Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

Resumen

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Resumen

La combinación de grabaciones de patch clamp de dos (o más) las neuronas sinápticamente acoplados (grabaciones emparejadas) en forma de preparados agudos cortes de cerebro con relleno biocitina intracelular simultánea permite un análisis de correlación de sus propiedades estructurales y funcionales. Con este método es posible identificar y caracterizar las neuronas pre y postsinápticos por su morfología y patrón de respuesta electrofisiológica. Grabaciones apareadas permiten el estudio de los patrones de conectividad entre estas neuronas, así como las propiedades tanto de la transmisión sináptica química y eléctrica. Aquí, le damos una descripción paso a paso de los procedimientos necesarios para obtener grabaciones pareadas fiables junto con una óptima recuperación de la morfología de las neuronas. Vamos a describir cómo se identifican los pares de neuronas conectadas a través de las sinapsis químicas o cruces brecha en el tramo preparativos cerebro. Vamos a describir cómo se reconstruyen las neuronas para obtener su morfología 3D del Dendritic y dominio axonal y cómo los contactos sinápticos son identificados y localizados. También discutiremos las salvedades y limitaciones de la técnica de grabación emparejado, en particular los relacionados con truncamientos dendríticas y axonales durante la preparación de cortes de cerebro, porque esto afecta fuertemente las estimaciones de conectividad. Sin embargo, debido a la versatilidad del enfoque de grabación emparejado seguirá siendo una herramienta valiosa en la caracterización de diferentes aspectos de la transmisión sináptica en microcircuitos neuronales identificados en el cerebro.

Introducción

Microcircuitos neuronales entre dos neuronas sinápticamente acoplados son los bloques de construcción de redes a gran escala en el cerebro y son las unidades fundamentales de procesamiento de la información sináptica. Un requisito previo para la caracterización de tales microcircuitos neuronales es conocer la morfología y propiedades funcionales de las neuronas asociadas ambos pre y postsinápticos, el tipo de la conexión sináptica (s) y su estructura y mecanismo funcional. Sin embargo, en muchos estudios de conexiones sinápticas al menos una de las neuronas en un microcircuito no está bien caracterizado. Esto resulta de los protocolos de estimulación relativamente inespecíficos menudo utilizados en los estudios de la conectividad sináptica. Por lo tanto, las propiedades estructurales y funcionales de la neurona presináptica o bien no están identificados en absoluto o sólo a una parte bastante pequeña medida (es decir, la expresión de proteínas marcadoras etc.). Grabaciones pareadas en combinación con tinción intracelular de marcadores such como biocitina, neurobiotin o tintes fluorescentes son más adecuados para el estudio de pequeños microcircuitos neuronales. Esta técnica permite a uno investigar muchos parámetros estructurales y funcionales de una conexión sináptica morfológicamente identificado al mismo tiempo.

Las denominadas conexiones monosynaptic 'unitarios' entre dos neuronas se han investigado en ambas regiones cerebrales corticales y subcorticales ^1-10 utilizando el tramo preparativos agudas. Inicialmente, se utilizaron microelectrodos afilados en estos experimentos; más tarde, la grabación de patch clamp fue empleado para obtener grabaciones de señales sinápticas con un nivel de ruido inferior y una mejor resolución temporal.

Un avance técnico significativo fue el uso de contraste de interferencia diferencial de infrarrojos (IR-DIC) óptica ^11-14, una técnica microscópica que mejoró significativamente la visibilidad y la identificación de las neuronas en el cerebro rebanada de manera que se hizo posible to obtener grabaciones de las conexiones sinápticas identificados visualmente ^15-17. En general, las grabaciones pareados se realizan en el tramo preparativos agudas; sólo muy pocas publicaciones son grabaciones de informes disponibles de neuronas conectadas sinápticamente in vivo ^18-20.

