JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الموصوفة هنا هو إجراء سريع وفعال لإعادة الوظيفية للتنقية من النوع البري والبروتين CFTR الطافرة التي تحافظ على نشاط لهذه القناة كلوريد، وهو عيب في التليف الكيسي. هروب رأس المال من يوديد proteoliposomes تشكيلها بوساطة CFTR يسمح دراسات النشاط قناة وآثار جزيئات صغيرة.

Abstract

والتليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR) هو عضو لتشكيل قناة فريد من ATP ملزم كاسيت (ABC) الفصيلة من الناقلين. وقد النشاط قناة الفسفرة والنوكليوتيدات كلوريد يعتمد في كثير من الأحيان من CFTR درس في نظم خلية كاملة وكقنوات واحدة في بقع غشاء استئصاله. وقد تبين أن العديد من الطفرات المسببة للالتليف الكيسي لتغيير هذا النشاط. في حين تم نشر عدد قليل من بروتوكولات تنقية، وهي طريقة إعادة سريع أن يحتفظ النشاط القناة وطريقة مناسبة لدراسة النشاط قناة السكان في نظام تنقية تم متوفرة. يتم وصف طرق السريعة هنا لتنقية وإعادة الوظيفية للبروتين CFTR طول كامل في proteoliposomes من يعرف تركيبة الدهون التي تحتفظ النشاط كقناة هاليد المنظمة. هذه الطريقة إعادة جنبا إلى جنب مع مقايسة على أساس تدفق رواية النشاط قناة هو نظام مناسب لدراسة خصائص قناة السكان من النوع البري CFTR والمسببة للأمراض المسوخ F508del- وG551D-CFTR. على وجه التحديد، والطريقة لها فائدة في دراسة الآثار المباشرة للالفسفرة، النيوكليوتيدات والجزيئات الصغيرة مثل potentiators ومثبطات على النشاط قناة CFTR. الطرق هي أيضا قابلة للدراسة أخرى قنوات غشاء / نواقل للركائز الأيونية.

Introduction

وبوساطة وسائل النقل كلوريد عبر الأغشية قمية من الخلايا الظهارية في مثل هذه الأنسجة كما الغدد الرئة والأمعاء والبنكرياس والعرق في المقام الأول من قبل التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR)، وهو ATP- وعضو التنظيم الفسفرة من ABC (ATP- ملزمة كاسيت) C فصيلة من البروتينات الغشاء (مراجعة في 1). مثل أعضاء آخرين من فصيلة ABCC، CFTR هو كبير ومتعددة تمتد من البروتين الغشاء لا يتجزأ التي تربط ATP في موقعين ملزمة النوكليوتيدات شكلت في واجهة من المجالات ملزم النوكليوتيدات لها (NBDs)، حيث أنها تمتلك النشاط أتباز متواضع في واحد الموقع. ومع ذلك، على عكس أعضاء آخرين فصيلة ABCC، تطورت CFTR كقناة الكلور المنظمة فريدة بدلا من أن يكون نقل المذاب النشط.

الطفرات في CFTR سبب التليف الكيسي، وهو مرض يصيب أجهزة متعددة بما في ذلك الرئتين والجهاز الهضمي والبنكرياس والجهاز التناسلي، مما يؤدي إلى مرضيdity والوفيات في البالغين الصغار. حسابات أمراض الرئة عادة لالوفاة المبكرة في التليف الكيسي وفي معظم الحالات الناجمة عن فقدان وظيفة CFTR على ظهارة سطح الشعب الهوائية إجراء. عدم وجود CFTR نشاط قناة كلوريد يسبب انخفاضا في كل من الكلور - وحركة المياه عبر البشرة السطحية لتعديل طبقة السائل على سطح قمية من ظهارة مهدبة الجهاز التنفسي. وهذا يؤدي في سائل لزج سطح مجرى الهواء أن يضعف من قدرة الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي مهدبة لمسببات الأمراض واضحة على نحو فعال من الشعب الهوائية. ونتيجة لذلك، فإن معظم المرضى الذين يعانون من نوبات CF المتكررة من التهاب في الرئتين وتلف الرئتين بسبب التهاب.

