Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

Résumé

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Résumé

La combinaison d'enregistrements patch clamp de deux (ou plus) des synapses des neurones couplés (enregistrements appariés) dans aiguës préparations de tranches de cerveau avec remplissage simultané de la biocytine intracellulaire permet une analyse corrélée de leurs propriétés structurales et fonctionnelles. Avec cette méthode, il est possible d'identifier et de caractériser les neurones pré- et post-synaptiques par leur morphologie et leur profil de réponse électrophysiologique. Enregistrements appariés permettent l'étude des modes de connectivité entre ces neurones ainsi que les propriétés à la fois la transmission synaptique chimique et électrique. Ici, nous donnons une description étape par étape des procédures requises pour obtenir des enregistrements appariés fiables avec une récupération optimale de la morphologie des neurones. Nous allons décrire comment paires de neurones connectés via les synapses chimiques ou de jonctions lacunaires sont identifiés dans les préparations de tranches de cerveau. Nous allons exposer comment les neurones sont reconstruits pour obtenir leur morphologie 3D de la Dendritic et le domaine axonale et comment contacts synaptique sont identifiés et localisés. Nous discuterons également les mises en garde et les limites de la technique d'enregistrement couplé, en particulier ceux associés à troncatures dendritiques et axonales lors de la préparation des tranches de cerveau parce que ces affectent fortement les estimations de connectivité. Toutefois, en raison de la polyvalence de l'approche d'enregistrement jumelé il restera un outil précieux pour caractériser les différents aspects de la transmission synaptique au microcircuits neuronaux identifiés dans le cerveau.

Introduction

Microcircuits neuronaux entre deux neurones synaptiquement couplés sont les blocs de construction de réseaux à grande échelle dans le cerveau et sont les unités fondamentales de synaptique traitement de l'information. Une condition préalable pour la caractérisation de ces microcircuits neuronaux est de connaître la morphologie et les propriétés fonctionnelles des deux partenaires neurones pré- et post-synaptiques, le type de la connexion synaptique (s) et sa structure et son mécanisme fonctionnel. Cependant, dans de nombreuses études de connexions synaptiques au moins l'un des neurones dans un microcircuit ne est pas bien caractérisé. Il en résulte des protocoles de stimulation relativement non spécifiques souvent utilisées dans les études de la connectivité synaptique. Par conséquent, les propriétés structurelles et fonctionnelles du neurone présynaptique sont identifiées soit pas du tout ou seulement dans une mesure relativement faible (par exemple, l'expression des protéines marqueurs, etc.). Enregistrements appariés en combinaison avec coloration intracellulaire de marqueurs sUCH que biocytine, neurobiotin ou colorants fluorescents sont mieux adaptés pour l'étude de petites microcircuits neuronaux. Cette technique permet d'enquêter sur de nombreux paramètres structurels et fonctionnels d'une connexion synaptique identifiée morphologiquement en même temps.

Les soi-disant connexions monosynaptiques «unitaire» entre deux neurones ont été étudiés dans les deux régions corticales et sous-corticales du cerveau ^1-10 utilisant des préparations de tranche aigus. Initialement, microélectrodes tranchants ont été utilisés dans ces expériences; plus tard, l'enregistrement patch clamp a été utilisée pour obtenir des enregistrements de signaux synaptiques avec un niveau de bruit inférieur et une résolution temporelle améliorée.

Un progrès technique important est l'utilisation de contraste d'interférence différentiel à infrarouges (IR-DIC) ^14.11 optique, une technique microscopique qui améliore considérablement la visibilité et l'identification des neurones dans la tranche de cerveau de sorte qu'il devient possible to obtenir des enregistrements de connexions synaptiques identifiés visuellement ^15-17. En général, les enregistrements appariés sont effectuées dans des préparations de tranche aigus; que très peu de publications sont disponibles enregistrements de rapports de neurones reliés par des synapses in vivo ^18-20.