La ventaja más importante de grabaciones emparejados es el hecho de que una caracterización funcional puede ser combinado con un análisis morfológico, tanto en la luz y nivel microscópico de electrones (véase, por ejemplo., ^7,16,21). Después del procesamiento histoquímica, la morfología dendrítica y axonal del par de neuronas conectadas sinápticamente se traza. Posteriormente, es posible cuantificar las características morfológicas, como la longitud, la densidad espacial, la orientación, el patrón de ramificación etc. Estos parámetros pueden entonces servir de base para una clasificación objetiva de una conexión sináptica específica. Además, en contraste a la mayoría de otras técnicas utilizadas para el estudio de connecti neuronalesVity, emparejado grabaciones también permiten la identificación de los contactos sinápticos para las conexiones sinápticas unitarios. Esto se puede hacer directamente utilizando una combinación de luz y microscopía electrónica ^16,21-27 o el uso de imágenes de calcio ^28,29 de las espinas dendríticas. Sin embargo, con este último enfoque sólo excitatorio pero no conexiones inhibitorias se pueden estudiar ya que requiere la entrada de calcio a través de los canales de los receptores postsinápticos.

Además de un análisis detallado de la transmisión sináptica en un microcircuito emparejado grabaciones neuronales definidas también permitir que el estudio de las reglas de plasticidad sináptica ^30,31 o - en combinación con la aplicación agonista / antagonista - la modulación de la transmisión sináptica por los neurotransmisores tales como la acetilcolina ³² y adenosina ^33.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se han llevado a cabo de conformidad con la Directiva de la UE para la Protección de los Animales, la Ley de Bienestar Animal Alemán (Tierschutzgesetz) y las Directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio Europeo.

1. Configuración de Electrofisiología

Antes de comenzar con la grabación emparejado, un electrofisiología configuración tiene que ser construido. Un breve resumen de cómo se monta una puesta a punto tal es la siguiente:

1. Instalar una mesa anti-vibración en el que se colocarán el microscopio, los manipuladores y el resto del equipo.
   NOTA: la vibración o cualquier otro tipo de movimiento tiene que ser tan pequeño como sea posible cuando la grabación de las conexiones sinápticas porque esto requiere un cambio de pipetas (búsqueda electrodo sustituido por electrodo de registro).
2. Coloque una jaula de Faraday alrededor de la mesa anti-vibración para reducir el ruido eléctrico. Conecte todos los equipos dentro de la ca Faradayge con la tierra eléctrica.
3. Instale un microscopio con un eje enfoque motorizado que se basa en una mesa XY motorizada sobre la mesa anti-vibración de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto permite mover de forma fiable el microscopio para las neuronas que no están en el mismo campo de vista, ya que es el caso para las conexiones translaminar en el neocórtex.
4. Instalar una cámara de vídeo en el puerto de la cámara del microscopio y conéctelo a analógico y / o pantallas digitales para observar la preparación rebanada y el movimiento de los electrodos. Utilice una cámara, que se puede cambiar entre una una imagen de primer plano de bajos y una magnificación de alta potencia para obtener una visión general y, respectivamente, de la pareja de células neuronales sinápticamente acoplado. Esto también ayuda a controlar el movimiento de los electrodos de conexión.
5. Instalar una mesa muestra que contiene una inserción para la cámara de baño (perforado en la casa de un bloque de plexiglás) para la preparación de cortes de cerebro. Esta tabla muestra no debe estar conectado a lamicroscopio, es decir, debe ser fijado a la mesa de aire y el microscopio debe ser maniobrable debajo de ella.
6. Monte dos (o más si es necesario) micromanipuladores de alta precisión que se pueden mover en las tres dimensiones. Instale patch-clamp preamplificador de los manipuladores y conectarlos al amplificador principal.
   NOTA: Si manipuladores adicionales necesarios se pueden instalar para, por ejemplo, más de dos pre-amplificadores, electrodos de estimulación extracelular, sistemas de liberación de fármacos, etc.
7. Coloque la cámara de baño en la tabla de muestras. Instale una entrada de la solución y de salida y conectarlos al sistema de perfusión.
8. Utilice una bomba peristáltica para mantener la perfusión de la cámara de registro con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF; Tabla 1) a una velocidad de flujo estable de 4 - 6 ml / min para la viabilidad óptima rebanada.
   NOTA: No exceda este caudal significativamente, ya que dará lugar a la turbulencia en el ASCF y por lo tanto el movimiento de la rebanada.
9. Instale los soportes para la sonda de temperatura y Ag / AgCl electrodo de masa sobre la mesa de la muestra. Esto es necesario para permitir que la sonda y el electrodo a la muestra del baño en la cámara.
10. Para una buena visibilidad de las neuronas en la preparación rebanada utilizar iluminación infrarroja en el microscopio. Esto reduce difracción de la luz y por lo tanto las imágenes borrosas. Asegúrese de que el microscopio está equipado con óptica de contraste de interferencia diferencial para lograr una "visualización 3D' similar. Esto ayudará a parchar las neuronas y permitiría atender las neuronas de profundidad en el corte (60 micras o más profundo).
11. Durante el experimento, mantener rodajas de cerebro en una cámara experimental con un cubreobjetos de vidrio en la parte inferior. Coloque una "arpa platino 'en la parte superior de la rebanada para evitar rebanadas flote. Un arpa de platino se hace de forma de U, alambre de platino aplanado con las cadenas de hilo dental pegados en la misma.
