急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

要約

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

要約

同時細胞内ビオシチン充填急性脳スライス標本における2つ（またはそれ以上）のシナプス結合したニューロン（対の録音）からのパッチクランプ記録の組み合わせは、それらの構造的および機能的特性の相関分析を可能にする。この方法では、その形態および電気生理学的応答パターンの両方によって前およびシナプス後ニューロンを同定し、特徴付けることが可能である。対になった記録は、これらのニューロン間の接続パターン並びに化学的および電気的シナプス伝達の両方の性質を研究することができます。ここでは、ニューロンの形態の最適な回復とともに信頼性の高いペアの録音を得るために必要な手順のステップバイステップの説明を与える。私たちは、化学シナプスまたはギャップ結合を介して接続されたニューロンのペアは、脳スライス標本で識別されている方法を説明します。私たちは、ニューロンがdendritの彼らの3D形態を得るために再構築されているかを概説しますICと軸索ドメインとどのようにシナプスの連絡先が特定され、ローカライズされています。これらは強く接続性の推定値に影響を与えるので、我々はまた、特に、脳スライスの準備中に、樹状および軸索切断をに関連するものを対に記録技術の注意事項と制限事項について説明します。しかし、対になった記録アプローチの汎用性のそれは、脳内で識別ニューロンのマイクロ回路でシナプス伝達のさまざまな側面を特徴付ける貴重なツールのままになります。

概要

2シナプス結合されたニューロン間の神経マイクロ回路は、脳内の大規模ネットワークの構築ブロックでシナプス情報処理の基本単位である。そのようなニューロンのマイクロ回路の特徴付けのための前提条件は、前およびシナプス後パートナーニューロンの両方の形態学的および機能的特性を知ることがシナプス結合（単数または複数）およびその構造的および機能的メカニズムのタイプである。しかし、シナプス結合の多くの研究で、超小型回路内のニューロンのうちの少なくとも一方は、十分に特徴付けされていない。これは多くの場合、シナプスの接続性の研究に使用される比較的非特異的刺激プロトコルに起因する。したがって、シナプス前ニューロンの構造的および機能的特性のいずれかのすべてまたは唯一のかなり小さい程度に識別されていない（ すなわち、マーカータンパク質の発現など ）。マーカーSによって細胞内染色との組み合わせでペアの録音ビオシチン、neurobiotinまたは蛍光染料などのuchが小さなニューロンのマイクロ回路を研究するために適しています。この技術は、一方が、同時に、形態学的に同定されたシナプス結合の多くの構造的および機能的パラメータを調査することを可能にする。

2つのニューロン間のいわゆる「単一の」単シナプス接続は、急性スライス標本を使用して両方の皮質及び皮質下の脳領域^1-10に研究されてきた。最初に、鋭い微小電極は、これらの実験で使用した。以降、パッチクランプ記録は、より低い騒音レベルと改善された時間分解能でのシナプス信号の記録を得るために使用した。

重要な技術的進歩は、赤外線微分干渉コントラスト（IR-DIC）光学^11-14、かなりことができるトンとなるように脳切片におけるニューロンの視認性及び識別を改善顕微鏡技術を使用することであったO視認シナプス結合^15-17からの記録を入手。一般的には、対になった記録は、急性スライス標本で行われている。ごく少数の出版物は、生体 ^18-20 でシナプス接続ニューロンからの録音を報告可能です。

対になった録音の最も重要な利点は、機能的特徴は、光および電子顕微鏡レベルの両方で、形態素解析と組み合わせることができるという事実である（ 例えば、参照^{、7,16,21）。}組織化学的処理の後、シナプス接続ニューロンペアの樹状突起と軸索形態がトレースされます。続いて、これらのパラメータは、特定のシナプス結合の目的の分類のための基礎を提供することができる等の長さ、空間密度、配向、分岐パターンとして形態学的特徴を定量化することが可能である。さらに、神経connectiを研究するために使用されるほとんどの他の技術とは対照的にVITY、対になった録音は、また単一のシナプス結合のためのシナプスの連絡先の識別を可能とする。これは、光学および電子顕微鏡^16,21-27の組み合わせを使用して、または樹状突起棘のカルシウムイメージング^28,29を用いて直接行うことができる。それがシナプス後受容体チャネルを介してカルシウム流入を必要とするが、後者のアプローチのみではなく、興奮抑制結合を研究することができる。