L'avantage le plus important d'enregistrements appariés est le fait qu'une caractérisation fonctionnelle peut être combiné avec une analyse morphologique à la fois la lumière et de l'électron niveau microscopique (voir, par exemple., ^7,16,21). Après le traitement histochimique, la morphologie dendritique et axonale de la paire de neurones reliés par des synapses est tracée. Par la suite, il est possible de quantifier les caractéristiques morphologiques telles que la longueur, la densité spatiale, l'orientation, patron de ramification, etc. Ces paramètres peuvent alors fournir une base pour une classification objective d'une connexion synaptique spécifique. En outre, contrairement à la plupart des autres techniques utilisées pour l'étude de rappro neuronalestivité, jumelé enregistrements permettent également l'identification des contacts synaptiques pour les connexions synaptiques unitaires. Cela peut être fait directement à l'aide d'une combinaison de microscopie optique et électronique ^16,21-27 ou en utilisant l'imagerie calcique ^28,29 des épines dendritiques. Toutefois, cette dernière approche ne excitateur mais pas des connexions inhibitrices peuvent être étudiés car elle nécessite l'influx de calcium par les canaux des récepteurs post-synaptiques.

En plus d'une analyse détaillée de la transmission synaptique chez un microcircuit couplé enregistrements neuronaux définies permettent également l'étude des règles de plasticité synaptique ^30,31 ou - en combinaison avec une application agoniste / antagoniste - la modulation de la transmission synaptique par les neurotransmetteurs tels que l'acétylcholine et de l'adénosine ^{32 33.}

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la directive de l'UE pour la protection des animaux, la Loi sur la protection des animaux allemand (Tierschutzgesetz) et les lignes directrices de la Fédération de l'Association européenne des sciences des animaux de laboratoire.

1. Mise en place d'électrophysiologie

Avant de commencer avec enregistrement jumelé, un électrophysiologie set-up doit être construit. Un bref aperçu comment un tel set-up est assemblé est donné ci-dessous:

1. Installez une table anti-vibration sur lequel le microscope, les manipulateurs et tout autre équipement seront placés.
   REMARQUE: Vibration ou tout autre type de mouvement doit être aussi petit que possible lors de l'enregistrement de connexions synaptiques, car cela nécessite un changement de pipettes (recherche électrode remplacé par l'électrode d'enregistrement).
2. Placez une cage de Faraday autour de la table anti-vibrations pour réduire le bruit électrique. Connectez tous les équipements à l'intérieur du Faraday cage avec le sol électrique.
3. Installez un microscope avec un axe de mise au point motorisée qui est basé sur une table xy motorisée sur la table anti-vibration selon les directives du fabricant. Ceci permet de se déplacer de manière fiable le microscope pour les neurones qui ne sont pas dans le même champ de vision comme ce est le cas pour les connexions translaminaires dans le néocortex.
4. Installer une caméra vidéo sur le port de la caméra du microscope et le connecter à des écrans analogiques et / ou numériques d'observer la préparation de tranche et le mouvement des électrodes. Utilisez un appareil photo, qui peut être commuté entre un faible et un grossissement de haute puissance pour obtenir une vue d'ensemble et une image en gros plan, respectivement, de la paire neuronale synaptiquement couplé cellulaire. Cela permet également de contrôler le mouvement des électrodes de patch.
5. Installez une table d'échantillons contenant un encart pour la chambre de bain (foré en interne d'un bloc en plexiglas) pour la préparation de tranches de cerveau. Cette table de spécimen ne doit pas être connectée à lamicroscope, ce est à dire, doit être fixé à la table d'air et le microscope doit être manoeuvrable en dessous.
6. Montez deux (ou plus si nécessaire) micromanipulateurs de haute précision qui peuvent être déplacés dans les trois dimensions. Installez patch-clamp préamplificateur sur les manipulateurs et les connecter à l'amplificateur principal.
   NOTE: Si manipulateurs supplémentaires nécessaires peuvent être installés pour, par exemple, plus de deux pré-amplificateurs, des électrodes de stimulation extracellulaire, les systèmes de délivrance de médicaments, etc.
7. Placer la chambre de bain dans la table pour spécimen. Installez une entrée de solution et de sortie et les connecter au système de perfusion.
8. Utilisation d'une pompe péristaltique pour maintenir la perfusion de la chambre d'enregistrement à liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF; tableau 1) à une vitesse d'écoulement stable de 4 à 6 ml / min pour la viabilité optimale tranche.
   REMARQUE: Ne pas dépasser ce débit significativement que cela se traduira par la turbulence dans le FCSA et donc le mouvement de la tranche.
9. Installation de supports pour la sonde de température et Ag / AgCl électrode de masse sur la table pour spécimen. Cela est nécessaire pour permettre à la sonde et l'électrode de goûter à la salle de bain dans la chambre.
10. Pour une bonne visibilité des neurones dans la préparation de tranches utiliser un éclairage infrarouge dans le microscope. Cela réduit diffraction de la lumière et donc le flou. Assurez-vous que le microscope est équipé de différentiels optiques de contraste d'interférence pour obtenir un «visualisation 3D'-like. Cela aidera à patcher neurones et permettrait de cibler les neurones profonds dans la tranche (60 um ou plus profond).
11. Pendant l'expérience, conserver des tranches de cerveau dans une chambre expérimentale avec une lamelle de verre au fond. Placez un 'harpe platine »en haut de la tranche pour éviter tranches de flotter. Une harpe de platine est fabriqué à partir en forme de U, un fil de platine aplatie avec des chaînes de fil dentaire collés sur elle.