12. Mantenga la ACSF perfusión del rebanada a la temperatura de 32 - 35 ° C para asegurar optControl imal de oxigenación y pH. Esto se puede hacer mediante el calentamiento de la solución con un dispositivo Peltier instalado cerca de la entrada ACSF en la cámara de baño.
    NOTA: Utilice la cubierta ultrafina resbala por lo que incluso los condensadores de microscopio con una alta apertura numérica y corta distancia de trabajo se pueden centrar en la muestra. Esto es necesario para una iluminación óptima de la rebanada.
    Para una imagen y una descripción de un electrofisiología configuración optimizada para grabaciones pareadas en la preparación de cortes de cerebro véase la Figura 4 en la Ref. ^34.

2. Preparación de la rebanada del cerebro

1. Ligeramente anestesiar al animal del que el tejido cerebral se debe tomar con isoflurano (concentración final <0,1%).
   NOTA: Otros anestésicos también se pueden utilizar. El uso de la anestesia debe cumplir las recomendaciones y normas de la comisión de los animales en cuestión. Asegúrese siempre de que el animal no se irrita o bajo estrés después de añadirel anestésico.
2. Decapitar al animal, abrir el cráneo y el cerebro eliminar lo más rápidamente posible usando el procedimiento descrito en las Refs. ^34,35.
3. Transferir el cerebro en enfriada (4 ° C) líquido cefalorraquídeo artificial aireada con una mezcla de gas carbógeno con 95% O ₂ y 5% de CO _2.
4. Aislar la región del cerebro que se debe estudiar.
   NOTA: Los parámetros para obtener conservación óptima y el truncamiento mínima de dendritas y axones de las neuronas pre y postsinápticos se debe determinar de antemano para cada conexión neuronal y la etapa de desarrollo bajo investigación. En un corte de cerebro de manera óptima diseccionado, el axón de la neurona presináptica no está obligado a ser paralela a la superficie de la rebanada. Más bien, deben apuntar a las rebanadas con un ángulo pequeño. El aplica para la dendrita apical de las neuronas piramidales postsinápticos; este debe ser revisado con el microscopio óptico. Esto es particularmente importante para no local o tconexiones sinápticas ranslaminar, es decir., en donde somata pre- y postsináptica son más de 200 m de distancia y la probabilidad de truncamientos dendríticas y axonales es probable que sea sustancialmente más alto que para las conexiones locales.
5. Transferir el cerebro a la cámara de microtomo. Con base en los hallazgos empíricos, diferentes soluciones rebanar extracelular se utilizan en función de la edad del animal (véanse los cuadros 2 y 3, información útil también se puede encontrar en ' http://www.brainslicemethods.com/ ').
6. Recorte el cerebro hasta la región de destino es visible.
7. Para obtener rodajas con una visibilidad de células bueno, cortar 300-400 m de espesor rodajas de cerebro si el animal es maduro (> 3 semanas). Si el animal es inmaduro ^(1ª a ^2ª semana postnatal para los ratones y ratas) rebanadas pueden cortar hasta un espesor de ~ 600 a 800 micras sin perjudicar sustancialmente visib celularility.
   NOTA: Esto mejorará la estabilidad de las rebanadas 'inmaduras' y reducir el número de posibles truncamientos de dendrítica de largo alcance y las colaterales axónicas.
8. Transferir las rebanadas de la cámara de microtomo a una cámara de incubación lleno de solución rebanar aireada con una mezcla de 95% O ₂ y 5% de CO _2. Mantenga los segmentos en la cámara de incubación durante al menos 30 min a 1 hr a RT o ya sea a ~ 30 ° C, dependiendo del tipo de experimento.