アゴニスト/アンタゴニストのアプリケーションと組み合わせて- -対に定義されたニューロンのマイクロ回路におけるシナプス伝達の詳細な分析に加えて、記録はまた、シナプス可塑性ルール^30,31または研究を可能にするようなアセチルコリン³²およびアデノシンなどの神経伝達物質によるシナプス伝達の調節を^33。

プロトコル

全ての実験手順は、動物の保護、​​ドイツの動物保護法のためのEU指令（Tierschutzgesetz）と欧州実験動物学協会連合会のガイドラインに従って実施されてきた。

電気生理学1.セットアップ

ペアリング記録を開始する前に、電気生理学のセットアップを構築する必要があります。このようなセットアップが組み立てられるかを簡単な概要は以下のとおりである：

1. 顕微鏡、マニピュレータ、他のすべての機器が置かれる上防振テーブルをインストールします。
   注：振動や移動の任意の他の種類は、これは（記録電極によって置き換え検索電極）ピペットの変更を必要とするので、シナプス結合から録音する場合、可能な限り小さくする必要がある。
2. 電気的ノイズを低減する防振テーブルの周りにファラデーケージを置きます。ファラデーCA内のすべての機器を接続する電気的接地とGE。
3. メーカーのガイドラインに従って防振テーブル上に電動XYテーブルに基づいており、電動フォーカス軸と顕微鏡をインストールします。これは確実にそれが新皮質でtranslaminar接続の場合のように同じ視野にないニューロンに顕微鏡を移動することができます。
4. 顕微鏡のカメラポートにビデオカメラを設置し、スライス標本と電極の動きを観察するために、アナログ及び/又はデジタルスクリーンに接続。シナプス結合された神経細胞のペアを、それぞれ、概要とクローズアップ画像を得るために低·高出力の倍率との間で切り替えることができるカメラを使用してください。これはまた、パッチ電極の移動を制御するのに役立つ。
5. 脳スライス標本用（パースペックスブロックから社内で掘削）入浴室のためのインセットを含む試料台を取り付けます。この試料台が接続されてはならない顕微鏡は、 すなわち、空気テーブルに固定しなければならず、顕微鏡は、その下に操作しやすいである必要があります。
6. マウントつ（または必要であればそれ以上）の3つのすべての次元で移動させることができる高精度のマニピュレーター。マニピュレータ上のパッチクランププリアンプをインストールし、メインアンプに接続します。
   注：必要な追加のマニピュレータは、例えば 3つ以上の前置増幅器、細胞外の刺激電極、薬物送達システムなどに設置することができる場合
7. 試料台に入浴室を置きます。ソリューションの入口と出口をインストールし、灌流システムに接続します。
8. 最適なスライスの生存率は6 ml /分- 4の安定した流量で、人工脳脊髄液（ 表1 ACSF）で記録チャンバーの灌流を維持するために、蠕動ポンプを使用してください。
   注：それはASCFで乱流とスライスのため、動きになりますように大きく、この流量を超えないようにしてください。
9. 試料台上に温度プローブおよびAg / AgClの接地電極用ホルダーを取り付けます。これは、プローブと電極がチャンバ内にバスをサンプリングすることを可能にする必要がある。
10. スライス標本におけるニューロンの良好な視認性のために顕微鏡で赤外線照明を使用しています。これは、光の回折、従って、像振れを低減する。顕微鏡は「3D'のような可視化を実現するために微分干渉コントラスト光学系を搭載していることを確認します。これは、ニューロンにパッチを助け、スライス（60μm以下、より深い）の深いニューロンをターゲットにできるようになります。
11. 実験中、下部のカバーガラスを用いた実験室で脳スライスしておく。浮動からスライスを防止するために、スライスの先頭に「プラチナハープ」を配置します。白金ハープそれに接着デンタルフロスの文字列をU字型、平坦化された白金ワイヤから作られる。
12. OPTを確保するために、35℃ - 32℃の温度でスライスを灌流ACSFしてください酸素およびpHのimal制御。この浴室へのACSF流入の近くに設置ペルチェ素子との溶液を加熱することにより行うことができる。
    注：使用極薄カバーは、高開口数と短い作動距離であっても、顕微鏡のコンデンサ試料に焦点を合わせることができるように滑る。これは、スライスの最適な照明が必要である。
    画像と脳スライス標本における対になった記録のために最適化された電気生理学のセットアップの説明については文献^[34の図4を参照してください。

