אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

השילוב של הקלטות מהדק תיקון משני (או יותר) נוירונים בשילוב synaptically (הקלטות לזווג) בהכנות פרוסה מוח חריפות עם מילוי biocytin תאיים בו זמנית מאפשר ניתוח מתואם של התכונות המבניות והתפקודיות שלהם. בשיטה זו אפשר לזהות ולאפיין את שני נוירונים טרום postsynaptic על ידי המורפולוגיה שלהם ודפוס תגובת אלקטרו. הקלטות לזווג מאפשרות ללמוד את דפוסי הקישוריות בין תאי העצב האלה, כמו גם את המאפיינים של שני שידור סינפטי הכימי וחשמלי. הנה, אנחנו נותנים תיאור צעד-אחר-צעד של ההליכים הנדרשים להשגת הקלטות לזווג אמינות יחד עם התאוששות אופטימלית של מורפולוגיה תא העצב. אנו מתארים כיצד זוגות של הנוירונים המחוברים דרך סינפסות כימיות או צמתים פער מזוהים בהכנות פרוסה מוח. אנו מתארים כיצד תאי עצב משוחזרים להשיג מורפולוגיה 3D של dendritic ותחום axonal ואיך הסינפטי קשר מזוהה ומקומי. נדונו גם באזהרות ומגבלות של טכניקת ההקלטה לזווג, בפרט אלה הקשורים לtruncations הדנדריטים וaxonal במהלך תקופת ההכנה של פרוסות המוח כי אלה חזקים משפיעים הערכות קישוריות. עם זאת, בגלל הרבגוניות של גישת ההקלטה לזווג הוא יישאר כלי רב ערך באפיון היבטים שונים של העברת הסינפטית בשבבים עצביים מזוהים במוח.

Introduction

שבבים עצביים בין שני תאי עצב בשילוב synaptically הם אבני הבניין של רשתות בקנה מידה גדולה במוח והם היחידות הבסיסיות של עיבוד מידע הסינפטי. תנאי מוקדם לאפיון של שבבים עצביים כזו הוא לדעת את המורפולוגיה ותכונות פונקציונליות של שני נוירונים השותף טרום postsynaptic, הסוג של החיבור הסינפטי (ים) ואת המבנה שלה ומנגנון תפקודי. עם זאת, במחקרים רבים של קשרים סינפטיים לפחות אחד מתאי העצב בmicrocircuit אינו מאופיין היטב. זה נובע מפרוטוקולי הגירוי יחסית הנוקבים המשמשים לעתים קרובות במחקרים של קישוריות הסינפטי. לכן, התכונות המבניות ותפקודיות של נוירון presynaptic הם גם לא זיהו כלל או רק במידה קטנה למדי (כלומר, הביטוי של חלבוני סמן וכו '). הקלטות מותאמים בשילוב עם מכתים תאיים על ידי סמנים שלuch כמו biocytin, Neurobiotin או צבעי ניאון מתאים יותר ללימוד שבבים עצביים קטנים. טכניקה זו מאפשרת לחקור פרמטרים רבים מבניים ותפקודיים של חיבור הסינפטי זיהה מורפולוגית באותו הזמן.

מה שנקרא חיבורים 'אחידים' monosynaptic בין שני תאי עצב נחקרו בשני אזורים במוח בקליפת המוח וקורטיקליים ^1-10 באמצעות הכנות פרוסה חריפות. בתחילה, microelectrodes החדה שימשה בניסויים אלה; מאוחר יותר, הקלטת מהדק התיקון הועסקה כדי להשיג הקלטות של אותות הסינפטי עם רמת רעש נמוכה ורזולוציה של זמן השתפרה.

מראש טכניים משמעותיים היה השימוש בניגוד להפרעות ההפרש אינפרא אדום (IR-DIC) אופטיקה ^11-14, טכניקה מיקרוסקופית ששיפרה באופן משמעותי את הנראות וזיהוי של תאי עצב במוח הפרוסה כך שהוא הפך t האפשריo להשיג הקלטות מקשרים סינפטיים מזוהים מבחינה ויזואלית ^15-17. באופן כללי, הקלטות לזווג נעשות בהכנות פרוסה חריפות; רק מעט מאוד פרסומי הקלטות דיווח זמינות מהנוירונים מחוברים synaptically in vivo ^18-20.