3. emparejados Patch-Clamp Grabación y Biocitina Relleno

Dependiendo del tipo de conexión sináptica tres enfoques diferentes se utilizan para encontrar neuronas sinápticamente acoplados. Si la probabilidad de conexión es baja (como se puede esperar para las conexiones más excitadoras), proceda de la siguiente manera:

1. Conexiones neuronales con una conectividad de bajo
   1. Llenar las pipetas de parche con una solución interna de la composición de la listaen la Tabla 4 para todas las grabaciones en la configuración de célula completa añadir biocitina a concentraciones entre 3 -. 5 mg / ml a la solución (pipeta) interna para obtener buenos resultados de la tinción para las neuronas pre y postsinápticos. Deje biocitina difusa en la célula durante al menos 15 - 30 min (dependiendo del tamaño de la neurona).
      NOTA: No agregue biocitina a la solución utilizada en los 'busca' pipetas se mencionan a continuación.
   2. Parche una neurona postsináptica putativo en el modo de célula entera. Utilice pipetas de parche con una larga y delgada caña. Esto facilita la maniobrabilidad de la pipeta con arreglo al objetivo y reduce los artefactos de movimiento que pueden ocurrir cuando el electrodo se introduce en el corte.
   3. Entonces, un parche en una potencial neurona presináptica en una configuración celular conectado usando un 'buscar' parche pipeta de 8 a 10 MΩ resistencia y un pequeño diámetro de la punta. Con estas pipetas establecer un parche celular conectado 'suelta'. Fill la 'buscar' pipeta con una solución interna en la que K ⁺ se sustituye por Na ⁺ (Tabla 5) a fin de no despolarizar las neuronas durante la búsqueda de una célula presináptica.
      NOTA: La resistencia del sello 'suelta' no está en el rango GΩ pero por lo general alrededor de 30 a 300 MΩ.
   4. Sostenga el potencial de membrana bajo el sello 'suelta' a cerca de -30 a -60 mV en el modo de pinza de corriente. Luego, aplicar grandes impulsos de corriente (0,2-2 Na) para obtener un potencial de acción en la célula presináptica potencial. Observar este potencial de acción como un pequeño espiguilla en la respuesta de tensión.
   5. Ajuste la frecuencia de estimulación de 0,1 Hz para evitar la decadencia de una respuesta postsináptica. Use frecuencias de estimulación más bajas en caso de que el tejido cerebral es muy inmaduro o la conexión sináptica no muy fiable.
   6. En el caso de la neurona 'postsináptica' no responde a la estimulación de la neu 'presináptica' probadoron, parchar una nueva neurona en el modo de sello 'suelto'. No sustituya la 'búsqueda' electrodo parche siempre y cuando el sello con una resistencia de> 30 MΩ se establece. Pon a prueba hasta 30 neuronas presinápticas potencialmente de esta manera.
      NOTA: Para evitar daños en la neurona durante el procedimiento de búsqueda con patch clamp suelto, sólo suavemente de succión debe ser aplicado a la pipeta de búsqueda en comparación con el aplicado a la pipeta de parche de células enteras.
   7. Si la estimulación en los resultados de modo de sello 'sueltos' en un EPSP / IPSP con una latencia <5 ms en la neurona postsináptica retire la 'búsqueda' pipeta de la neurona presináptica.
   8. Vuelva a colocar la 'búsqueda' parche pipeta con un electrodo de parche lleno, solución interna periódica que contiene biocitina. Asegurar este parche pipeta de grabación tiene una resistencia de 4 - 8 MΩ; mayor será el tamaño soma menor es la resistencia del electrodo puede ser.
   9. Parche del presinápticaneurona y registro en su conjunto de células, modo de corriente-clamp. Provocar potenciales de acción por inyección de corriente en las neuronas presinápticas y registrar la respuesta postsináptica. Guarde los datos en un ordenador para su posterior análisis fuera de línea.
2. Conexiones neuronales con una alta conectividad
   NOTA: Para microcircuitos neuronales con una alta relación de conectividad (> 30%) utiliza un procedimiento diferente para encontrar conexiones sinápticas. Este procedimiento se describe a continuación y se utiliza a menudo para la conexión sináptica inhibitoria que tienen en promedio una proporción mayor que la conectividad conexiones excitatorias ^36. No debe ser utilizado cuando la relación de conectividad cae por debajo de este valor.
   1. Parche una neurona presináptica directamente en el modo de célula entera. Entonces, un parche en una potencial neurona postsináptica, también en el modo de célula completa. Tanto las células deben estar bajo el control de pinza de corriente. Suscitar un potencial de acción en la célula presináptica. Supervisar la neurona postsináptica prospectivo para un postsypotencial Naptic.
   2. En el caso de la neurona no muestra una respuesta a la estimulación presináptica, un parche en una neurona nueva en el modo de células enteras utilizando un electrodo de parche lleno de solución interna regular. Si se encuentra una conexión, no cambie el parche pipeta pero continuar con la grabación. A continuación, proceder como en el paso 3.1.9.
3. Conexiones neuronales a través de gap-uniones
   NOTA: Para buscar las conexiones eléctricas (brecha cruce) utilice el siguiente procedimiento, que es una versión modificada de la utilizada para conexiones de baja probabilidad.
   1. Parche una neurona postsináptica en la configuración de pinzamiento zonal de célula completa.
   2. Posteriormente, parchear una neurona presináptica putativo en la configuración de sellado suelto (baja resistencia de sellado de 30 a 300 MΩ) usando un 'buscar' parche pipeta de 7 - 10 de resistencia MΩ. Esta pipeta debe ser llenado con la solución interna modificada alta Na ⁺ para la estimulación de sellado suelto.
   3. Inject 100-300 ms largos impulsos de corriente hiperpolarizantes vía el sello 'suelta'; el potencial de comandos pipeta debe ajustarse a aproximadamente -60 a -70 mV. Observar una conexión brecha de la salida si esta estimulación se traduce en una pequeña respuesta hiperpolarizante en la neurona "post-sináptica '.
   4. Repachear la neurona 'presináptica' en el modo de célula entera y proceder como se describe anteriormente.
      NOTA: Para garantizar una buena tinción de los procesos axonales y dendríticos, utilice el protocolo dado a continuación. Este protocolo se describe en breve aquí, sin embargo, un protocolo detallado para el procesamiento de histoquímica utilizado en nuestro laboratorio se da en la Ref. ^37.