12. Gardez l'ACSF perfuser la tranche à une température de 32-35 ° C pour assurer optcontrôle de iMAL de l'oxygénation et de pH. Cela peut se faire en chauffant la solution à un dispositif Peltier installé à proximité de l'entrée de l'ACSF dans la chambre de bain.
    REMARQUE: Utilisez couvercle glisse ultra-mince de sorte que même les condenseurs de microscope avec une ouverture numérique élevée et à courte distance de travail peuvent être axées sur l'échantillon. Cela est nécessaire pour un éclairage optimal de la tranche.
    Pour une image et une description d'un set-up de l'électrophysiologie optimisé pour les enregistrements appariés dans la préparation de tranches de cerveau voir Figure 4. Ref ^34.

2. tranche de cerveau Préparation

1. Légèrement anesthésier l'animal à partir duquel le tissu cérébral doit être pris avec de l'isoflurane (concentration finale <0,1%).
   REMARQUE: Les autres anesthésiques peuvent également être utilisés. L'utilisation de l'anesthésie doit se conformer aux recommandations et règles du comité animale respective. Toujours se assurer que l'animal ne est pas irritée ou sous contrainte après l'ajoutl'anesthésique.
2. Décapiter l'animal, ouvrir le crâne et le cerveau retirer aussi rapidement que possible en utilisant la procédure décrite dans les références ^34,35..
3. Transférer le cerveau en refroidie (4 ° C) liquide céphalo-rachidien artificiel aérée avec un mélange de gaz avec du carbogène 95% O ₂ et 5% de CO _2.
4. Isoler la région du cerveau qui devrait être étudié.
   REMARQUE: Les paramètres pour obtenir une conservation optimale et troncature minimale de dendrites et des axones des neurones pré- et post-synaptiques doit être déterminé à l'avance pour chaque connexion neuronale et le stade de développement de l'enquête. Dans une tranche de cerveau disséqué de façon optimale, l'axone du neurone présynaptique est pas nécessaire pour être parallèle à la surface de la tranche. Au contraire, ils doivent pointer dans les tranches avec un angle faible. La applique pour la dendrite apicale de neurones pyramidaux post-synaptiques; ce doit être vérifiée au microscope optique. Ceci est particulièrement important pour le non-local ou tconnexions synaptiques ranslaminar, ce est à dire., où somata avant et post-synaptique sont plus de 200 um à part et la probabilité de troncatures dendritiques et axonales est susceptible d'être sensiblement plus élevé que pour les connexions locales.
5. Transférer le cerveau à la chambre microtome. Sur la base de résultats empiriques, différentes solutions de tranchage extracellulaire sont utilisés en fonction de l'âge de l'animal (voir les tableaux 2 et 3, de l'information utile peut également consulter la rubrique ' http://www.brainslicemethods.com/ ').
6. Couper le cerveau jusqu'à ce que la région cible est visible.
7. Pour obtenir des tranches avec une bonne visibilité de la cellule, couper 300-400 um d'épaisseur des tranches de cerveau si l'animal est mature (> 3 semaines). Si l'animal est immature (1 ^er au 2 ^ème semaine postnatale pour les souris et les rats) tranches peut être coupé jusqu'à une épaisseur d'environ 600 à 800 um sans altérer sensiblement Visib cellulaireilité.
   NOTE: Cela permettra d'améliorer la stabilité de tranches «immatures» et de réduire le nombre de troncatures possibles de longue portée dendritique et collatérales axonales.
8. Transférer les tranches de la chambre microtome à une chambre d'incubation rempli avec une solution de tranchage aérée avec un mélange de 95% O ₂ et 5% de CO _2. Garder les tranches dans la chambre d'incubation pendant au moins 30 min à 1 h à la température ambiante ou soit à ~ 30 ° C, en fonction du type d'expérience.