היתרון החשוב ביותר של הקלטות לזווג הוא העובדה שאפיון פונקציונלי יכול להיות משולב עם ניתוח מורפולוגי בשני האור ורמה מיקרוסקופית אלקטרונים (ראה, למשל., ^7,16,21). לאחר עיבוד histochemical, המורפולוגיה הדנדריטים וaxonal של זוג נוירון מחובר synaptically היא לייחס. בהמשך לכך, ניתן לכמת תכונות מורפולוגיות כגון אורך, צפיפות מרחבית, אורינטציה, הסתעפות דפוס וכו 'פרמטרים אלה עשויים לאחר מכן לספק בסיס לסיווג אובייקטיבי של קשר הסינפטי ספציפי. יתר על כן, בניגוד לרוב הטכניקות אחרות המשמשות ללימוד connecti העצביהקלטות vity, לזווג גם לאפשר זיהוי של קשרים סינפטיים לקשרים סינפטיים יחידתי. ניתן לעשות זאת ישירות באמצעות שילוב של אור ומיקרוסקופ אלקטרונים ^16,21-27 או באמצעות ההדמיה סידן ^28,29 של קוצים הדנדריטים. עם זאת, עם הגישה השנייה רק ​​מעורר אבל ניתן ללמוד לא קשרים מעכבים כפי שהוא דורש זרימת סידן באמצעות ערוצי קולט postsynaptic.

בנוסף לניתוח מפורט של העברת הסינפטית בהקלטות microcircuit לזווג עצביות מוגדרות גם לאפשר המחקר של כללי פלסטיות הסינפטית ^30,31 או - בשילוב עם יישום אגוניסט / אנטגוניסט - האפנון של שידור סינפטי על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון אצטילכולין ³² ואדנוזין ^33.

Protocol

כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם להוראה של האיחוד האירופי להגנה על בעלי חיים, בעלי החיים הגרמנים הרווחה Act (Tierschutzgesetz) וההנחיות של האיגוד אירופאי בעלי חיים במעבדת מדע האגודה.

1. סט-אפ לאלקטרופיזיולוגיה

לפני תחילת הקלטה לזווג, הגדרת אלקטרופיזיולוגיה צריכה להיות בנויה. בקצרה כיצד הגדרה כזו מורכבת היא כדלקמן:

1. התקן שולחן נגד רעידות שבמיקרוסקופ, מניפולטורים וכל הציוד האחר יוצבו.
   הערה: רטט או כל סוג של תנועה אחרת צריך להיות קטן ככל האפשר בעת הקלטה מקשרים סינפטיים, כי זה דורש שינוי של טפטפות (חיפוש אלקטרודה הוחלף על ידי אלקטרודה הקלטה).
2. מניחים כלוב פאראדיי סביב השולחן נגד הרעידות כדי להפחית את הרעש חשמלי. לחבר את כל הציוד בתוך ca פאראדייge עם הקרקע החשמלית.
3. התקן מיקרוסקופ עם ציר מוקד ממונע המבוסס על שולחן XY ממונע על השולחן נגד הרעידות על פי הנחיות היצרן. זה מאפשר לנוע באופן מהימן את המיקרוסקופ לנוירונים שאינם באותו שדה הראייה כפי שהוא במקרה של חיבורי translaminar בהניאוקורטקס.
4. התקן מצלמת וידאו על יציאת המצלמה של המיקרוסקופ ולחבר אותו לאנלוגיים ודיגיטליים או מסכי / לצפות בהכנת פרוסה והתנועה של אלקטרודות. השתמש במצלמה, שניתן להעביר בין נמוך והגדלת הספק גבוה כדי להשיג סקירה ותמונת תקריב, בהתאמה, של צמד תאים העצבי בשילוב synaptically. זה גם עוזר לשלוט על התנועה של אלקטרודות התיקון.
5. התקן שולחן דגימה המכיל הבלעה לחדר האמבטיה (נקדח בבית מהבלוק פרספקס) להכנת פרוסה המוח. שולחן דגימה זה לא חייב להיות מחובר למיקרוסקופ, כלומר, חייב להיות קבוע לשולחן האוויר ומיקרוסקופ צריך להיות יכולת תמרון מתחתיה.
6. הר שני (או יותר אם נדרש) micromanipulators דיוק גבוה שניתן להעביר בכל שלושת הממדים. להתקין תיקון מהדק קדם מגבר על מניפולטורים ולחבר אותם למגבר הראשי.
   הערה: אם ניתן להתקין מניפולטורים נוספים הנדרשים לדוגמה, יותר משני מגברים מראש, אלקטרודות גירוי תאיים, מערכות להולכת תרופות, וכו '
7. מניחים את חדר האמבטיה בטבלת הדגימה. התקן כניסה ויציאת פתרון ולחבר אותם למערכת זלוף.
8. השתמש במשאבת peristaltic לשמור זלוף של חדר ההקלטה עם נוזל השדרתי מלאכותי (ACSF; טבלת 1) בקצב זרימה יציב של 4-6 מיליליטר / דקה לכדאיות פרוסה אופטימלית.
   הערה: אל תחרוג קצב זרימה זה כמשמעותי זה יגרום למערבולת בASCF ולכן תנועה של הפרוסה.
9. התקן בעלים לבדיקת הטמפרטורה ואלקטרודה קרקע Ag / AgCl על שולחן הדגימה. זה הכרחי כדי לאפשר הבדיקה ואלקטרודה כדי לדגום את האמבטיה בחדר.
10. לנראות טובות של נוירונים בהכנת פרוסה להשתמש תאורת אינפרא אדום במיקרוסקופ. הפעולה זו מפחיתה את עקיפת אור ולכן טשטוש תמונה. ודא שמיקרוסקופ מצויד באופטיקה התערבות ההפרש לעומת זאת כדי להשיג "הדמיה כמו-3D'. זה יעזור לי תיקון תאי עצב ומאפשר מיקוד נוירונים עמוקים בפרוסה (60 מיקרומטר או עמוק יותר).
11. במהלך הניסוי, לשמור על פרוסות מוח בתא ניסוי עם coverslip זכוכית בתחתית. הנח 'נבל פלטינה' בחלק העליון של הפרוסה לפרוסות למנוע מצפים. נבל פלטינה עשוי בצורת U חוט פלטינה שטוחה, עם מחרוזות של חוט דנטלי מודבקות על גבי זה.
12. שמור ACSF מרוסס הפרוסה בטמפרטורה של 32 - C ° 35 כדי להבטיח optשליטת imal של חמצון וpH. ניתן לעשות זאת על ידי חימום הפתרון עם מכשיר פלטייה המותקן קרוב לזרם ACSF לתוך תא האמבטיה.
    הערה: כיסוי דק במיוחד שימוש מחליק כך שגם מעבי מיקרוסקופ עם צמצם מספרי גבוה ומרחק עבודה קצר יכולים להיות ממוקדים בדגימה. זה הכרחי לתאורה אופטימלית של הפרוסה.
    לתמונה ותיאור של הגדרת אלקטרופיזיולוגיה מותאמת להקלטות לזווג בהכנת פרוסה המוח ראה איור 4 בRef. ^34.