كما هو متوقع، ركزت دراسات لآلية عمل البروتين CFTR العادي في المقام الأول على دراسات مفصلة الكهربية من النشاط قناة النابضة به. وقد أظهرت الدراسات قناة واحدة مباشرة أن وظائف CFTR باعتباره PKA التي تعتمد على الكلور- القناة التي تمتلك بوابة للتنظيم ATP 2. وتوفر دراسات الكهربية مفصلة على قدر كبير من المعلومات عن قنوات CFTR واحدة 1،3، ولكن قد يكون هناك قلق حول ما إذا كانت الخصائص في أي قناة واحدة خاصة أن تمت دراستها هي انعكاس للسكان قنوات CFTR وبالتالي فإن قناة واحدة ينبغي النظر دائما النتائج جنبا إلى جنب مع أساليب لدراسة السكان العيانية. الفحص المباشر للنشاط قناة سكان CFTR تنقيته لديه القدرة على توفير نظرة ثاقبة على عيب الجزيئية المرتبطة الطفرات المسببة للأمراض ودفع اكتشاف جهري الكيميائية التي إصلاح البروتينات CFTR متحولة. حتى الآن، هناك ما يزيد على 1،900 طفرات مختلفة في CFTR يعتقد أن تسبب التليف الكيسي 4. الطفرة الكبرى، F508del-CFTR، وجدت على أليل واحد على الأقل في ما يقرب من 90٪ من المرضى في أمريكا الشمالية وأوروبا يؤدي إلى بروتين misfolding لالاحتفاظ الثانية في الشبكة الإندوبلازمية 5. لديها F508del-CFTR أيضا عواقب أخرى، بما في ذلك النشاط المعيبة قناة 6-9. ويرتبط غياب الناتجة من CFTR من سطح الخلية مع المرض الشديد. G551D-CFTR، طفرة أقل شيوعا، ويعتقد أن تكون مطوية بعد غير مختلة كقناة كلوريد على سطح الخلية 6 بشكل صحيح. تطوير المصححين جزيء صغير وpotentiators لديه هدف تصحيح قابلة للطي و / أو الاتجار المسوخ مثل F508del-CFTR إلى سطح الخلية، وبالتالي يؤدي إلى زيادة نشاط أو قناة من الطفرات مثل G551D عندما موجودة على سطح الخلية، على التوالي . في حين أن المصححين VX-809 وVX-661 (لا يتم بعد الموافقة عليها لاستخدامها في المرضى، وpotentiator Kalydeco (ivacaftor، VX-770) يتم استخدامه عند 150 ملغ كل 12 ساعة في المرضى الذين CF> 6 سنوات مع واحد على الأقل G551D طفرة -CFTR، ومؤخرا للمرضى مع واحدة من G178R، S549N، S549R، G551S، G1244E، S1251N، S1255PوG1349D. Kalydeco على حد سواء آمنة والنتائج في تحسين التدابير السريرية للمرض CF 10، إلا أن آلية عمل هذا الجزيء الصغير وغير مفهومة في وقت موافقة ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام في المرضى.

وقد وصفت حفنة من طرق تنقية CFTR سابقا 2،11-18، وكثير منها يتطلب فترة طويلة من الوقت لإكمال. في منشور صدر مؤخرا 19، وقد وصفت لتنقية وإعادة السريع طريقة فريدة لCFTR overexpressed في 9 خلايا S و نظام التعبير، وكان يستخدم هذا البروتين النقي في أنظمة الدهون محددة لتطوير CFTR هاليد النشاط قناة فحص لعدد سكانها CFTR الجزيئات. الفحص يلخص آثار معروفة من الفسفرة، النيوكليوتيدات ومثبطات على وظيفة CFTR. تم استخدام نظام لاستجواب آثار potentiator VX-770 / Kalydeco على Wt- (البرية من نوع)، وقد تبين F508del- وG551D-CFTR وذلك لأولالوقت أن الدواء يتفاعل مباشرة مع البروتين CFTR لتحفيز النشاط قناتها بطريقة ATP-مستقلة، مما يدل على المرافق العامة وتطبيق هذه الأساليب لدراسة تفاعل CFTR والمسوخ مع النيوكليوتيدات والجزيئات الصغيرة من منظور السكان ل الإجابة على الأسئلة ذات الصلة سريريا عن البروتين. كما تم استخدام أساليب لدراسة الجزيئات الأخرى potentiator ومشتقاتها 20، فضلا عن الآثار المترتبة على مصحح جزيء صغير على نشاط البروتين 21.

وقد استخدمت المقايسات هروب رأس المال في العديد من الدراسات سابقا للتحقيق في نشاط المسوخ CFTR وآثار المركبات CFTR-تغييري على نشاطها، بما في ذلك المقايسات خلية كاملة باستخدام الأقطاب، استشفاف المشعة وfluorophores 22،23، الحويصلات الغشاء مع أيون أقطاب انتقائية 24 وتنقيته CFTR تشكيلها مع استشفاف المشعة 25. ومع ذلك ثوذكر استخدام (ه) من أيون أقطاب انتقائية لدراسة تنقية CFTR تشكيلها مؤخرا لأول مرة 19. وقد استخدم للتكيف من الطريقة الحالية لإعادة تشكيل وتوصيف وظيفي لاثنين من البروتينات الغشاء في الزائفة الزنجارية، الممرض CF المشترك. واستخدمت إعادة تشكيل تنقية AlgE بروتين الغشاء الخارجي إلى جانب قياسات هروب رأس المال يوديد لدعم نموذجا لإفراز الجينات أنيوني من خلال هذا نقل 26. طبقت إعادة والقياسات هروب رأس المال يوديد للبروتين Wzx النقي، والذي سمح نموذجا لأن اقترح أن يشير إلى وجود H + آلية تنادل متعاكس معتمد على لالمرتبطة الدهون قليل السكاريد النبات عبر الغشاء الداخلي للبكتيريا عن طريق هذا البروتين 27. في كلتا الحالتين كان يستخدم يوديد كبديل للالركيزة أنيوني، وإن كان أقل سرعة مما قد يتوقع المرء لالركيزة الأم. طريقة قد تكون مناسبة للتكيف مع بروتينات أخرى مع جالنقل أو التوصيل مسارات ationic لركائز الأيونية.