3. jumelés Patch-Clamp Enregistrement et biocytine Remplissage

Selon le type de connexion synaptique trois approches différentes sont utilisées pour trouver les neurones synaptiquement couplés. Si la probabilité de connexion est faible (comme on peut s'y attendre pour les connexions les plus excitateurs), procédez comme suit:

1. Connexions neuronales avec une connectivité à faible
   1. Remplissez les pipettes de patch avec une solution interne de la composition énumérésdans le tableau 4 pour tous les enregistrements dans la configuration cellule entière ajouter biocytine à des concentrations comprises entre 3 -. 5 mg / ml pour le (pipette) solution interne pour obtenir de bons résultats de coloration pour les neurones pré- et post-synaptiques. Soit biocytine diffuse dans la cellule pendant au moins 15 à 30 min (selon la taille du neurone).
      NOTE: Ne pas ajouter biocytine à la solution utilisée dans les pipettes 'Recherche' mentionnés ci-dessous.
   2. Patch un neurone post-synaptique putative en mode cellule entière. Utilisez pipettes de patch avec une tige longue et mince. Ceci facilite la maniabilité de la pipette de l'objectif et de réduire des artefacts de mouvement qui peuvent se produire lorsque l'électrode est introduite dans la tranche.
   3. Puis, patcher un neurone présynaptique potentiel dans une configuration cellule attachée en utilisant un 'chercher' pipette de patch de 8-10 résistance de MQ et un petit diamètre de pointe. Avec ces pipettes établir un patch joint de cellule «lâche». Fill la 'recherche' pipette avec une solution interne dans lequel K ⁺ est remplacé par Na ⁺ (tableau 5) afin de ne pas dépolariser les neurones pendant la recherche d'une cellule présynaptique.
      NOTE: La résistance d'étanchéité «lâche» ne est pas dans la gamme de GQ, mais généralement autour de 30 à 300 MQ.
   4. Tenez le potentiel de membrane sous le sceau «lâche» à environ -30 à -60 mV en mode pince de courant. Ensuite, appliquez de grandes impulsions de courant (0,2 à 2 nA) pour susciter un potentiel d'action dans la cellule présynaptique potentiel. Observer ce potentiel d'action en tant que petit épillet sur la réponse de tension.
   5. Réglez la fréquence de stimulation à 0,1 Hz pour éviter délabré d'une réponse post-synaptique. Utiliser des fréquences de stimulation plus faibles dans le cas du tissu cérébral est très immature ou la connexion synaptique pas très fiable.
   6. Dans le cas où le neurone "postsynaptique" ne répond pas à la stimulation de la neu testé 'présynaptique'ron, patcher un nouveau neurone en mode d'étanchéité «lâche». Ne pas remplacer la 'recherche' électrode de patch tant que le joint avec une résistance de> 30 MQ est établi. Testez jusqu'à 30 neurones présynaptiques potentiellement de cette façon.
      NOTE: Pour éviter d'endommager le neurone au cours de la procédure de recherche avec lâche patch clamp, seulement légèrement aspiration doit être appliqué à la pipette de recherche par rapport à celui appliqué à la pipette de patch à cellules entières.
   7. Si la stimulation dans les résultats «lâche» du mode d'étanchéité dans un EPSP / IPSP avec une latence <5 ms dans le neurone post-synaptique retirer la 'recherche' pipette de l'neurone présynaptique.
   8. Remplacez le 'chercher' pipette de patch avec une électrode de patch rempli de solution interne régulier contenant biocytine. Veiller à ce patch d'enregistrement pipette comporte une résistance de 4-8 MQ; plus la taille de soma plus la résistance de l'électrode peut être.
   9. Patcher le présynaptiqueneurone et record en cellule entière, mode courant-clamp. Susciter des potentiels d'action par injection de courant dans les neurones présynaptiques et enregistrer la réponse post-synaptique. Stocker les données sur un ordinateur pour une analyse ultérieure hors ligne.
2. Connexions neuronales avec une connectivité haute
   NOTE: Pour microcircuits neuronaux avec un taux de connectivité haute (> 30%) utiliser une procédure différente pour trouver connexions synaptiques. Cette procédure est décrite ci-dessous et est souvent utilisé pour la connexion synaptique inhibitrice qui ont, en moyenne, un taux de connectivité supérieure à ³⁶ connexions excitatrices. Il ne doit pas être utilisé lorsque le rapport de la connectivité est inférieure à cette valeur.
   1. Patch un neurone présynaptique directement dans le mode cellule entière. Puis, patcher un neurone post-synaptique potentiel, également en mode cellule entière. Les deux cellules doivent être sous le contrôle de pince de courant. Déclencher un potentiel d'action dans la cellule présynaptique. Surveiller le neurone post-synaptique prospective pour une postsynaptic potentiel.
   2. Au cas où le neurone ne montre pas une réponse à la stimulation présynaptique, patcher un nouveau neurone en mode cellule entière utilisant une électrode de patch rempli avec une solution interne régulier. Si une connexion ne est trouvée, ne changez pas la pipette de patch, mais procéder à l'enregistrement. Ensuite, procédez comme à l'étape 3.1.9.
3. Connexions neuronales via gap-jonctions
   REMARQUE: Pour rechercher (écart-jonction) connexions électriques utiliser la procédure suivante qui est une version modifiée de celui utilisé pour les connexions à faible probabilité.
   1. Patch un neurone post-synaptique dans la configuration patch clamp cellule entière.
   2. Par la suite, patcher un neurone présynaptique putative dans la configuration lâche-joint (faible résistance de joint de 30 à 300 MQ) en utilisant un 'chercher' pipette de patch de 7-10 résistance de MQ. Cette pipette doit être rempli avec la solution interne modifiée haute Na ⁺ pour la stimulation lâche-joint.
   3. Inject 100-300 ms longues impulsions actuelles hyperpolarisants via le sceau «lâche»; le potentiel de commande de pipette devrait être fixé à environ -60 à -70 mV. Observez une connexion écart de jonction si cette stimulation des résultats dans une petite réponse hyperpolarisant dans le neurone "post-synaptique.
   4. Repatcher le neurone «présynaptique» dans le mode cellule entière et procéder comme décrit ci-dessus.
      REMARQUE: Pour assurer une bonne coloration des processus axonales et dendritiques, utiliser le protocole ci-dessous. Ce protocole est décrit en bref ici, cependant, un protocole détaillé pour le traitement histochimique utilisée dans notre laboratoire est donnée dans la réf. ^37.

4. Traitement histochimique

1. Transférer la tranche de cerveau avec la paire de neurones synapses couplées dans un flacon contenant 4% de paraformaldehyde dissous dans du tampon phosphate 0,1 M et fixer la tranche pendant 24 heures. Pour la microscopie électronique, fixer la tranche en utilisant 2,5% glutaraldéhyde et 1% de paraformaldehyde.
2. Le jour suivant, transférer les tranches dans un tampon de phosphate ne contenant pas de fixateur normale. Laver tranches avec un tampon phosphate pour 6-8 fois pendant 10 - 15 min chacun pour enlever l'excès de fixateur.
3. Incuber tranches pendant 20 min dans un 3% de H ₂ O ₂ en solution 0,1 M de tampon phosphate afin de minimiser la réaction de la peroxydase endogène. Observer la formation de bulles forte. Continuer la réaction jusqu'à ce qu'aucun autre bulles sont produites. Ensuite, rincer les tranches dans 0,1 M de tampon phosphate de 6-8 fois (pendant 10 min chacun) pour enlever tout reste de H ₂ O _2.
4. Réactions immunocytochimiques et chromogènes
   La visualisation des neurones biocytine-rempli est basé sur une réaction streptavidine-peroxydase de raifort biotinylée catalysée avec de la diaminobenzidine; ce qui produit un précipité noir qui produit une tache croustillant avec une haute résolution spatiale. Les procédures suivantes sont utilisées pour la réaction chromogène:
   1. Préparer la solution ABC selon le protocole du fabricant. Ajouter à 14,55 ml de tampon phosphate additionné 150 pi 10% de Triton X100 (tableau 6; seulement pour la microscopie optique) et maintenir la solution pendant environ 30 minutes dans l'obscurité. Incuber tranches dans cette solution O / N avant utilisation.
   2. Incuber tranches en solution ABC sur un agitateur pendant 1 heure à température ambiante et dans l'obscurité. Par la suite, garder des tranches O / N à 4 ° C dans un réfrigérateur. Le lendemain matin, les tranches incuber à température ambiante pendant une heure supplémentaire.
   3. Après cela, rinçage des tranches d'au moins quatre fois pendant 10 minutes chaque dans du tampon phosphate. Ensuite, incuber sur un agitateur pendant environ 30 min à l'obscurité dans 2 ml d'une solution 3-3'-diaminobenzidine-nickel intensifié (tableau 7). Soyez très prudent lors de la manipulation diaminobenzidine et utiliser uniquement sous la hotte; il est extrêmement cancérigène même à des concentrations très faibles.
   4. Ajouter 6,5 pi 3% de H ₂ O ₂ contenant au-diaminobenzidinesolution. Surveiller la réaction chromogène sous un microscope optique jusqu'au neurones taché de brun-noir sont clairement visibles. Ensuite, arrêter la réaction immédiatement par lavage tranches à plusieurs reprises dans un tampon phosphate.
   5. Tranches Mount neurones colorés sur adhésif, Histobond silane enduits ou diapositives d'objets standards gélatinisées.
   6. Gardez les lames dans une chambre humide avec au moins 80% d'humidité O / N. Le lendemain, laisser les tranches sécher à l'air pendant encore 10 min. Avant l'intégration, diapositives de transfert dans des solutions avec des concentrations croissantes de l'éthanol (20 à 100%) afin de les déshydrater.
      NOTE: Le processus de déshydratation devrait être lente contraire des distorsions dans les processus de dendritiques et axonales sont susceptibles de se produire ^37. Si une procédure d'intégration alternatif est choisi, par exemple, une avec le Moviol à base de glycérol, un déshydratation ne est pas nécessaire; mais cela est susceptible d'entraîner une compression non homogène de la tranche et donc une morpholo neuronale déforméegy.
   7. Enfin, incuber pendant 10 min dans du xylol, intégrer les tranches dans un milieu d'enrobage hydrophobe pour la microscopie optique et placez un lamelles ultra-minces sur le dessus. Laissez sécher les diapositives pendant 20 min à température ambiante.

5. neuronale reconstruction et Synaptic Contact localisation

1. Examiner les lames avec les neurones de biocytine marqué sous un microscope optique équipé d'un objectif 60X / 100X à immersion d'huile et d'un condenseur avec une ouverture numérique élevée pour la résolution spatiale optimale. Veiller à ce que axonale boutons et épines dendritiques sont clairement visibles.
2. Trace neurones ou paires de neurones synaptiquement couplés en utilisant un neurone commerciale système de traçage (voir le tableau de matériaux spécifiques / Équipement) pour obtenir des reconstructions 3D neuronales. Effectuer le traçage manuellement sous inspection visuelle constante pour détecter même petite axonale ou des collatéraux dendritiques. Pour les enregistrements appariés de neurones synaptiquement couplés traçage manuel est encore la méthode dechoix parce que l'attribution de par exemple, un profil axonale soit le neurone pré ou post-synaptique requiert de l'expérience de reconstruction substantielle.
3. Si nécessaire, faire des chefs d'accusation de boutons axonales et / ou épines dendritiques. Parce épines ou même sous-types de la colonne vertébrale et boutons axonales peuvent présenter une répartition et la densité spécifique concernant par exemple, couche corticale ou de la zone, ce qui pourrait aider à caractériser les types de cellules neuronales.
4. Pour paires de neurones couplés synaptique, vérifiez l'axone présynaptique et les dendrites postsynaptiques pour les gros appositions au plus fort grossissement disponibles. Observer un bouton axonale et une colonne vertébrale ou arbre dendritique postsynaptique est dans le même plan focal peut être considéré comme un contact synaptique putatif. Marquer ce contact dans la reconstruction.
5. Corrigez les reconstructions neuronaux pour le retrait dans les trois dimensions spatiales dans la section appropriée du programme de traçage.
   REMARQUE: lors de la fixation, le traitement histochimiqueet la déshydratation mécanique déformation substantielle et retrait se produisent; cela va affecter les mesures de longueur axonales et dendritiques et sévèrement déformer leur disposition spatiale. Retrait des facteurs de correction pour le milieu d'inclusion sont ~ 1,1 pour x et y et ~ 2.1 pour la direction z ^37.
6. Pour une analyse quantitative morphologique utiliser un programme d'analyse de données pour la neurophysiologie (voir le tableau de matériaux spécifiques / Équipement).

Résultats

Enregistrements liés sont la méthode de choix pour une caractérisation approfondie des connexions synaptiques uni ou bidirectionnels morphologiquement identifiées ainsi que jonctions lacunaires connexions (électriques) (Figure 1). Un exemple d'un enregistrement couplé à la couche 4 du cortex somato-sensoriel du canon est représentée sur la Figure 1A. Les deux excitateurs unidirectionnel et connexions synaptiques inhibiteurs peuvent être caractérisées (figure 1B, ...

Discussion

Enregistrements appariés de excitateur synaptiquement couplé et / ou neurones inhibiteurs sont une approche très polyvalent pour l'étude de microcircuits neuronaux. Non seulement cette approche permet d'estimer la connectivité synaptique entre les types de neurones, mais permet également de déterminer les caractéristiques fonctionnelles de la connexion et de la morphologie des neurones pré- et post-synaptiques. En outre, un agoniste et / ou antagoniste peuvent être facilement appliqués à des neurones...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA	EPC 10 USB Triple	with 2 - 3 preamplifiers
Microscope	Olympus	BX51WI	with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective
Camera	TILL Photonics	VX55	infrared CCD camera
Workstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5	x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers
Faraday cage	Luigs & Neumann
Anti-vibration table	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
Microtome	Microm International	HM650V
Micropipette puller	HEKA	Sutter P-97
Neurolucida system	Microbrightfield		with Neurolucida and Neuroexplorer softwares