2.脳スライスの準備

1. 軽度の脳組織をイソフルラン（最終濃度<0.1％）で撮影されるべきで動物を麻酔する。
   注：他の麻酔薬を使用することもできる。麻酔薬の使用は、それぞれの動物委員会の勧告やルールを遵守する必要があります。常に動物が追加した後のイライラやストレス下にないことを確認してください麻酔薬。
2. 動物の首を切る、頭蓋骨を開き、参考文献に記載されている手順を使用して、可能な限り迅速に脳を削除してください^。34,35。
3. 95％O ₂および5％CO ₂でカルボゲンガスの混合物を通気冷却（4℃）人工脳脊髄液中に脳を転送する。
4. 検討する必要がある脳の領域を分離します。
   注：最適な保全と前とシナプス後ニューロンの樹状突起と軸索の最小限の切り捨てを得るためのパラメータは、調査対象の各ニューロンの接続と発達段階のために、事前に決定されるべきである。最適に解剖した脳切片において、シナプス前ニューロンの軸索は、スライス面に平行である必要はない。むしろ、浅い角度でスライスに指している必要があります。シナプス後錐体ニューロンの先端樹状突起のために適用されます。これは、光学顕微鏡下でチェックする必要があります。これは、非ローカルまたはt-にとって特に重要であるranslaminarシナプス結合、 すなわち 、前とシナプス後細胞体が200μm以上離れており、樹状突起と軸索末端切断の確率はローカル接続のためのよりも実質的に高い可能性が高いです。
5. ミクロトーム室に脳を転送します。経験的な知見に基づいて、異なる細胞外のスライスソリューションは、（;役立つ情報も'の下にあります表2および3を参照してください動物の年齢に応じて使用されているhttp://www.brainslicemethods.com/ '）。
6. 対象領域が表示されるまで、脳をトリミング。
7. 動物が成熟している場合（3週>）厚さ400μmの脳スライス - 良好な細胞の可視性とスライスを取得するには、300を切った。動物が未熟である場合（マウスとラットのための^第 2生後週に1回^目 ）のスライスは、〜600の厚さまで切断することができる- 、実質的に細胞visibを損なうことなく、800ミクロンility。
   注：これは、「未成熟」のスライスの安定性を向上させ、長期的樹状および軸索側枝の可能な切断の数を減少させる。
8. 95％O ₂および5％CO ₂の混合物を通気スライス溶液で満たされたインキュベーションチャンバーをミクロトーム室からスライスを転送する。実験の種類に応じて、室温でまたは約30°Cのいずれかで、少なくとも30分、1時間インキュベーションチャンバー内のスライスを保つ。

3.ペアパッチクランプ記録とビオシチン充填

シナプス結合の種類に応じて3つの異なるアプローチがシナプス結合したニューロンを見つけるために使用される。 （ほとんどの興奮性の接続が期待できるように）接続確率が低い場合は、次の手順に従っ

