 7). كن حذرا جدا عند التعامل مع diaminobenzidine واستخدام فقط تحت غطاء الدخان. فمن مسرطنة للغاية حتى بتركيزات منخفضة جدا.
8. إضافة 6.5 ميكرولتر 3٪ H ₂ O ₂ إلى التي تحتوي على diaminobenzidineالحل. مراقبة رد فعل مولد اللون تحت المجهر الخفيفة حتى الخلايا العصبية الملون البني والأسود هي واضحة للعيان. ثم، والتوقف عن رد فعل على الفور من قبل غسل شرائح عدة مرات في المخزن الفوسفات.
9. جبل شرائح مع الخلايا العصبية الملون على لاصق، المغلفة سيلاني Histobond أو مهيلم الشرائح الكائن القياسية.
10. الحفاظ على الشرائح في غرفة رطبة مع لا يقل عن 80٪ الرطوبة O / N. في اليوم التالي، والسماح للشرائح الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة أخرى. قبل التضمين، والشرائح نقل في الحلول مع زيادة تركيزات الإيثانول (20 - 100٪) من أجل يذوى لهم.
    ملاحظة: يجب أن تكون عملية بطيئة الجفاف خلاف ذلك التشوهات في عمليات شجيري ومحور عصبي من المحتمل أن تحدث ^37. إذا ما تم اختيار إجراء التضمين بديل، على سبيل المثال، واحدة مع Moviol القائم على الجلسرين، لا بد من الجفاف. ولكن هذا من المرجح أن يؤدي إلى ضغط غير متجانسة من شريحة وبالتالي morpholo العصبية مشوهةغراي.
11. وأخيرا، واحتضان لمدة 10 دقيقة في زايلول، تضمين شرائح في وسط التضمين مسعور لالمجهر الضوئي ووضع coverslips رقيقة جدا على القمة. السماح الشرائح تجف لمدة 20 دقيقة في RT.

5. العصبية إعادة الإعمار ومتشابك الاتصال التعريب

1. فحص الشرائح مع الخلايا العصبية التي تحمل علامات biocytin تحت المجهر ضوء مجهزة الهدف الغمر النفط 60X / 100X ومكثف مع فتحة عددية عالية لقرار المكاني الأمثل. ضمان حبات محواري والعمود الفقري شجيري هي واضحة للعيان.
2. تتبع الخلايا العصبية أو أزواج الخلايا العصبية إلى جانب synaptically باستخدام الخلايا العصبية التجارية نظام التتبع (انظر الجدول مواد معينة / معدات) للحصول على 3D إعادة بناء الخلايا العصبية. تنفيذ تتبع يدويا تحت الفحص البصري المستمر للكشف عن محواري حتى صغيرة أو الضمانات شجيري. للتسجيلات تقرن من الخلايا العصبية إلى جانب synaptically تتبع اليدوي لا يزال طريقةالاختيار لأن إسناد مثل ملف تعريف المحاور إما إلى الخلايا العصبية ما قبل أو بعد المشبكي يتطلب خبرة كبيرة إعادة الإعمار.
3. إذا لزم الأمر، وجعل التهم من حبات محور عصبي و / أو العمود الفقري شجيري. وذلك لأن العمود الفقري أو حتى أنواع فرعية العمود الفقري وحبات محور عصبي قد يحمل توزيع وكثافة محددة فيما يتعلق على سبيل المثال، طبقة قشرية أو المنطقة، وهذا يمكن أن تساعد على توصيف أنواع الخلايا العصبية.
4. للأزواج الخلايا العصبية إلى جانب synaptically، والتحقق من محور عصبي قبل المشبكي وبعد المشبكي التشعبات لappositions وثيقة على أعلى التكبير المتاحة. مراقبة وحبة محواري والعمود الفقري شجيري بعد المشبكي أو رمح هو في نفس المستوى البؤري يمكن اعتبار جهة اتصال متشابك المفترضة. بمناسبة هذا الاتصال في إعادة الإعمار.
5. تصحيح إعادة بناء الخلايا العصبية للانكماش في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة في القسم المناسب من برنامج البحث عن المفقودين.
   ملاحظة: أثناء التثبيت، ومعالجة النسيجيةوالجفاف تشوه الميكانيكية كبير وانكماش يحدث. هذا سوف يؤثر على قياسات طول محور عصبي وشجيري وتشويه بشدة الترتيب المكاني. عوامل التصحيح انكماش على المدى المتوسط ​​تضمين هي ~ 1.1 لx و y و الاتجاهات ~ 2.1 ^لZ-37 الاتجاه.
6. للاطلاع على تحليل الصرفي الكمي استخدام برنامج تحليل البيانات لالفسيولوجيا العصبية (انظر جدول المواد معينة / المعدات).

النتائج

التسجيلات يقترن هي الطريقة المفضلة لتوصيف متعمقة لتحديد شكليا الاتصالات المشبكية الكون أو ثنائية الاتجاه وكذلك تقاطع الفجوة (الكهربائية) وصلات (الشكل 1). ويظهر مثال على تسجيل المقترنة في الطبقة 4 من القشرة الحسية الجسدية برميل في الشكل 1A. يمكن وصفها...

Discussion

التسجيلات تقرن من جانب مثير synaptically و / أو الخلايا العصبية المثبطة هي أسلوب شديد التنوع لدراسة رقائق الخلايا العصبية. لا يقتصر هذا النهج يسمح احد لتقدير اتصال متشابك بين أنواع الخلايا العصبية ولكنه يسمح أيضا تحديد الخصائص الوظيفية لاتصال والتشكل من الخلايا العصبية ق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA	EPC 10 USB Triple	with 2 - 3 preamplifiers
Microscope	Olympus	BX51WI	with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective
Camera	TILL Photonics	VX55	infrared CCD camera
Workstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5	x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers
Faraday cage	Luigs & Neumann
Anti-vibration table	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
Microtome	Microm International	HM650V
Micropipette puller	HEKA	Sutter P-97
Neurolucida system	Microbrightfield		with Neurolucida and Neuroexplorer softwares