4. histoquímica Procesamiento

1. Transferir el corte de cerebro con el par de neuronas sinápticamente acoplados en un vial que contiene 4% de paraformaldehído disuelto en tampón fosfato 0,1 M y fijar la rebanada durante 24 horas. Por microscopía electrónica, fijar la rebanada utilizando 2,5% glutaraldehído y 1% de paraformaldehído.
2. Al día siguiente, transferir las rebanadas en tampón de fosfato normal que contiene ningún fijador. Lavar las rebanadas con tampón fosfato para 6 - 8 veces durante 10 - 15 minutos a cada uno para eliminar el exceso de fijador.
3. Incubar las rebanadas de 20 min en un 3% de H ₂ O ₂ solución en tampón de fosfato 0,1 M para minimizar la reacción de la peroxidasa endógena. Observar la formación de burbujas fuerte. Continuar el ataque hasta que no se produzcan más burbujas. Luego, enjuague las rodajas en tampón de fosfato 0,1 M de 6 - 8 veces (durante 10 minutos cada uno) para eliminar cualquier resto de H ₂ O _2.
4. Reacciones inmuno y cromogénicos
   La visualización de las neuronas biocitina lleno se basa en una reacción de peroxidasa de rábano-estreptavidina biotinilado catalizada con diaminobencidina; esto produce un precipitado oscuro que produce una mancha crujiente con una alta resolución espacial. Los siguientes procedimientos se usan para la reacción de cromógeno:
   1. Preparar la solución de ABC según el protocolo del fabricante. Añadir a 14,55 ml de tampón fosfato suplementado con 150 l 10% de Triton X100 (Tabla 6; sólo para microscopía de luz) y mantener la solución durante aproximadamente 30 min en la oscuridad. Incubar las rebanadas en esta solución O / N antes de su uso.
   2. Incubar las rebanadas en solución ABC en un agitador durante 1 hora a RT y en la oscuridad. Posteriormente, mantenga rebanadas O / N a 4 ° C en una nevera. A la mañana siguiente, incubar rebanadas a TA durante una hora adicional.
   3. Después de esto, enjuague rodajas de al menos cuatro veces durante 10 min cada uno en tampón de fosfato. A continuación, se incuba en un agitador durante aproximadamente 30 minutos en la oscuridad en 2 ml de una solución de 3,3 'diaminobencidina-níquel-intensificado (Tabla 7). Tenga mucho cuidado al manipular Diaminobencidina y utilizar sólo bajo la campana de humos; es extremadamente cancerígenos incluso a concentraciones muy bajas.
   4. Añadir 6,5 l 3% de H ₂ O ₂ a la que contiene Diaminobencidina-solución. Supervisar la reacción cromogénico bajo un microscopio de luz hasta que las neuronas teñidas de color marrón negro son claramente visibles. Entonces, detener la reacción inmediatamente lavando rebanadas varias veces en tampón de fosfato.
   5. Mount rebanadas con neuronas teñidas sobre adhesivo, Histobond silano recubierto o diapositivas de objetos estándar gelatinizados.
   6. Mantenga los portaobjetos en una cámara húmeda con al menos un 80% de humedad O / N. Al día siguiente, dejar que las rodajas de aire seco durante otros 10 min. Antes de la incorporación, transferencia de diapositivas en soluciones con concentraciones crecientes de etanol (20 - 100%) con el fin de deshidratar ellos.
      NOTA: El proceso de deshidratación debe ser lento de lo contrario las distorsiones en los procesos dendríticas y axonales es probable que ocurran ^37. Si se elige un procedimiento de incorporación alternativa, por ejemplo, uno con el Moviol basado en glicerol, no se requiere una deshidratación; sin embargo esto es probable que resulte en una compresión homogénea de la rebanada y por lo tanto un morpholo neuronal distorsionadagía.
   7. Por último, se incuban durante 10 minutos en xilol, incrustar las rodajas en un medio de inclusión hidrofóbico para microscopía de luz y coloque un ultra-delgadas cubreobjetos en la parte superior. Deje secar los portaobjetos durante 20 min a RT.