هنا يوصف إجراء تنقية السريع للبروتين CFTR وإعادة حيز proteoliposomes من الدهون محددة. يمكن بسهولة إجراء إعادة السريع تكون مصممة للاستخدام مع CFTR تنقيته بواسطة طرق أخرى، شريطة أن يكون نوع من المنظفات المستخدمة في تنقية هو قابل للإزالة من قبل الأساليب المستخدمة هنا أو يمكن تبادل لالمنظفات مناسب قبل إجراء إعادة. يتم وصف طريقة هروب رأس المال يوديد لقياس النشاط قناة النقي وإعادة تشكيل البروتين CFTR بالتفصيل ويتم عرض بعض النتائج النموذجية التي يمكن الحصول عليها من هذا الأسلوب.

Protocol

1. تنقية CFTR

ملاحظة: يرجى الاطلاع على جدول المواد والمعدات اللازمة لقائمة بالمعدات والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول. ويوجد بروتوكول مفصلة لoverexpression من الإنسان WT-CFTR والمسوخ في S و نظام التعبير 9-الفيروسة العصوية 17،28. بإفراط عن CFTR وإعداد الكريات من S و 9 خلايا وفقا لهذا البروتوكول.

  1. إعداد غشاء الخام
    1. الحصول على طازجة أو ذوبان الجليد وS و 9 بيليه الخلية المجمدة من ثقافة 500 مل من خلايا الإفراط في التعبير عن wildtype- والبروتين F508del-، أو G551D-CFTR مع محطة C صاحب 10 -tag، ونمت عن طريق أساليب زراعة الخلايا القياسية، كما هو موضح سابقا 17،28. سوف الكريات خلية لديها حجم ما يقرب من 5 مل والوزن الرطب من حوالي 5 ز.
    2. في resuspend S و 9 خلايا في 20 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 مع مثبط البروتياز كوكتيل (1 قرص لكل 50 مل) في 4 درجات مئوية، وضمانيبدو عينة متجانسة بصريا وتبقى عدم وجود كتل من الخلايا.
    3. خلايا ليز باستخدام اختلال وخلية الضغط العالي (جدول المواد والمعدات)، ليصل إلى ما لا يقل عن 10،000 رطل (ويفضل 15،000-20،000 رطل) لمدة 2 دقيقة لكل المرور. الحفاظ على عينة عند 4 درجات مئوية خلال تحلل.
      1. جمع العينة في أنبوب على الجليد بعد فترة تحلل ثم إعادة تحميل على الفور العينة في اختلال الخلية. إجراء تحلل كرر 3 مرات. فحص تحت المجهر لضمان بقاء أقل من 10٪ سليمة.
        ملاحظة: أساليب أخرى لليز الخلايا، مثل الخرز الزجاجي، وما إلى ذلك لم يتم فحصها بدقة لهذا النظام، ومع ذلك يمكن للمستخدم العثور على مثل أسلوب بديل مناسب.
    4. الطرد المركزي مواد تحلل الخلايا في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة 2،000 x ج لمدة 20 دقيقة. جمع طاف والتخلص من بيليه. تقسيم طاف بين 20 الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية في 125،000 x ج في أعلى الجدول ultracentrifuge.
    5. إزالة وتجاهل طاف، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه، وتخزين الكريات في نفس الأنابيب في -80 درجة مئوية لمدة أقل من 2 أشهر حتى استخدامها، أو الاحتفاظ بها على الجليد والاستمرار في عملية تنقية الفور.
  2. CFTR الإذابة
    1. الحصول على 1-4 S و 9 الكريات غشاء الخام الطازجة أو المجمدة و resuspend كل في 1 مل من العازلة 1 (2٪ منظمات المزارعين -choline؛ انظر الجدول 1 وصفة كاملة) في 4 درجات مئوية على الجليد، وذلك باستخدام إبرة G 25 و 1 مل حقنة حتى الحل هو متجانسة من العين بدون مرئية كتل غشاء الخلية. حيث بيليه أكثر من واحد يجري تذوب، ومواصلة لعلاج كل عينة فقا للتعليمات لبيليه واحد أدناه في موازاة ذلك، تجميع العينات في خطوة 1.3.2.
    2. حل 1 مصغرة قرص مثبط البروتياز في 1 مل من العازلة 2 (10 ملي إيميدازول؛ انظر الجدول 1) التي تفتقر منظمات المزارعين -choline 14 المنظفات (مثبطات الأنزيم البروتيني هي 10X المزيد من تناسقتصنيف من التخفيف الموصى بها في هذه المرحلة) وإضافة 100 ميكرولتر من معلق بيليه غشاء الخام (مثبطات الأنزيم البروتيني هي في التخفيف الموصى بها في هذه المرحلة). تعيين على الجليد لمدة 45-60 دقيقة مع خلط من قبل انقلاب 5 مرات كل 5 دقائق.
    3. الطرد المركزي معلق بيليه غشاء الخام في أعلى الجدول نابذة فائقة السرعة لمدة 25 دقيقة في 125،000 x ج و 4 ° C. الاحتفاظ طاف، والذي يحتوي CFTR تذوب وتجاهل بيليه.