1. 低い接続性ニューロンの接続
   1. 記載されている物の内部溶液とパッチピペットを埋める表4の全細胞構成内のすべての記録のために3の間の濃度でビオシチン追加- 。前とシナプス後ニューロンの良い染色結果を得るために、内部（ピペット）を溶液に加え、5ミリグラム/。 （ニューロンのサイズに応じて）30分 - 少なくとも15のために細胞内に拡散ビオシチンう。
      注：下記の「検索」ピペットで使用した溶液にビオシチンを追加しないでください。
   2. 全細胞モードで推定されるシナプス後ニューロンにパッチを適用します。細長いシャンクでパッチピペットを使用してください。これは客観的な下にピペットの操作性を容易にし、電極をスライスに導入された場合に発生する可能性があり動きアーチファクトを低減します。
   3. 10MΩ抵抗と小さな先端径 - その後、8の「検索」パッチピペットを用いて細胞接続構成の潜在的なシナプス前ニューロンにパッチを適用。これらのピペットでは「緩い」セルに接続されたパッチを確立する。 FILlのK ^+は、シナプス前細胞の探索中にニューロンを脱分極させないために^は Na ^+（ 表5）で置換されている内部溶液と「検索」ピペット。
      注：「緩い」シール抵抗はGΩ範囲ではありませんが、典型的には約30から300MΩ。
   4. 電流クランプモードで約-30 mVの-60に「緩い」シールの下の膜電位を保持する。潜在的なシナプス前細胞に活動電位を誘発するために - （2 nAの0.2）そして、大電流パルスを印加する。電圧応答の小さな小穂としてこの活動電位を観察します。
   5. シナプス後応答の実行ダウンを防ぐために、0.1 Hzに刺激周波数を設定します。脳組織が非常に未熟またはシナプス結合非常に信頼性がない場合には低刺激周波数を使用してください。
   6. ケースで「シナプス後」ニューロンは、試験した「シナプス前」neuの刺激に応答しないロンは、「緩い」シールモードで新しいニューロンにパッチを適用。 30MΩが確立されている>の抵抗のシールである限り「検索」パッチ電極を交換しないでください。このように30潜在的にシナプス前ニューロンまでテストします。
      注：緩いパッチクランプで検索手順中に神経細胞の損傷を防止するために、唯一優しく吸引は、全細胞パッチピペットに適用されるものと比較し、検索ピペットに適用する必要があります。
   7. レイテンシのEPSP / IPSPの「緩い」シールモード結果の刺激は、<シナプス後ニューロンで5ミリ秒、シナプス前ニューロンから「検索」ピペットを削除した場合。
   8. ビオシチン含有、定期的な内部溶液で満たされたパッチ電極との「検索」パッチピペットを交換してください。この記録パッチピペットは4の抵抗があることを確認 - 8MΩを。下部電極抵抗はすることができ、より大きな細胞体の大きさ。
   9. シナプス前にパッチを適用全細胞、電流クランプモードでのニューロンとレコード。シナプス前ニューロンにおける電流注入による活動電位を引き出すとシナプス後応答を記録。後でオフライン分析のためのコンピュータ上のデータを保管してください。
2. 高い接続性を持つニューロンの接続
   注：高い接続性比（> 30％）のニューロンのマイクロ回路のためのシナプス結合を見つけるために別の手順を使用します。この手順は以下に概説されており、多くの場合、興奮性接続³⁶よりも平均より高い接続性比に及ぼす抑制性シナプス結合のために使用される。接続性の比率がこの値を下回った場合には使用すべきではありません。
   1. 全細胞モードで直接シナプス前ニューロンにパッチを適用します。その後、また全細胞モードでは、潜在的なシナプス後ニューロンにパッチを適用。両方のセルは、現在のクランプ制御の下でなければなりません。シナプス前細胞に活動電位を誘発する。 postsyための将来のシナプス後ニューロンを監視naptic可能性。
   2. 場合、ニューロンは、シナプス前刺激に対する応答を示す定期的に内部溶液を充填したパッチ電極を用いる全細胞モードで新しいニューロンをパッチしない。接続が見つかった場合、パッチピペットを変更するが、記録を開始しないでください。そして、ステップ3.1.9のように進んでください。
3. ギャップジャンクションを経由して神経結合
   注：電気（ギャップジャンクショ​​ン）接続を検索するには、低確率の接続に使用されるものの修正版では、次の手順を使用します。
   1. 全細胞パッチクランプ構成でシナプス後ニューロンにパッチを適用します。
   2. 10MΩの抵抗 - 7の「検索」パッチピペットを使用して - その後、緩いシール構成（300MΩ30の低いシール抵抗）で推定されるシナプス前ニューロンにパッチを適用。このピペットは緩いシール刺激のための修正された高NA ⁺内部 ​​溶液で満たされるべきである。
   3. InjecT 100から300ミリ秒「緩い」シールを経由して長い過分極電流パルス。ピペットコマンド電位は約-60 mVの-70に設定する必要があります。 「シナプス後」ニューロンの小さな過分極応答して、この刺激の結果であればギャップ結合接続を確認します。
   4. 全細胞モードで「シナプス前」ニューロンをRepatchし、上記のように進んでください。
      注：以下のプロトコルを使用し、軸索と樹状突起の良い染色を確保するために。このプロトコルは、ここで簡単に説明したが、我々の研究室で使用される組織化学的処理のための詳細なプロトコルは、文献に記載されている^。37。