5. Neuronal Reconstrucción y Synaptic Contacto Localización

1. Examinar los portaobjetos con las neuronas biocitina marcado bajo un microscopio de luz equipado con un objetivo 60X / 100X de inmersión en aceite y un condensador con una alta apertura numérica de resolución espacial óptima. Asegúrese de que boutons axonal y espinas dendríticas son claramente visibles.
2. Trazar neuronas o pares de neuronas sinápticamente acoplados utilizando una neurona comercial sistema de seguimiento (ver Tabla de Materiales Específicos / Equipo) para obtener reconstrucciones 3D neuronales. Llevar a cabo el seguimiento manualmente bajo inspección visual constante para detectar incluso pequeños axonal o colaterales dendríticas. Para grabaciones pareadas de neuronas sinápticamente junto trazado manual sigue siendo el método deelección porque la atribución de, por ejemplo, un perfil axonal ya sea a la neurona pre o post-sináptica requiere experiencia sustancial reconstrucción.
3. Si es necesario, hacer el recuento de boutons axonales y / o espinas dendríticas. Debido espinas o incluso subtipos de la columna vertebral y boutons axonales pueden presentar una distribución y la densidad específica con respecto a, por ejemplo, la capa cortical o área, esto podría ayudar a caracterizar tipos de células neuronales.
4. Para los pares de neuronas sinápticamente acoplados, comprobar el axón y dendritas postsinápticos presináptica de yuxtaposiciones con el máximo aumento disponible. Observar una Bouton axonal y una espina dendrítica postsináptica o el eje está en el mismo plano focal puede ser considerado como un contacto sináptico putativo. Marque este contacto en la reconstrucción.
5. Corrija las reconstrucciones neuronales para la contracción en las tres dimensiones espaciales en la sección correspondiente del programa de seguimiento.
   NOTA: Durante la fijación, el procesamiento histoquímicay la deshidratación deformación mecánica sustancial y la contracción se producen; esto afectará a las mediciones de longitud axonales y dendríticas y distorsionar gravemente su disposición espacial. Los factores de corrección de contracción para el medio de inclusión son ~ 1.1 para direcciones x e y e ~ 2.1 para la dirección z ^37.
6. Para un análisis morfológico cuantitativo utilizar un programa de análisis de datos para la neurofisiología (véase la Tabla de Materiales Específicos / Equipo).

Resultados

Grabaciones vinculados son el método de elección para una caracterización en profundidad de las conexiones sinápticas uni o bidireccionales morfológicamente identificados, así como las uniones comunicantes conexiones (eléctricas) (Figura 1). Un ejemplo de una grabación emparejado en la capa 4 de la corteza somatosensorial barril se muestra en la Figura 1A. Tanto excitador unidireccional y conexiones sinápticas inhibitorias pueden ser caracterizadas (Figura 1B, C).

Discusión

Grabaciones apareadas de excitatorio sinápticamente acoplado y / o las neuronas inhibidoras son un enfoque muy versátil para el estudio de microcircuitos neuronales. No sólo este enfoque permite a uno estimar la conectividad sináptica entre tipos de neuronas sino que también permite la determinación de las características funcionales de la conexión y la morfología de las neuronas pre y postsinápticos. Además, agonista y / o antagonista pueden ser fácilmente aplicadas a las neuronas en las preparaciones reban...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA	EPC 10 USB Triple	with 2 - 3 preamplifiers
Microscope	Olympus	BX51WI	with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective
Camera	TILL Photonics	VX55	infrared CCD camera
Workstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5	x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers
Faraday cage	Luigs & Neumann
Anti-vibration table	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
Microtome	Microm International	HM650V
Micropipette puller	HEKA	Sutter P-97
Neurolucida system	Microbrightfield		with Neurolucida and Neuroexplorer softwares