  3. العمود ملزمة، الفسفرة وشطف
    1. غسل 400 ميكرولتر من النيكل وNTA (nitrilotriacetic الحمضيه) الطين الاغاروز أو الراتنج تعادل مع 1 مل من العازلة 2 (10 ملي إيميدازول؛ انظر الجدول 1) التي تفتقر إلى المنظفات، لإزالة المذيبات والعازلة عند 4 درجة مئوية. تكرار غسل مرتين أكثر من ذلك.
    2. الجمع بين CFTR تذوب، وتبقى مثبط البروتياز (900 ميكرولتر) والراتنج النيكل (من 400 ميكرولتر الطين) إلى ما مجموعه 10 مل مع العازلة 2 (10 ملي إيميدازول؛ انظر الجدول 1) ثhich يفتقر إلى أي المنظفات المضافة. يتم تخفيف منظمات المزارعين -choline 14 تركيز بشكل فعال إلى 0.2٪ (ث / ت) في هذه الخطوة. إذا كان هناك أنابيب متعددة، تجميع جميع العينات التي تحتوي على CFTR يذوب، مثبطات الأنزيم البروتيني، الراتنج النيكل وNTA و 0.2٪ (ث / ت) منظمات المزارعين -choline-14 في هذه المرحلة. احتضان لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
    3. تمرير CFTR-مثبط البروتياز والنيكل NTA حل أسفل عمود صغير الفرز (الجدول 1) أو عمود فارغ ما يعادلها.
    4. غسل النيكل NTA الراتنج، والتي يتم الاحتفاظ في العمود، مع 4 مل لكل بيليه الأولي من الواق 3 (10 ملي إيميدازول + DDM؛ انظر الجدول 1) التي تفتقر منظمات المزارعين -choline 14 ولكن يحتوي على 1 ملم DDM (المنظفات مالتوزيد دوديسيل)، في 4 درجات مئوية. إضافة المنظفات DDM لا يغير كثيرا من درجة الحموضة من هذا المخزن المؤقت.
    5. يعد حل PKA-MgATP بإضافة 25 ميكرولتر (5 ملي، التركيز النهائي) من MgATP، 2،500 U من معسكر تعتمد بروتين كيناز A، الوحيدات الحفاز (PKA) إلى 475 ميكرولتر من العازلة 3 (10 ملي إيميدازول + DDM؛ انظر الجدول 1) إلى العمود. الفوسفات البروتين عن طريق ختم نهاية الجزء السفلي من العمود مع قبعة أو بارافيلم، وإضافة 500 ميكرولتر من حل PKA-MgATP لكل بيليه الأولي المستخدمة.
    6. يحضن في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة مع خلط لطيف وإعادة تعليق من الراتنج باستخدام pipettor 1 مل كل 2 دقيقة للتأكد من أن PKA قد تأتي في اتصال مع كامل سطح النيكل NTA الراتنج.
    7. إزالة الغطاء وأزل الحل PKA / MgATP من العمود. غسل العمود مع 2 مل من العازلة 3 (10 ملي إيميدازول + DDM؛ انظر الجدول 1) في 4 درجات مئوية.
    8. مضاعفة عدد الكريات المستخدمة في التجربة من قبل 4. غسل العمود مع هذا العدد من مل من العازلة 4 (50 ملي إيميدازول + DDM؛ انظر الجدول 1) في 4 درجات مئوية، وذلك بإضافة 4 مل من العازلة إلى العمود، مما يسمح لل لها بالتدفق من خلال وعلى الفور مضيفا المقبلة قسامة 4 مل إلى العمود.
    9. أزل البروتين عن طريق تمرير 1 مل من العازلة 5 (600 ملي إيميدازول + DDM؛ انظر الجدول 1) في 4 درجات مئوية في بيليه الأولي المستخدمة من خلال عمود، 1 مل في وقت دون توقف للسماح العمود لتجف، و جمع شطافة كلها تحتوي على CFTR تنقيته في أنبوب واحد.
    10. التركيز عينة البروتين لإزالة إيميدازول وانخفاض وتدهور الوزن الجزيئي المنتجات باستخدام جهاز فلتر الطرد المركزي (100،000 الوزن الجزيئي قطع) مثل كما هو موضح في الجدول المواد والمعدات أو جهاز مماثل آخر، في ما مجموعه 10 مل العازلة 6 (75 ملي KI + DDM؛ انظر الجدول 1) أو عازلة آخر يختاره تحتوي على 1 ملم DDM (مثل الواق 7 لالتجارب هروب رأس المال غير يوديد، 25 ملي HEPES + DDM؛ انظر الجدول 1)، عن طريق الطرد المركزي في 2،000 x ج و 4 ° C ل حوالي 20 دقيقة حتى يركز عينة إلى 200 ميكرولتر. تمييع العينة إلى 10 مل وكرر الخطوة التركيز.
      ملاحظة: في تجربتنا (غير منشورة)، إميدازول يتنهى بشكل كبيربت النشاط أتباز من CFTR وينبغي إزالتها في هذه الخطوة من قبل التخفيف والتركيز على الأقل مرتين إذا كان سيتم استخدام العينة لقياس وظيفية.
    11. جمع المركزة CFTR تنقيته. الحفاظ على 4 درجات مئوية في وجود من العازلة DDM حتى استخدام في غضون 1-2 أيام أو الاستمرار على الفور إلى الخطوة إعادة. لا تجمد البروتين النقي، كما في تجربتنا نلاحظ انخفاض النشاط.