4.組織化学的処理

1. 0.1 Mリン酸緩衝液に溶解した4％パラホルムアルデヒドを含むバイアルにシナプス結合されたニューロンのペアで脳切片を移し、24時間スライスを固定する。電子顕微鏡法のために、2.5％グルタルを使用してスライスを固定アルデヒド及び1％パラホルムアルデヒド。
2. 翌日、全く固定液を含まない通常のリン酸緩衝液にスライスを転送する。過剰固定液を除去するために15分ごとに - 10 8回 - 6のためにリン酸緩衝液とのスライスを洗ってください。
3. 内因性ペルオキシダーゼ反応を最小限にする0.1 Mリン酸緩衝液中3％H ₂ O ₂溶液に20分間スライスをインキュベートする。強力な気泡形成を観察します。これ以上の気泡が生成されなくなるまで反応を継続。残りのH ₂ O _2を除去するために（10分毎など）8回-その後、6 0.1 Mリン酸緩衝液中のスライスをすすぐ。
4. 免疫細胞化学および発色反応
   ビオシチンで満たされたニューロンの可視化は、ジアミノベンジジンで触媒ストレプトアビジン - ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ反応に基づいています。これは、高い空間分解能で鮮明な染色を生じる暗い沈殿物を生成する。 <：以下の手順は、発色反応のために使用されるOL>
5. 製造者のプロトコルに従ってABC溶液を調製する。 （;のみ光学顕微鏡用表6）、暗所で約30分間のソリューションを保つ150μlの10％のトリトンX100を補った14.55ミリリットルのリン酸緩衝液に加える。このソリューションはO / N使用前のスライスをインキュベートする。
6. RTで1時間シェーカー上、暗所でのABC溶液中でスライスをインキュベートする。その後、冷蔵庫で4℃でスライスO / Nを保つ。翌朝、さらに1時間室温でスライスをインキュベートする。
7. この後、リン酸緩衝液中で10分間ずつスライスの少なくとも4回すすぐ。その後、ニッケル強化3-3'-ジアミノベンジジン溶液（ 表7）を2mlの暗所で約30分間、シェーカー上でインキュベートする。アミノベンジジンを扱うだけヒュームフードの下で使用する際には十分注意してください。それは、非常に低濃度で非常に発癌性である。
8. 6.5μlの3％H ₂ O _2は、ジアミノベンジジンを含む追加ソリューション。黒褐色に染色されたニューロンがはっきりと見えるようになるまで光顕微鏡下で発色反応を監視します。その後、リン酸緩衝液中のスライスを数回洗浄することにより直ちに反応を停止させる。
9. 接着剤、シランで被覆されたHistobondまたは糊化標準オブジェクトスライド上のステンドニューロンとマウントスライス。
10. 少なくとも80％の湿度のO / Nで湿ったチャンバー内にスライドしてください。翌日、さらに10分間のスライスが、空気乾燥させます。それらを脱水するために - （100％20）埋め込みの前に、転送は、エタノールの増加濃度の溶液中でスライドする。
    注：脱水プロセスは、それ以外の樹状突起と軸索のプロセスにおいて歪みが^37を発生しやすい遅くする必要があります。代替の埋め込 ​​み手順を選択した場合、 例えば、グリセロールベースMoviol有する1つは、脱水が必要とされない。しかしながら、これは、スライスの不均一な圧縮をもたらす可能性があり、したがって、歪んだ神経morpholoGY。
11. 最後に、キシロール中で10分間インキュベートする光学顕微鏡のための疎水性の埋媒体にスライスを埋め込み、上部の超薄型カバースリップを配置。スライドを、RTで20分間乾燥させます。

5.神経復興シナプス問い合わせローカリゼーション

1. 60X / 100X油浸対物レンズと最適な空間分解能のための高開口数の冷却器を備えた光学顕微鏡下ビオシチン標識ニューロンとスライドを調べます。軸索終末と樹状突起棘がはっきりと見えることを確認してください。
2. 3Dニューロンの再構成を得るために、（ 特定の材料/機器の表を参照）システムをトレース商業ニューロンを使用してニューロンまたはシナプス結合ニューロンのペアをトレースします。小さな軸索や樹状突起担保を検出するために、一定の目視検査の下で手動でトレース行ってください。シナプス結合されたニューロンからの対になった記録のためにマニュアルトレースはまだの方法であり、選択肢例えば、前またはシナプス後ニューロンのいずれかへの軸索のプロファイルの帰属は、かなりの復興の経験を必要とするため。
3. 必要に応じて、軸索終末および/または樹状突起棘のカウントを行う。棘あるいは脊椎のサブタイプおよび軸索終末、 例えば、皮層または領域に対する特異的分布および密度を示すことができるので、これは、神経細胞型を特徴付けるために助けることができる。
4. シナプス結合ニューロンペアの場合は、利用可能な最高倍率で近いappositionsためのシナプス前軸索とシナプス後樹状突起を確認する。軸索ブートンを観察し、シナプス後樹状突起棘またはシャフトは、推定上のシナプスの連絡先として考えることができるのと同じ焦点面にある。復興でこの連絡先をマークします。
5. トレーシングプログラムの適切なセクション内のすべての3つの空間次元の収縮のための神経細胞再構成を修正してください。
   注：固定時には、組織化学的処理脱水かなりの機械的変形と収縮が起こる。これは、軸索と樹状突起の長さの測定に影響し、厳しく彼らの空間的配置が歪みます。包埋媒体用収縮の補正係数は、z方向³⁷のための〜x、y方向のための1.1と〜2.1である。
6. 定量的な形態学的分析のために、神経生理学のためのデータ解析プログラムを（ 特定の材料/機器の表を参照） を使用しています。

結果

対になった記録は、形態学的に同定されたユニまたは双方向のシナプス結合の詳細な特徴付けのための選択の方法、ならびにギャップジャンクション（電気的）接続（ 図1）である。体性感覚バレル皮質の層4における対の記録の例を図1Aに示されている。一方向性の興奮性および抑制性シナプス接続の両方が（ 図1B、C）特徴づけることができる。さらに?...

ディスカッション

シナプス結合された興奮性および/または抑制性ニューロンからの対応のある記録は、神経マイクロ回路の研究のための非常に汎用的なアプローチである。だけでなく、このアプローチは、一つのニューロン型の間のシナプス接続を推定することを可能にするだけでなく、接続および前およびシナプス後ニューロンの形態の機能的特性を決定することができない。さらに、アゴニストおよび/?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA	EPC 10 USB Triple	with 2 - 3 preamplifiers
Microscope	Olympus	BX51WI	with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective
Camera	TILL Photonics	VX55	infrared CCD camera
Workstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5	x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers
Faraday cage	Luigs & Neumann
Anti-vibration table	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
Microtome	Microm International	HM650V
Micropipette puller	HEKA	Sutter P-97
Neurolucida system	Microbrightfield		with Neurolucida and Neuroexplorer softwares