2. מוח Slice הכנה

1. במתינות להרדים את החיה שממנה רקמת המוח צריך לקחת עם isoflurane (ריכוז סופי <0.1%).
   הערה: ניתן להשתמש גם הרדמה אחרות. שימוש בהרדמה צריכה לעמוד בהמלצות הוועדה בבעלי החיים המתאימות וכללים. ודא תמיד שבעלי החיים הוא לא מגורה או תחת לחץ לאחר הוספהההרדמה.
2. לערוף את החיה, לפתוח את הגולגולת ולהסיר את המוח במהירות אפשרית באמצעות ההליך המתואר בשופטים. ^34,35.
3. העבר את המוח לנוזל מקורר (4 מעלות צלזיוס) מלאכותי השדרה מוגזים בתערובת של גז carbogen עם 95% O _2, 5% CO _2.
4. לבודד את האזור במוח שיש ללמוד.
   הערה: הפרמטרים להשגת שימור אופטימלי ועיצור מינימאלי של דנדריטים והאקסונים של תאי עצב טרום postsynaptic צריכה להיקבע מראש עבור כל חיבור עצבי ושלב ההתפתחותי תחת חקירה. בפרוסת מוח גזור בצורה אופטימלית, האקסון של הנוירון presynaptic אינו נדרש להיות מקביל למשטח הפרוסה. במקום זאת, הם צריכים להצביע לפרוסות עם זווית רדודה. חל על דנדריט פסגת פירמידה של נוירונים postsynaptic; זה צריך להיבדק תחת מיקרוסקופ האור. הדבר חשוב במיוחד עבור המים שאינם מקומי או tקשרים סינפטיים ranslaminar, כלומר., שבו somata טרום postsynaptic יותר מ -200 מיקרומטר לגזרים והסתברות truncations הדנדריטים וaxonal עשויה להיות גבוה יותר באופן משמעותי מאשר לחיבורים מקומיים.
5. העבר את המוח לתא microtome. בהתבסס על ממצאים אמפיריים, פתרונות חיתוך תאי שונים משמשים בהתאם לגילו של בעל החיים (ראה לוחות 2 ו -3; ניתן למצוא גם מידע מועיל תחת 'http://www.brainslicemethods.com/').
6. חתוך את המוח עד אזור היעד הוא גלוי.
7. כדי לקבל פרוסות עם נראות תא טובות, לחתוך 300 - פרוסות מוח עבות מיקרומטר 400 אם בעל החיים בוגר (> 3 שבועות). אם בעל החיים הוא לא בוגר ^(st 1 עד 2 ^nd שבוע לעכברים וחולדות לאחר לידה) פרוסות ניתן לחתוך עד עובי של ~ 600-800 מיקרומטר ללא visib תא באופן משמעותי פוגע בility.
   הערה: זה ישפר את היציבות של פרוסות 'בשלה' ולצמצם את מספר truncations האפשרי של הדנדריטים ארוך טווח ובטחונות axonal.
8. העבר את הפרוסות מתא microtome לתא דגירה מלאות פתרון חיתוך מוגזים בתערובת של 95% O _2, 5% CO _2. שמור את הפרוסות בתא הדגירה במשך שעה לפחות 30 דקות עד 1 או ב RT או ב ~ 30 ° C, בהתאם לסוג של ניסוי.

3. מותאמת Patch-קלאמפ הקלטה ומילוי Biocytin

בהתאם לסוג של חיבור הסינפטי שלוש גישות שונות משמשות לאיתור תאי עצב בשילוב synaptically. אם הסתברות החיבור היא נמוכה (כפי שניתן לצפות לחיבורים מעוררים ביותר), פעל באופן הבא:

1. קשרים עצביים עם קישוריות נמוכה
   1. מלא את pipettes התיקון עם פתרון פנימי של הרכב הרשוםבלוח 4 לכל ההקלטות בתצורה כל התא להוסיף biocytin בריכוזים בין 3 -. 5 מ"ג / מיליליטר לפתרון הפנימי (פיפטה) כדי להשיג תוצאות טובות לצביעת תאי העצב טרום postsynaptic. בואו biocytin מפוזר לתוך התא לפחות 15 - 30 דקות (תלוי בגודל של תא העצב).
      הערה: אל תוסיף biocytin לפתרון בשימוש בטפטפות 'חיפוש' שהוזכר להלן.
   2. תיקון תא עצב פוסט-סינפטי המשוערת במצב כל התא. השתמש בטפטפות תיקון עם שוק ארוך ודק. זה מקל על התמרון של פיפטה תחת המטרה ומפחית חפצי תנועה שעלולה להתרחש כאשר האלקטרודה הוא הציג בפרוסה.
   3. לאחר מכן, תיקון נוירון presynaptic פוטנציאלי בתצורה המצורפת תא באמצעות פיפטה 'חיפוש' תיקון של 8 - 10 התנגדות MΩ וקוטר טיפ קטן. עם טפטפות אלה להקים תיקון מצורף תא "חופשי". Fill פיפטה 'החיפוש' עם פתרון פנימי שבי K ⁺ הוא הוחלף על ידי Na ⁺ (לוח 5) על מנת שלא depolarize נוירונים במהלך חיפוש אחר תא presynaptic.
      הערה: התנגדות החותם "חופשית" היא לא בטווח GΩ אבל בדרך כלל סביב 30-300 MΩ.
   4. החזק את פוטנציאל הממברנה תחת החותם "החופשי" לכ -30 ל -60 mV במצב מהדק נוכחי. לאחר מכן, החל פולסים נוכחי גדול (0.2-2 Na) כדי לעורר פוטנציאל פעולה בתא presynaptic הפוטנציאלי. שים לב פוטנציאל פעולה זו כspikelet קטן בתגובת המתח.
   5. הגדר את תדירות גירוי 0.1 הרץ כדי למנוע מוזנח של תגובת פוסט-סינפטי. שימוש בתדרי גירוי נמוכים יותר במקרה רקמת המוח היא מאוד לא בוגרת או החיבור הסינפטי לא מאוד אמינה.
   6. במקרה נוירון "postsynaptic 'אינו מגיב לגירוי של neu' presynaptic 'נבדקרון, תיקון נוירון חדש במצב חותם "חופשי". אינו מחליף את האלקטרודה תיקון 'חיפוש' כל עוד את החותם עם התנגדות של> 30 MΩ היא הוקמה. לבדוק עד 30 נוירונים פוטנציאל presynaptic בדרך זו.
      הערה: כדי למנוע נזק לתאי העצב במהלך חיפוש ההליך עם מהדק תיקון רופף, רק בעדינות יניקה צריכה להיות מוחלת על חיפוש פיפטה לעומת שחל על פיפטה התיקון כל התא.
   7. אם גירוי בתוצאות "חופשיות" מצב החותם בEPSP / IPSP עם חביון <5 אלפית שני בנוירון postsynaptic להסיר את פיפטה 'חיפוש' מתא עצב presynaptic.
   8. החלף את פיפטה 'חיפוש' התיקון עם אלקטרודה תיקון מלא פתרון פנימי המכיל biocytin, רגיל. ודא פיפטה תיקון הקלטה זו יש התנגדות של 4-8 MΩ; גדול יותר גודל סומה נמוך התנגדות האלקטרודה יכולה להיות.
   9. תיקון presynapticנוירון ולהקליט בכל התא, במצב נוכחי מהדק. לעורר פוטנציאל פעולה על ידי הזרקה נוכחית בתאי עצב presynaptic ולהקליט את תגובת postsynaptic. לאחסן את הנתונים במחשב לניתוח מאוחר יותר off-line.
2. קשרים עצביים עם קישוריות גבוהה
   הערה: לשבבים עצביים עם יחס גבוה קישוריות (> 30%) להשתמש בהליך שונה כדי למצוא קשרים סינפטיים. הליך זה מפורט להלן ומשמש לעתים קרובות לחיבור מעכב הסינפטי שיש לי בממוצע יחס קישוריות גבוהה יותר מחיבורים מעוררים ^36. אין להשתמש בזה כאשר יחס הקישוריות נופל מתחת לערך זה.
   1. תיקון תא עצב presynaptic ישירות במצב כל התא. לאחר מכן, תיקון נוירון postsynaptic פוטנציאלי, גם במצב תא כולו. שני התאים צריכים להיות בשליטת מהדק הנוכחית. לעורר פוטנציאל פעולה בתא presynaptic. צג נוירון postsynaptic הפוטנציאלי לpostsyפוטנציאל naptic.
   2. במקרה נוירון לא מראה תגובה לגירוי presynaptic, תיקון נוירון חדש במצב כל התא באמצעות אלקטרודה תיקון מלאה פתרון פנימי קבוע. אם חיבור נמצא, אינו משנה את פיפטה התיקון אך להמשיך בהקלטה. לאחר מכן, להמשיך כמו בשלב 3.1.9.
3. קשרים עצביים באמצעות פער-צמתים
   הערה: כדי לחפש את חיבורי חשמל (פער צומת) השתמש בהליך הבא שהוא גרסה שונה של זה המשמש לחיבורי הסתברות נמוכה.
   1. תיקון תא עצב פוסט-סינפטי בתצורת מהדק תיקון כל התא.
   2. בהמשך לכך, תיקון נוירון משוער presynaptic בתצורה הרופף החותם (התנגדות חותם נמוכה של 30-300 MΩ) בעזרת פיפטה 'חיפוש' תיקון של 7-10 התנגדות MΩ. פיפטה זה צריכה להיות מלא עם הפתרון שונה הגבוה Na ⁺ הפנימי לגירוי רופף-חותם.
   3. Inject 100-300 msec פולסים נוכחי hyperpolarizing ארוכה באמצעות החותם "החופשי"; פוטנציאל פקודת פיפטה צריך להיות מוגדר על -60 ל-70 mV. שים לב חיבור צומת פער אם תוצאות גירוי זה בתגובת hyperpolarizing קטנה בנוירון "postsynaptic '.
   4. Repatch נוירון "presynaptic 'במצב כל התא ולהמשיך כפי שתואר לעיל.
      הערה: כדי להבטיח מכתים טוב של תהליכי axonal והדנדריטים, משתמשת בפרוטוקול כדלקמן. פרוטוקול זה מתואר בקצרה כאן, לעומת זאת, פרוטוקול מפורט לעיבוד histochemical משמש במעבדה שלנו ניתן בRef. ^37.