2. إعادة تشكيل CFTR

  1. إعداد الدهون
    ملاحظة: تم تشكيلها CFTR بنجاح في البيض PC، POPC، 2: 1 (ث / ث) PC البيض: POPC (1: 1 ث / ث) خليط أو مزيج من PE: PS: PC: إرغوستيرول، 5: 2 : 2: 1 (ث / ث).
    1. للتجارب هروب رأس المال يوديد وجافة 5 ملغ من البيض PC (200 ميكرولتر من 25 ملغ / مل الأسهم، انظر جدول المواد والمعدات) تحت تيار من غاز الأرجون لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في بيركس أو قوي الآخر (غير البورسليكات- ) أنبوب زجاجي.
    2. باستخدام الامتصاصية في 280 نانومتر، وهو ELISA لssay أو أي طريقة أخرى، ويقدر تركيز البروتين المنقى عينة CFTR. للتجارب هروب رأس المال يوديد مع wildtype CFTR، واستخدام البروتين: نسبة الدهون 1: 300-1: 3،000 (ث / ث) لإنتاج إشارة كافية. لG551D- وF508del-CFTR، واستخدام البروتين: نسبة الدهون ما يقرب من 1: 200-1: 1،200 (ث / ث) من أجل الكشف عن النشاط هروب رأس المال.
    3. تحسين البروتين: الدهون نسبة لكل نظام معين. حساب حجم البروتين المنقى المطلوبة. حساب حجم عازلة مع 1 ملم DDM اللازمة لجعل الحجم النهائي من 1 مل، أي 1 مل - (حجم محلول البروتين مطلوب) = حجم العازلة.
      1. إضافة حجم المحسوبة لنظام المخزن المطلوب مع 1 ملم DDM إلى الدهون المجففة (ولكن لا تضيف البروتين CFTR في هذا الوقت) وتغطية أنبوب زجاجي مع بارافيلم. للتجارب هروب رأس المال يوديد، و resuspend الدهون في الواق 6 (75 ملم KI + DDM؛ انظر الجدول 1). لتجارب أخرى resuspend في الواق 8 (25 ملي HEPES + DDM، انظرالجدول 1) أو لآخر المخزن المؤقت الداخلي المطلوب تحتوي على 1 ملم DDM.
      2. دوامة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للمساعدة في وقف الدهون في المخزن المؤقت DDM. بالتناوب، تسخين العينة إلى 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة قبل vortexing ل.
    4. تعليق الدهون مرارا وتكرارا في درجة حرارة الغرفة مع حقنة 1 مل و 25 G الإبرة حتى أي فيلم الدهون مرئيا على جانبي الأنبوب. تجنب حقن الهواء إلى الحل الذي من شأنه أن تنتج فقاعات غرامة وتساعد في أكسدة يوديد والدهون.
    5. يصوتن الدهون العالقة في بارافيلم تغطية أنبوب لانفجار 20 ثانية في الجليد sonicator باث تحتوي على، ومن ثم نقل على الفور الى الثلج لمدة 1 دقيقة. كرر 3 مرات.
      ملاحظة: صوتنة مكثفة تتحول حلول يوديد الصفراء بسبب الأكسدة. لذلك تجنب صوتنة المفرط. رصد عينة لإجراء تغييرات اللون. إذا لاحظت تغيير اللون، تجاهل العينة وإعداد مرة أخرى. التغيير في اللون نتيجة لأكسدة بعضان يوديد يؤدي إلى أكسدة الدهون تحت نفس الظروف. سوف تشريد الهواء من أنبوب مع غاز الأرجون قبل sonicating الحل تساعد على منع أكسدة الدهون ويوديد. صوتنة الشديد قد تكسر نوعية رديئة أو أنابيب زجاجية خدش مما أدى إلى فقدان العينة.
    6. إضافة حجم CFTR تنقية المحسوبة في الخطوة 2.1.3 لعينة من المادة الدهنية sonicated إلى تحقيق الحجم النهائي من 1 مل. مزيج من البروتين مع الحل الدهون والمنظفات بواسطة إعادة تعليق 10 مرات مع 25 G إبرة وحقنة 1 مل.
    7. ضبط الدهون والبروتين عينة على الجليد لمدة 30 دقيقة مع دوامات من أنبوب لخلط 5 مرات كل 5 دقائق.
  2. إعداد العمود ملزم المنظفات
    1. الحصول على استخدام مرة واحدة التجاري ملزم المنظفات تدور العمود (انظر الجدول من المواد والمعدات) بسعة حجم 1 مل وكسر علامة التبويب السفلي لبدء العمود يتدفق.
    2. أجهزة الطرد المركزي العمود لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة تخزين بuffer، وتجاهل هذا المخزن المؤقت.
    3. إضافة 5 مل من العازلة 7 (75 ملم KI، انظر الجدول 1) إلى العمود ثم الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 4 دقائق إلى أزل غسل العازلة. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر ليصبح المجموع 3 يغسل لإزالة كل آثار المخزن المؤقت التخزين. تجاهل كل التدفق من خلال.
      ملاحظة: ومن الأهمية بمكان أن المخزن المؤقت تستخدم لغسل العمود لا يحتوي DDM أو أي منظف آخر. العمود لديه قدرة محدودة ملزمة لالمنظفات وإذا تم استخدام العازلة التي تحتوي على المنظفات، وسيكون العمود غير فعالة في إزالة المنظفات من العينة البروتين الدهني المنظفات.
    4. قسامة بعناية كل مل 1 من العينة للدهون، المنظفات البروتين على الجزء العلوي من الراتنج العمود واحتضان عينة في الجزء العلوي من العمود لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. الطرد المركزي العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق عند 2،000 x ج وجمع عينة proteoliposome غائم في نظيفة 1.5 أو 2 مل microfuge أنبوب أو أنبوب زجاجي ووضع سامسبيل على الجليد.
    6. جمع المتبقية proteoliposomes في العمود بإضافة 200 ميكرولتر من العازلة 7 (75 ملم KI، الجدول رقم 1) أو عازلة الآخر (دون المنظفات) إلى الجزء العلوي من العمود وكرر الخطوة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة.
    7. إضافة شطافة الثانية على عينة proteoliposome إذا كان يبدو غائما.
    8. تخزين العينة في 4 درجات مئوية خلال الليل أو استخدامها على الفور لقياس هروب رأس المال يوديد.

3. القياسات يوديد الدفق لتنقية، CFTR اعادة تشكيل

  1. جيل من التدرج يوديد عبر الغشاء proteoliposomal
    1. حبات قبل تضخم Sephadex G50 في الواق 9 (75 ملي K-حمض الغلوتاميك، الغلوتامات البوتاسيوم، انظر الجدول 1)، (حوالي 5 غ حبات جافة في 50 مل عازلة) أو عازلة الخارجي المطلوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على الأقل أو على 4 ° C بين عشية وضحاها.
    2. إعداد 4 أعمدة Sephadex G50 المشبعة في الواق 9 (75 ملي K-حمض الغلوتاميك، انظر الجدول 1) أو غيرهاعازلة في الأعمدة فحص صغيرة عن طريق تحميل الراتنج على الأقل ¾ كامل في العمود.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق عند 2،000 x ج لإزالة عازلة الزائدة من الراتنج. ينبغي أن يكون هناك ما يقرب من 2.25 مل من معبأة الراتنج رطب في العمود في نهاية الخطوة الطرد المركزي.
      ملاحظة: الراتنج يجب رطب طفيفة ولكن ليس مغمورة في سائل، وينبغي أن تدور موجز لاحق لم أزل كميات كبيرة من العازلة. فمن الأهمية بمكان لشطف الناجح لعينة proteoliposome أن الراتنج العمود ليست رطبة جدا ولا جافة جدا ويمكن أن يحتاج المستخدم لهذه التجربة مع الأعمدة من أجل أن تصبح مألوفة مع الظروف الصرف عازلة الأكثر نجاحا.
    4. إضافة بعناية 125-150 ميكرولتر من proteoliposome العينة إلى أعلى كل عمود وأجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق عند 2،000 ز س.
    5. تجمع proteoliposome eluates معا للاستخدام الفوري في هروب رأس المال يوديد أو تجارب أخرى.
      ملاحظة: حجم مزال من كل عمود يجب أن يكون تقريباوينبغي أن يكون 150 ميكرولتر والعينة غائم إلى حد ما، ولكن أقل غائم من العينة الأصلية. كميات أكبر أو eluates واضحة تشير إلى أن الأعمدة لم يتم تجفيفها بما فيه الكفاية، أو قد جفت أكثر من اللازم، على التوالي، وسوف لا تؤدي إلى تجربة يوديد هروب رأس المال ناجحة.
  2. يوديد هروب رأس المال الفحص
    1. غسل إلكترود الجزئي الانتقائي يوديد (جدول المواد والمعدات) على نطاق واسع مع دي المتأينة المياه، ومن ثم احتضان لمدة 20 دقيقة قبل التجربة في الواق 10 (15 ميكرومتر KI، انظر الجدول 1). غسل الكهربائي مرة أخرى على نطاق واسع مع دي المتأينة المياه.
    2. إضافة 150 ميكرولتر من المخدرات (20 ميكرومتر تركيز نموذجي لإنتاج تركيز النهائي من 10 ميكرومتر في مقايسة) في الواق 9 (75 ملي K-حمض الغلوتاميك، انظر الجدول 1) أو مركبة في الواق 9 إلى بئر واحدة من لوحة 96-جيدا مع شريط برغوث ضجة صغيرة.
      1. ضمان عدم وجود فقاعات الحالية. استخدام غيض ماصة لإزالة طائشةالفقاعات. إذا كان يتم استخدام محلول الدواء، تأكد من أن تركيز DMSO النهائية في البئر هو أقل من 1٪ (ت / ت) (عادة 0.1-0.2٪ (ت / ت)).
    3. إضافة 150 ميكرولتر من إعادة تشكيل البروتين CFTR التي تم إنتاجها في القسم 3.1 في الواق 9 (75 ملي K-حمض الغلوتاميك، انظر الجدول 1) إلى البئر مع المخدرات أو العازلة، لإنتاج إجمالي حجم 300 ميكرولتر في البئر من لوحة.
    4. وضع لوحة 96-جيدا على لوحة ضجة ويقلب في 130 دورة في الدقيقة (أو بسرعة معتدلة من حوالي ¼ من الحد الأقصى للسرعة).