4. histochemical עיבוד

1. להעביר את פרוסת המוח עם הזוג של נוירונים בשילוב synaptically לתוך בקבוקון המכיל paraformaldehyde 4% מומסים בחיץ פוספט 0.1 M ולקבע את הפרוסה למשך 24 שעות. למיקרוסקופ אלקטרונים, לקבע את הפרוסה באמצעות glutar 2.5%אלדהיד וparaformaldehyde 1%.
2. ביום שלמחרת, להעביר את הפרוסות לחיץ פוספט רגיל המכיל לא מקבע. לשטוף פרוסות עם חיץ פוספט ל6-8 פעמים במשך 10 - 15 דקות כל אחד כדי להסיר מקבע עודף.
3. דגירה פרוסות במשך 20 דקות בH 3% ₂ O ₂ פתרון במאגר M 0.1 פוספט כדי למזער את תגובת peroxidase אנדוגני. שים לב היווצרות בועה חזקה. המשך התגובה עד אין בועות נוספות מיוצרות. לאחר מכן, יש לשטוף את הפרוסות בחיץ פוספט 0.1 M ל6-8 פעמים (10 דקות כל אחד) כדי להסיר כל שנותר H ₂ O _2.
4. תגובות Immunocytochemical וchromogenic
   הדמיה של נוירונים מלאים biocytin מבוססת על תגובת peroxidase חזרת streptavidin-biotinylated זרז עם diaminobenzidine; זה מייצר משקע כהה שמייצר כתם פריך עם רזולוציה מרחבית גבוהה. הנהלים הבאים משמשים לתגובת chromogenic:
   1. הכן את פתרון ABC לפי הפרוטוקול של הייצור. הוסף לחיץ פוספט 14.55 מיליליטר בתוספת 150 μl 10% Triton X100 (לוח 6; רק למיקרוסקופ אור) ולשמור את הפתרון לכ -30 דקות בחושך. דגירה פרוסות בO פתרון זה / N לפני השימוש.
   2. דגירה פרוסות בפתרון ABC על שייקר לשעה 1 בRT ובחושך. כתוצאה מכך, לשמור על פרוסות O / N ב 4 ° C במקרר. בבוקר שלמחרת, דגירה פרוסות בRT במשך שעה נוספת.
   3. אחרי זה, לשטוף פרוסות לפחות ארבע פעמים במשך 10 דקות כל אחד בחיץ פוספט. ואז, דגירה על שייקר במשך כ -30 דקות בחושך ב 2 מיליליטר של פתרון-התעצם ניקל 3-3'-diaminobenzidine (לוח 7). להיות זהיר מאוד בעת טיפול diaminobenzidine ולהשתמש רק מתחת למכסת מנוע קטר; זה מאוד מסרטנים גם בריכוזים נמוכים מאוד.
   4. להוסיף 6.5 μl 3% H ₂ O ₂ הלמכיל diaminobenzidineפתרון. לפקח על תגובת chromogenic תחת מיקרוסקופ אור עד נוירונים מוכתמים בצבע חום-שחורים נראים בבירור. לאחר מכן, לעצור את התגובה באופן מיידי על ידי שטיפת פרוסות מספר פעמים בחיץ פוספט.
   5. פרוסות הר עם נוירונים מוכתמים בדבק, Histobond מצופה silane או שקופיות אובייקט סטנדרטיים gelatinized.
   6. שמור את השקופיות בתא לח עם לפחות 80% O לחות / N. ביום המחרת, בואו פרוסות אוויר-יבשה לעוד 10 דקות. לפני ההטבעה, מגלשות העברה בפתרונות עם ריכוזים גוברים של אתנול (20 - 100%) על מנת ליבש אותם.
      הערה: תהליך ההתייבשות צריך להיות איטי אחרת עיוותים בתהליכים דנדריטיים וaxonal צפויות להופיע ^37. אם הליך הטבעה חלופי נבחר, למשל, אחד עם Moviol מבוסס גליצרול, התייבשות אינה נדרשת; אולם זה עשוי לגרום לדחיסת הומוגניות של הפרוסה ולכן morpholo עצבי מעוותGY.
   7. לבסוף, דגירה של 10 דקות בxylol, להטביע את הפרוסות במדיום הטבעה הידרופובי למיקרוסקופ אור ולמקם את coverslips דק על גבי. בואו שקופיות להתייבש במשך 20 דקות ב RT.

לוקליזציה 5. עצבי השיקום וSynaptic לתקשר

1. בדוק שקופיות עם הנוירונים שכותרתו biocytin תחת מיקרוסקופ אור מצוידת מטרת טבילת שמן 60x / 100X וקבל עם צמצם מספרי גבוה לרזולוציה מרחבית אופטימלית. ודא שboutons axonal וקוצים הדנדריטים גלויים לעין.
2. עקוב אחר תאי עצב או זוגות נוירון בשילוב synaptically באמצעות נוירון מסחרי התחקות מערכת (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי) כדי להשיג שחזורים עצביים 3D. לבצע מעקב באופן ידני תחת בדיקה ויזואלית קבועה כדי לזהות axonal אפילו קטן או בטחונות דנדריטים. להקלטות לזווג מתאי עצב בשילוב synaptically מעקב ידני הוא עדיין השיטה שלברירה כי הייחוס לדוגמא, פרופיל axonal לאו נוירון מראש או postsynaptic דורש ניסיון שיקום משמעותי.
3. במידת הצורך, לבצע ספירה של boutons axonal ו / או קוצים הדנדריטים. בגלל קוצים או אפילו תת עמוד השדרה וboutons axonal עשויים להפגין הפצה וצפיפות מסוימות ביחס לדוגמה, שכבת קליפת המוח או באזור, זה יכול לעזור לאפיין סוגים עצביים תא.
4. לזוגות נוירון בשילוב synaptically, לבדוק את האקסון presynaptic ודנדריטים postsynaptic קרוב appositions בהגדלה הגבוהה ביותר הקיימת. שים לב אוטון axonal ועמוד השדרה דנדריטים postsynaptic או פיר הוא באותו מישור המוקד יכול להיחשב כאיש קשר הסינפטי משוער. סמן איש קשר זה בשיקום.
5. תקן את השחזורים עצביים להתכווצות בכל שלושת הממדים מרחביים בסעיף המתאים של תכנית המעקב.
   הערה: במהלך קיבעון עיבוד, histochemicalומתרחשים עיוות ההתייבשות משמעותית מכאנית והצטמקות; זה ישפיע על מדידות אורך axonal והדנדריטים וקשים לעוות הסידור המרחבי שלהם. גורמי תיקון הצטמקות למדיום ההטבעה הם ~ 1.1 x ולכיווני y ו~ 2.1 לz-הכיוון ^37.
6. לניתוח מורפולוגי כמותית להשתמש בתכנית ניתוח נתונים לנוירופיזיולוגיה (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי).

תוצאות

הקלטות לזווג הן את שיטת הבחירה לאפיון מעמיק של קשרים סינפטיים חד-או דו כיוונית זיהו מורפולוגית כמו גם צומת פער חיבורים (חשמל) (איור 1). דוגמא של הקלטה לזווג בשכבת 4 של קליפת החבית החושית מוצגת באיור 1 א. שניהם מעורר חד-כיווני וקשרים סינפטיים מעכבים ניתן...

Discussion

הקלטות לזווג ממעורר בשילוב synaptically ו / או נוירונים מעכבים הן גישה מאוד תכליתית ללימוד שבבים עצביים. לא רק בגישה זו אינה מאפשרת אחד כדי להעריך קישוריות הסינפטי בין סוגי תאי עצב, אלא גם מאפשרת קביעת המאפיינים הפונקציונליים של החיבור והמורפולוגיה של תאי עצב טרום postsynaptic. ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA	EPC 10 USB Triple	with 2 - 3 preamplifiers
Microscope	Olympus	BX51WI	with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective
Camera	TILL Photonics	VX55	infrared CCD camera
Workstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5	x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers
Faraday cage	Luigs & Neumann
Anti-vibration table	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
Microtome	Microm International	HM650V
Micropipette puller	HEKA	Sutter P-97
Neurolucida system	Microbrightfield		with Neurolucida and Neuroexplorer softwares