    5. إدراج غيض من يوديد القطب الانتقائي بعناية في البئر مع العينة بحيث غيض لا تلامس قاع البئر أو يجري ضرب من قبل بقضيب. تأكد من أن القطب إشارة، إذا منفصلة، ​​هو أيضا على اتصال مع الحل في البئر.
    6. اقتفاء أثر سجل باستخدام برنامج كمبيوتر محلية الصنع أو التجارية التي واجهات مع القطب (انظر الجدول المواد والمعدات اللازمة لمزيد من التفاصيل).استخدام معدل أخذ العينات من 2 هرتز، مع تصفية إشارة من خلال مرشح الترددات المنخفضة.
    7. السماح للعينة لكي تتوازن لمدة 5 دقائق لإنتاج خط الأساس شقة شقة مستقر، أو بالقرب منها أثناء التسجيل.
    8. إضافة 3 ميكرولتر MgATP (100 ملي الأسهم التي أعدت في DH 2 O وتعديلها لدرجة الحموضة 7 مع KOH، 1 ملم التركيز النهائي) على عينة لتنشيط البروتين. السماح ~ 5 دقائق للوصول إلى خط الأساس مستقر الجديد. ضبط دائما الرقم الهيدروجيني للملي MgATP الأسهم 100 إلى محايد قبل استخدامها لتجنب التغيرات في الرقم الهيدروجيني للعازلة الخارجي.
    9. إضافة 3 ميكرولتر من valinomycin الأسهم (2 ميكرومتر، و 20 نانومتر تركيز النهائي) على عينة إلى إنتقل التغيرات في فرق الجهد التي تولدها-يوديد انتقائية تصرف من خلال CFTR. تسجيل المنحدر تناقص (النقص في بالسيارات) وذلك بسبب النشاط يوديد هروب رأس المال بوساطة CFTR لمدة 5 دقائق على الأقل.
    10. للتأكد من أن محاصرة من يوديد في التجويف proteoliposome كان كافيا، إضافة 3 ميكرولتر من 10٪ (V / V) تريتون X-100 للعينة. Significanر، والإفراج الفوري يوديد يشير إلى أن يوديد كافية وقد حوصر في الحويصلات بحيث محاصرة لم يكن العامل المحدد للتغييرات في منحدر المحددة في 3.2.9 وإنما النشاط بوساطة CFTR.
    11. غسل شريط الكهربائي ويقلب جيدا مع دي المتأينة المياه بعد المعالجة من العينات مع المخدرات أو مع تريتون X-100 لضمان أن يتم نقل جميع آثار هذه الكواشف لتجنب تلوث العينة القادمة.
    12. إعداد سلسلة من تركيزات KI مخفف في مكرومولي لمجموعة nanomolar في الواق 9 (K-حمض الغلوتاميك العازلة، انظر الجدول 1). تسجيل استجابة بالسيارات من القطب إلى تركيز كل من 0 إلى أعلى تركيز إعدادها. بناء منحنى القياسية حيث يتم رسم استجابة التحقيق (بالسيارات) مقابل سجل للتركيز يوديد المولي. استخدام المنحنى القياسي لتحويل استجابة بالسيارات لجنة التحقيق أثناء التجربة هروب رأس المال إلى تركيز يوديد الإفراج عنه.
      ملاحظة: إعداد لئيم المعايرةهاء على أساس أسبوعي حتى هو مستخدم متأكدا من مدى سرعة الاستجابة للتغيرات التحقيق. سوف يكون هناك انحراف في الاستجابة والحساسية لجنة التحقيق مع مرور الوقت. كما تتراوح أعمارهم التحقيق، فإن استجابة تتحلل. هذا قد تلغى جزئيا عن طريق تغيير الحلول الداخلية بشكل دوري والغسيل واسعة من تلميح التحقيق في المياه بعد الاستخدام، الأمر الذي يحد من المرجح انضمام جزيئات على سطح التحقيق.
    13. تحديد متوسط ​​المنحدر من خط تركيز مقابل مؤامرة الوقت لكل عينة proteoliposome لمدة 30 ثانية قبل الماضي إضافة MgATP، وبعد إضافة valinomycin ولكن قبل إضافة تريتون X-100. طرح المنحدر الأساسي من valinomycin لتحديد النشاط يوديد هروب رأس المال بوساطة CFTR لأن العينة.

النتائج

الموضحة في هذا الكتاب مكتوبة هي وسائل لتنقية، إعادة تشكيل وقياس النشاط قناة المنظم من البروتين CFTR الشكل يظهر 1A سير العمل لتنقية، وإجراءات إعادة هروب رأس المال يوديد. وتظهر أساليب لإعادة النشاط وقناة القياسات بواسطة تدفق يوديد أيضا بمزيد من التفصي?...

Discussion

كان هناك عدد محدود من بروتوكولات تنقية لكامل طول والوظيفية العزلة CFTR، من مجموعة متنوعة من أنظمة overexpression الخلوية. الطريقة الموصوفة هنا هو مفيد لأنه يسمح تنقية السريع لWT-CFTR أو تخصيب عال من F508del- وG551D-CFTR بكميات معتدلة غير وظيفية للغاية في المقايسات بما في ذلك أتباز والقي?...

Disclosures

يعترف واضعو نصيحة الدكتور Mohabir Ramjeesingh خلال تطوير أساليب تنقية موضح هنا. ودعمت هذه الدراسات التي المنح التشغيل لمجلس الرؤساء التنفيذيين من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) والتليف الكيسي كندا (CFC). وأيد PDWE في جزء من جوائز زمالة من خلال CIHR وCFC. المؤلفون تعترف توفير مصحح، potentiator والمركبات المانع من الدكتور R. الجسور (جامعة روزاليند الطب والعلوم) وتوزيعها من قبل التليف الكيسي مؤسسة التداوي (CFFT). المؤلفون أيضا يعترف الخدمة المتميزة من قبل بايلور مرفق خلية الثقافة (NIH منحة P30 CA125123) في التعبير عن بالوزن والبروتين CFTR الطافرة باستخدام نظام الفيروسة العصوية. والخاملة VX-770 التناظرية، V-09-1188، كان هدية من فيرتكس الصيدلة.

Acknowledgements

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
fos-choline 14 detergentAnatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)F312Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tabletsRoche (www.roche-applied-science.com)04 693 132 001EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack Roche (www.roche-applied-science.com)05 892 791 001
Ni-NTA AgaroseQaigen GmbH1018240
Fisherbrand Screening columnsFisher Healthcare11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100KMillipore (www.millipore.com)UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic SubunitNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken EggAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840051C
POPCAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)850457C
PS, Porcine BrainAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840032CCFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken EggAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)841118C
ErgosterolSigma (www.sigmaaldrich.com)45480
Pierce Detergent removal spin columnThermo Scientific877791 ml capacity columns
valinomycinSigma (www.sigmaaldrich.com)V-0627
VX-770 (ivacaftor)Selleck ChemicalsS1144
iodide selective microelectrodeLazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)LIS-146ICM 
 
 
 
 
 
[header]
Clampex 8.1 softwareAxon Instruments (www.axon.com)we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)LIS-146LICM-XSLazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir barsBig Science Inc (www.stirbars.com)SBM-0502-CMBchoose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fineGE Health Care (www.gelifesciences.com)17-0042-01
SonicatorLaboratory Supplies Co, Inc.G112SP1GBath sonicators from other manufacturers should also be suitable

References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  5. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
  6. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
  7. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
  8. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
  9. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  10. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
  11. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  12. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
  13. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
  14. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
  15. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
  16. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  17. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  18. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
  19. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
  20. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
  21. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
  22. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
  23. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
  24. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
  25. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
  26. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
  27. Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
  28. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
  29. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
  30. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
  31. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  32. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
  33. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
  34. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
  35. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97 CFTR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved