Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

Résumé

Décrit ici est un procédé rapide et efficace pour la reconstitution fonctionnelle de type sauvage purifiée et une protéine de CFTR mutante qui conserve l'activité de ce canal de chlorure, qui est défectueux dans la fibrose kystique. Efflux d'iodure de protéoliposomes reconstituées médiées par CFTR permet des études de l'activité du canal et les effets de petites molécules.

Résumé

La fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) est un élément de formation de canal unique de l'ATP Binding Cassette (ABC) superfamille des transporteurs. L'activité du canal chlorure nucléotidique et la phosphorylation dépendant de la CFTR a été étudié fréquemment dans des systèmes de cellules entières et que les canaux individuels dans patches membranaires excisées. De nombreuses mutations de fibrose kystique qui causent ont été montré de modification de cette activité. Bien qu'un petit nombre de protocoles de purification ont été publiées, un procédé de reconstitution rapide qui conserve l'activité de canal et un procédé approprié pour l'étude de l'activité du canal de la population dans un système purifié ont fait défaut. Ici méthodes rapides sont décrites pour la purification et la reconstitution fonctionnelle de la protéine CFTR pleine longueur dans des protéoliposomes de composition lipidique défini qui conserve une activité de canal à l'halogénure réglementé. Cette méthode de reconstitution avec un nouvel essai à base de flux de l'activité de canal est un système adapté pourétudier les propriétés du canal de la population de CFTR sauvage et les mutants pathogènes F508del- et G551D-CFTR. Plus précisément, le procédé est utile pour l'étude des effets directs de la phosphorylation, les nucleotides et les petites molécules telles que potentialisateurs et des inhibiteurs sur l'activité du canal CFTR. Les méthodes sont également prêtent à l'étude d'autres canaux / transporteurs membranaires pour les substrats anioniques.

Introduction

transport de chlorure à travers les membranes apicales des cellules épithéliales dans les tissus tels que poumons, intestins, le pancréas et les glandes sudoripares est principalement médiée par la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR), un ATP et membre de phosphorylation réglementés de l'ABC (ATP Binding Cassette) C sous-famille de protéines membranaires (revue dans ^1). Comme d'autres membres de la sous-famille SCBA, CFTR est un grand multi-enjambant protéine membranaire intégrale qui se lie l'ATP à deux sites de liaison de nucleotides formée à l'interface de ses domaines de nucleotides de liaison (NBD), où il possède une activité d'ATPase modeste à une seule place. Cependant, contrairement à d'autres membres de la sous-famille ABCC, CFTR a évolué comme un canal Cl réglementé unique, plutôt que comme un soluté transporteur actif.

Des mutations dans la cause de la fibrose kystique CFTR, une maladie affectant plusieurs organes, y compris les poumons, tractus gastro-intestinal, du pancréas et des voies de reproduction, conduisant à morbidité et de la mortalité chez les jeunes adultes. Maladie pulmonaire représente généralement au début de la mortalité et de la fibrose kystique dans la plupart des cas est provoqué par la perte de fonction de la protéine CFTR à la surface de l'épithélium des voies aériennes conductrices. L'absence de l'activité des canaux chlorure CFTR entraîne une réduction à la fois de Cl ^- et de circulation de l'eau à travers l'épithélium de surface pour modifier la couche de fluide sur la surface apicale de l'épithélium cilié respiratoire. Il en résulte un liquide de surface des voies respiratoires visqueux qui altère la capacité des cellules epitheliales ciliées des voies respiratoires à des agents pathogènes efficacement claires sur les voies respiratoires. En conséquence, la plupart des patients atteints de mucoviscidose souffrent d'épisodes récurrents d'infection pulmonaire et une atteinte des poumons due à l'inflammation.

Comme prévu, les études du mécanisme d'action de la protéine CFTR normale concentrent principalement sur les études électrophysiologiques détaillées de son activité voie de fenêtrage. Des études simples de canal ont montré directement que les fonctions de CFTR comme PKA-dépendante Cl^- Canal qui possède une porte ATP réglementé ^2. Études électrophysiologiques détaillés fournissent beaucoup d'informations sur les canaux CFTR simples ^1,3, mais il peut y avoir des préoccupations quant à savoir si les caractéristiques d'un seul canal particulier qui a été étudié est le reflet de l'ensemble de la population de canaux CFTR et donc le seul canal résultats doivent toujours être considérés ainsi que des méthodes pour étudier la population macroscopique. Dosage direct de l'activité de canal de population de CFTR purifié a le potentiel de donner un aperçu du défaut moléculaire associée à des mutations pathogènes et à conduire la découverte de modulateurs chimiques qui la réparation des protéines CFTR mutant. À ce jour, il ya plus de 1900 mutations différentes dans CFTR pensé pour provoquer la fibrose kystique ^4. La mutation majeure, F508del-CFTR, trouvé sur au moins un allèle dans environ 90% des patients en Amérique du Nord et en Europe conduit à un mauvais repliement des protéinesnd rétention dans le réticulum endoplasmique ^5. F508del-CFTR a aussi d'autres conséquences, y compris l'activité du canal défectueux ^6-9. L'absence résultante de la protéine CFTR à la surface de cellule est associée à une maladie grave. G551D-CFTR, la mutation moins fréquente, est considérée comme étant encore correctement pliée est dysfonctionnel comme un canal chlorure à la surface de la cellule ^6. Le développement de petits correcteurs de molécules et potentialisateurs a pour but de corriger de pliage et / ou le trafic de mutants tels que F508del-CFTR à la surface cellulaire, et potentialisant ou en augmentant l'activité de canal de mutations telles que G551D lorsqu'ils sont présents sur la surface des cellules, respectivement . Alors que les correcteurs VX-809 et VX-661 (ne sont pas encore approuvés pour une utilisation chez les patients, le potentialisateur Kalydeco (ivacaftor; VX-770) est utilisé à 150 mg toutes les 12 h chez les patients FC> 6 ans avec au moins un G551D -CFTR mutation, et plus récemment pour les patients avec l'un des G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pet G1349D. Kalydeco est à la fois sûr et des résultats dans l'amélioration des mesures cliniques de la maladie CF ^10, mais le mécanisme d'action de cette petite molécule a été mal compris au moment de l'approbation de la FDA pour une utilisation chez les patients.

Une poignée de méthodes de purification CFTR ont été décrits précédemment ^2,11-18, dont beaucoup exigent une longueur considérable de temps pour terminer. Dans une publication récente ^19, un procédé de purification et reconstitution rapide unique a été décrit pour la protéine CFTR surexprimé dans le S f système d'expression neuf cellulaire, et cette protéine purifiée dans les systèmes lipidiques définies a été utilisé pour développer un essai de l'activité des canaux à l'halogénure d'CFTR pour une population de CFTR molécules. Le dosage récapitule les effets connus de phosphorylation, des nucléotides et des inhibiteurs sur la fonction de la protéine CFTR. Le système a été utilisé pour interroger les effets de la potentialisateur VX-770 / Kalydeco sur poids (-type sauvage), F508del- et G551D-CFTR et il a été montré pour la premièretemps que le médicament interagit directement avec la protéine CFTR à potentialiser son activité de canal de façon ATP-indépendant, ce qui démontre l'utilité et l'application de ces méthodes pour l'étude de l'interaction de la protéine CFTR et mutants avec des nucleotides et des petites molécules à partir d'un point de vue de la population de répondre à des questions cliniquement pertinentes sur la protéine. Les procédés ont également été utilisés pour étudier d'autres molécules de potentialisateur et de leurs dérivés ^20, ainsi que les effets d'un correcteur de petite molécule de l'activité de la protéine ^21.

des dosages d'efflux ont été utilisées dans de nombreuses études précédemment pour étudier l'activité de mutants CFTR et les effets des composés CFTR-modulateurs sur son activité, y compris des dosages de cellules entières en utilisant des électrodes, des traceurs radioactifs et des fluorophores ^22,23, des vésicules membranaires avec électrodes sélectives d'ions ²⁴ , et purifié CFTR reconstitué avec des traceurs radioactifs ^25. Cependant thl'utilisation de l'e des électrodes sélectives d'ions pour étudier CFTR reconstitué purifié a été rapporté récemment ^19. Une adaptation de la méthode actuelle a été utilisé pour la reconstitution et la caractérisation fonctionnelle de deux protéines membranaires de Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène CF commun. Reconstitution de Alge purifié la protéine de la membrane externe couplé avec des mesures d'efflux iodure ont été utilisés pour soutenir un modèle pour les tensioactifs anioniques alginate la sécrétion par ce transporteur ^26. La reconstitution et les mesures de efflux d'iodure ont été appliqués à la protéine purifiée wzx, ce qui a permis un modèle à proposer qui suggère un mécanisme de H ⁺ antiport dépendante de la translocation de lipide d'oligosaccharide liée à travers la membrane bactérienne interne de ²⁷ cette protéine. Dans les deux cas iodure a été utilisé comme un substitut pour le substrat anionique, mais à débit plus faible que l'on pourrait attendre d'un substrat natif. Le procédé peut être adapté pour l'adaptation à d'autres protéines ayant des cconduction des voies de transport ou pour des substrats anioniques ationic.

Voici une procédure de purification rapide est décrit pour la protéine CFTR et sa reconstitution dans des protéoliposomes de lipide défini. La procédure de reconstitution rapide peut facilement être adapté pour une utilisation avec CFTR purifié par d'autres procédés, à condition que le type de détergent utilisé dans la purification se prête à l'élimination par des méthodes utilisées ici ou peut être remplacé par un détergent approprié avant la procédure de reconstitution. Procédé d'efflux d'iodure pour la mesure de l'activité du canal CFTR de protéine purifiée et reconstituée est décrit en détail et certains résultats typiques qui peuvent être obtenus par cette méthode sont présentés.

Protocole

1. Purification de la protéine CFTR

NOTE: Se il vous plaît voir le tableau des matériaux et équipements pour une liste du matériel et des matériaux utilisés dans ce protocole. Il existe un protocole détaillé pour la surexpression de l'homme WT-CFTR et des mutants dans le S f système d'expression 9-baculovirus ^17,28. Surexpriment la protéine CFTR et préparer des pastilles de S f 9 cellules selon ce protocole.

1. Préparation membranaire brut
   1. Obtenir un état ​​frais ou décongeler une cellule Sf 9 culot congelé à partir d'une culture de 500 ml de cellules sur-exprimant la wildtype-, F508del- protéine, ou G551D-CFTR avec un C-terminal Son -tag _10, cultivés par des procédés de culture cellulaire standard, ^17,28, comme décrit précédemment. Les culots cellulaires auront un volume d'environ 5 ml et un poids humide d'environ 5 g.
   2. Remettre en suspension les cellules Sf 9 dans 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 avec cocktail inhibiteur de protease (1 comprimé pour 50 ml) à 4 ° C, en assurant laéchantillon apparaît visuellement homogène et sans grumeaux de cellules restent.
   3. Lyse des cellules en utilisant un perturbateur cellule à haute pression (Table des matières et équipements), atteignant un minimum de 10 000 psi (de préférence 15.000-20.000 psi) pendant 2 min par passage. Conserver l'échantillon à 4 ° C pendant la lyse.
      1. Recueillir l'échantillon dans un tube sur la glace après la période de lyse puis recharger immédiatement l'échantillon dans le perturbateur de la cellule. Procédure de lyse Répétez trois fois. Examiner au microscope pour assurer au moins 10% restent intactes.
         NOTE: d'autres méthodes pour la lyse des cellules, telles que des perles de verre, etc. ne ont pas été examinées avec rigueur pour ce système, mais un utilisateur peut trouver une telle autre méthode appropriée.
   4. Centrifugeuse matériau de lyse de cellules à 4 ° C dans une centrifugeuse à grande vitesse à 2000 xg pendant 20 min. Recueillir le surnageant et jeter le culot. Divisez le surnageant entre 20 tubes et centrifuger les échantillons pendant 1 heure à 4 ° C à 125 000 xg dans une table ultracentrifuge.
   5. Retirer et jeter le surnageant, en faisant attention de ne pas perturber le culot, et de boulettes de magasin dans les mêmes tubes à -80 ° C pendant moins de deux mois jusqu'à l'utilisation, ou de conserver sur de la glace et continuer avec la purification immédiatement.
2. CFTR solubilisation
   1. Obtenir 1-4 S f 9 culots membranaires brut frais ou congelés et remettre chacun dans 1 ml de tampon 1 (2% fos -choline; voir le tableau 1 pour la recette complète) à 4 ° C sur la glace, en utilisant une aiguille 25 G et une ml seringue jusqu'à ce que la solution est homogène à l'oeil nu sans grumeaux visibles de la membrane cellulaire. Lorsque plus d'une pastille est d'être solubilisé, continuer à traiter chaque échantillon par les instructions pour une seule pastille ci-dessous en parallèle, mettre en commun les échantillons à l'étape 1.3.2.
   2. Dissoudre une mini-comprimé d'inhibiteur de protease dans 1 ml de tampon 2 (10 mM imidazole; voir Tableau 1) qui est dépourvu de détergent 14 fos (inhibiteurs de la protéase sont 10 fois plus concentclassé que leur dilution recommandée à ce stade) et ajouter 100 pi à le culot membranaire brut remis en suspension (inhibiteurs de la protéase sont à leur dilution recommandée à ce stade). Situé sur la glace pendant 45 à 60 min en mélangeant par inversion 5 fois toutes les 5 min.
   3. Centrifugeuse remis en suspension brut culot de membrane dans un top ultracentrifugation de table pendant 25 min à 125 000 xg et 4 ° C. Conserver le surnageant, qui contient CFTR solubilisé et jeter le culot.
3. Colonne de liaison, la phosphorylation et l'élution
   1. Laver 400 ul de nickel-NTA (acide nitrilotriacétique) suspension d'agarose ou de résine équivalente à 1 ml de tampon 2 (10 mM imidazole; voir Tableau 1) qui est dépourvu de détergent, pour éliminer le solvant et le tampon à 4 ° C. Répétez lavage deux fois de plus.
   2. Moissonneuse CFTR solubilisé, inhibiteur de protease restante (900 ul) et de la résine de nickel (à partir de 400 ul de suspension) pour un total de 10 ml avec du tampon 2 (10 mM d'imidazole; voir le tableau 1) wHICH manque de détergent ajouté. Les fos de 14 concentration est effectivement diluée à 0,2% (p / v) à cette étape. Se il ya plusieurs tubes, en commun tous les échantillons contenant CFTR solubilisé, les inhibiteurs de protéase, de la résine de nickel-NTA et 0,2% (p / v) fos -choline-14 à ce stade. Incuber pendant 60 min à 4 ° C sous agitation douce.
   3. Passez solution CFTR-inhibiteur de la protéase-nickel NTA bas une petite colonne de dépistage (tableau 1) ou une colonne vide équivalent.
   4. Laver la résine NTA de nickel, qui est retenu dans la colonne avec 4 ml par culot initial de tampon 3 (10 mM d'imidazole + DDM; voir Tableau 1) qui est dépourvu fos -choline 14 mais contient 1 mM DDM (détergent maltoside de dodécyle), à 4 ° C. L'addition de détergent DDM ne modifie pas significativement le pH de ce tampon.
   5. Préparer la solution PKA-MgATP en ajoutant 25 ul (5 mM, concentration finale) de MgATP, 2500 U d'AMPc-dépendante protéine kinase A, sous-unité catalytique (PKA) à 475 ul de tampon de 3 mM d'imidazole (10 + DDM; voir tableau 1) à la colonne. Phosphoryler la protéine en scellant l'extrémité inférieure de la colonne avec un capuchon ou Parafilm, et en ajoutant 500 ul de solution PKA-MgATP pour chaque pastille initial utilisé.
   6. Incuber à température ambiante (20 ° C) pendant 20 minutes en mélangeant doucement et remise en suspension de la résine en utilisant une pipette de 1 ml toutes les 2 min pour se assurer que la PKA a été en contact avec toute la surface de la résine de nickel NTA.
   7. Retirer le couvercle et éluer la solution PKA / MgATP de la colonne. Laver la colonne avec 2 ml de tampon 3 (mM d'imidazole 10 + DDM; voir le tableau 1) à 4 ° C.
   8. Multiplier le nombre de pellets utilisés dans l'expérience par 4. Laver la colonne avec ce nombre de 4 ml de tampon (50 mM imidazole + DDM; voir le tableau 1) à 4 ° C, en ajoutant 4 ml de tampon à la colonne, permettant il se écouler à travers et immédiatement ajouter le suivant aliquote de 4 ml sur la colonne.
   9. Elute la protéine en passant (mM imidazole 600 + DDM; voir le tableau 1) 1 ml de tampon 5 à 4 ° C par pastille initial utilisé dans la colonne, 1 ml à la fois sans une pause pour permettre à la colonne sécher, et collecter l'ensemble éluat contenant la protéine CFTR purifié dans un seul tube.
   10. Concentrez-échantillon de protéine pour éliminer imidazole et une faible dégradation de poids moléculaire produits en utilisant un dispositif de filtration de la centrifugeuse (100 000 poids moléculaire de coupure) tel que décrit dans le tableau des matériaux et équipements ou tout autre dispositif similaire, dans un total de 10 ml de tampon 6 (75 mM KI + DDM; voir le tableau 1) ou d'un autre tampon de choix, contenant 1 mM DDM (tel qu'un tampon 7 pour des expériences d'efflux non-iodure, 25 mM de HEPES + DDM; voir tableau 1), par centrifugation à 2000 x g et 4 ° C pendant environ 20 min jusqu'à ce que l'échantillon se concentre à 200 ul. Diluer échantillon à 10 ml et répéter l'étape de concentration.
       NOTE: Dans notre expérience (non publié), imidazole significativement INHIles bits de l'activité d'ATPase de la protéine CFTR et doit être supprimé à cette étape par dilution et de concentration au moins deux fois si l'échantillon sera utilisé pour les mesures fonctionnelles.
   11. Recueillir CFTR purifié concentré. Conserver à 4 ° C en présence de tampon DDM jusqu'à son utilisation dans les 1-2 jours ou continuer immédiatement à l'étape de reconstitution. Ne pas congeler la protéine purifiée, comme dans notre expérience, nous observons une activité réduite.

2. Reconstitution de CFTR

1. préparation lipidique
   REMARQUE: CFTR a été reconstitué avec succès dans Egg PC, POPC, 2: 1 (p / p) de PC d'oeuf: POPC (1: 1 en poids / poids) du mélange, ou un mélange de PE: PS: PC: ergostérol, 5: 2 : 2: 1 (p / p).
   1. Pour les expériences efflux d'iodure, sèche 5 mg de Egg PC (200 pi de 25 mg / ml ml, voir le tableau des matériaux et équipements) sous un courant de gaz d'argon pendant 20 min à température ambiante dans un pyrex ou autre solide (non-borosilicate ) tube de verre.
   2. Utilisation de l'absorbance à 280 nm, un test ELISA aéssayé ou toute autre méthode, estimer la concentration de l'échantillon de protéine de CFTR purifiée. Pour les expériences avec les efflux d'iodure CFTR sauvage, en utilisant un rapport protéine: lipide de 1: 300 à 1: 3000 (p / p) pour produire un signal suffisant. Pour G551D- et F508del-CFTR, utiliser un rapport protéine: lipide d'environ 1: 200 à 1: 1200 (p / p), afin de détecter l'activité d'efflux.
   3. Optimiser la protéine: lipide ratio pour chaque système particulier. Calculer le volume de protéine purifiée nécessaire. Calculer le volume de tampon avec 1 mM DDM requis pour obtenir un volume final de 1 ml, soit 1 ml, - (volume de solution de protéine requise) = volume de tampon.
      1. Ajouter le volume calculé du système tampon désiré avec 1 mM DDM au lipide séchée (mais ne pas ajouter de la protéine CFTR à cette époque) et couvrir le tube de verre avec du Parafilm. Pour les expériences efflux d'iodure, lipides dans le tampon 6 remettre en suspension (75 mM KI + DDM; voir le tableau 1). Pour les autres expériences remettre en suspension dans le tampon 8 (25 mM HEPES + DDM, voirTableau 1) ou un autre tampon interne désiré contenant 1 mM DDM.
      2. Vortex pendant 2 minutes à la température ambiante pour aider à la suspension du lipide dans le tampon DDM. En variante, chauffer l'échantillon à 37 ° C pendant 1-2 min avant vortex.
   4. Suspendre le lipide à plusieurs reprises à la température ambiante avec une seringue de 1 ml et 25 aiguille G jusqu'à ce que pas de film lipidique est visible sur les côtés du tube. Éviter d'injecter de l'air dans la solution qui produirait fines bulles et aider à oxydation de l'iodure et de lipides.
   5. Soniquer le lipide en suspension dans le tube de Parafilm couvert pour une salve de 20 secondes dans un bain de glace sonicateur contenant, puis transférer immédiatement à la glace pendant 1 min. Répétez 3 fois.
      REMARQUE: sonication intense tourne solutions iodure jaune due à l'oxydation. Il faut donc éviter sonication excessive. Surveiller l'échantillon pour les changements de couleur. Si un changement de couleur est à noter, jeter l'échantillon et de préparer à nouveau. La variation de couleur due à l'oxydation de certains desl'iodure conduirait à l'oxydation des lipides dans les mêmes conditions. Déplacement de l'air du tube avec du gaz argon avant soniquant la solution aidera à prévenir l'oxydation des lipides et iodure. Sonication intense peut briser mauvaise qualité ou des tubes de verre rayés entraînant la perte de l'échantillon.
   6. Ajouter le volume de CFTR purifié calculé à l'étape 2.1.3 pour l'échantillon de lipide soniqué à une atteindre un volume final de 1 ml. Mélanger la protéine avec la solution de lipide et d'un détergent fois par remise en suspension 10 avec une seringue à aiguille 25 G et 1 ml.
   7. Ensemble lipides et des protéines échantillon sur de la glace pendant 30 minutes en agitant de tube pour mélanger 5 fois toutes les 5 min.
2. Détergent contraignant Préparation de la colonne
   1. Obtenir une colonne à usage unique commerciale de détergent contraignant spin (voir le tableau des matériaux et équipements) avec une capacité de volume de 1 ml et de briser l'onglet du bas pour commencer la colonne qui coule.
   2. Centrifuger la colonne pendant 2 min à 2000 xg pour éliminer le stockage buffer, et jeter ce tampon.
   3. Ajouter 5 ml de tampon 7 (mM KI 75, voir le tableau 1) à la colonne et puis centrifuger à 200 g pendant 4 min pour éluer le tampon de lavage. Répéter cette étape deux fois de plus pour un total de trois lavages pour éliminer toute trace de la mémoire tampon de stockage. Jetez tous accréditives.
      NOTE: Il est essentiel que le tampon utilisé pour laver la colonne NE contient DDM ou tout autre détergent. La colonne a une capacité de liaison finie de détergent et si un tampon contenant un détergent est utilisé, la colonne sera inefficace pour éliminer le détergent de l'échantillon de protéine-lipide-détergent.
   4. Aliquoter soigneusement toutes les 1 ml de l'échantillon de lipide-détergent-protéine sur la partie supérieure de la colonne de résine et incuber l'échantillon dans la partie supérieure de la colonne pendant 2 minutes à température ambiante.
   5. Centrifuger l'échantillon à température ambiante pendant 4 min à 2000 xg et de recueillir l'échantillon de protéoliposome trouble dans un 1,5 ou 2 ml tube de centrifugeuse propre ou un tube de verre et placez le samPLE sur la glace.
   6. Recueillir protéoliposomes restantes dans la colonne par addition de 200 ul de tampon 7 (mM KI 75, tableau 1) ou d'un autre tampon (sans détergent) vers le haut de la colonne et répéter l'étape de centrifugation pendant 2 min.
   7. Ajouter la deuxième éluat à l'échantillon de protéoliposome se il semble trouble.
   8. Conserver l'échantillon à 4 ° C pendant la nuit ou utiliser immédiatement pour les mesures d'efflux iodure.

3. Mesures iodure efflux pour purifiée, CFTR reconstitué

1. La génération d'un gradient à travers la membrane de l'iodure de proteoliposomal
   1. Perles pré-houle Sephadex G50 dans le tampon neuf (75 mM K-Glu; glutamate de potassium, voir le tableau 1), (environ 5 g de billes sèches dans 50 ml de tampon) ou tampon externe souhaitée à la température ambiante pendant au moins 2 h ou à 4 ° C jusqu'au lendemain.
   2. Préparer 4 colonnes Sephadex G50 saturés dans le tampon neuf (75 mM K-Glu, voir le tableau 1) ou autretampon dans de petites colonnes de dépistage en chargeant la résine au moins ¾ dans la colonne.
   3. Centrifuger pendant 4 min à 2000 xg pour éliminer l'excès de tampon de la résine. Il devrait être d'environ 2,25 ml de résine hydratée emballé dans la colonne à la fin de l'étape de centrifugation.
      REMARQUE: Résine doit être légèrement hydratée mais pas immergé dans le liquide et une brève rotation ultérieure ne devrait pas éluer d'importants volumes de tampon. Il est essentiel à la réussite élution de l'échantillon de protéoliposome que la résine de la colonne ne est ni trop humide ni trop sec et l'utilisateur peut avoir besoin d'expérimenter avec les colonnes afin de se familiariser avec les conditions de change tampon le plus de succès.
   4. Ajouter délicatement 125-150 pi de protéoliposome échantillon en haut de chaque colonne et centrifuger pendant 4 min à 2000 x g.
   5. Piscine protéoliposome éluats ensemble pour une utilisation immédiate en efflux d'iodure ou d'autres expériences.
      NOTE: Le volume élue de chaque colonne doit être à peu près150 pi et l'échantillon devraient être quelque peu nuageux, mais moins trouble que l'échantillon original. Les volumes plus importants ou des éluats claires indiquent que les colonnes ne ont pas été suffisamment séchée, ou ont été séchés trop, respectivement, et ne donneront pas lieu à une expérience d'efflux d'iodure de succès.
2. Dosage d'efflux d'iodure de
   1. Laver une micro électrode sélective iodure (Table des matières et équipements) abondamment avec de l'eau déminéralisée, puis incuber pendant 20 minutes avant l'expérience dans le tampon 10 (15 uM KI, voir le tableau 1). Laver l'électrode à nouveau abondamment avec de l'eau déminéralisée.
   2. Ajouter 150 ul de médicament (20 pM concentration typique pour produire une concentration finale de 10 pM dans l'essai 9) dans un tampon (75 mM de K-Glu, voir le tableau 1) ou d'un véhicule dans un tampon neuf à un puits d'une plaque à 96 puits avec un petit bar puces d'agitation.
      1. Vérifiez qu'il n'y a pas de bulles présentes. Utiliser un embout de pipette pour enlever parasitebulles. Si une solution de médicament est utilisée, se assurer que la concentration finale de DMSO dans le puits est inférieure à 1% (v / v) (typiquement de 0,1 à 0,2% (v / v)).
   3. Ajouter 150 pi de reconstitué protéine CFTR qui a été produit à la section 3.1 dans le tampon neuf (75 mM K-Glu, voir le tableau 1) pour le bien avec un médicament ou un tampon, pour produire un volume total de 300 ul dans le puits de la plaque.
   4. Placer la plaque à 96 puits sur une plaque d'agitation et agiter à 130 rpm (ou à une vitesse modérée d'environ ¼ de la vitesse maximale).
   5. Insérer la pointe de l'iodure électrode sélective attentivement dans le puits avec l'échantillon de telle sorte que la pointe ne touche pas le fond du puits ou d'être frappé par le barreau d'agitation. Se assurer que l'électrode de référence, se il est distinct, est également en contact avec la solution dans le puits.
   6. tracés d'enregistrement en utilisant un programme informatique fait maison ou commercial qui se interface avec l'électrode (voir le tableau des matériaux et équipements pour plus de détails).Utilisez un taux d'échantillonnage de 2 Hz, avec filtrage du signal par un filtre passe-bas.
   7. Laisser l'échantillon se équilibrer pendant 5 min pour produire une ligne de base plate plane et stable, ou à proximité lors de l'enregistrement.
   8. Ajouter 3 ul MgATP (100 mM préparée dans dH ₂ O et ajusté à pH 7 avec du KOH; 1 mM de concentration finale) à l'échantillon pour activer la protéine. Laisser ~ 5 min pour atteindre un nouveau niveau de référence stable. Toujours ajuster le pH de la mM MgATP stock 100 au neutre avant utilisation pour éviter les changements dans le pH du tampon externe.
   9. Ajouter 3 ul de valinomycine stock (2 uM; 20 nM concentration finale) à l'échantillon pour dériver des changements dans la différence de potentiel engendrée par l'iodure sélectif conductance à travers CFTR. Notez la pente décroissante (diminution en mV) en raison de l'activité CFTR efflux iodure médiation pendant au moins 5 min.
   10. Pour se assurer que le piégeage de l'iodure dans la lumière de protéoliposomes était suffisante, ajouter 3 ul de 10% (v / v) de Triton X-100 à l'échantillon. Significant et de l'iodure libération immédiate indique que l'iodure suffisante a été piégé dans les vésicules de telle sorte que le piégeage ne était pas le facteur limitant pour les changements de pente déterminées 3.2.9 mais plutôt l'activité CFTR médiation.
   11. Laver la barre d'électrode et mélanger soigneusement avec de l'eau désionisée après le traitement d'échantillons avec le médicament ou avec du Triton X-100 pour assurer toutes les traces de ces réactifs ont été éliminés pour éviter la contamination de l'échantillon suivant.
   12. Préparer une série de concentrations diluées KI dans le micromolaire à nanomolaire dans le tampon 9 (tampon K-Glu, voir le tableau 1). Enregistrer la réponse de l'électrode mV à chaque concentration de 0 à la concentration la plus élevée préparé. Construire une courbe d'étalonnage où la réponse de la sonde (mV) est tracée en fonction du log de la concentration en mole d'iodure. Utilisez la courbe standard pour convertir la réponse mV de la sonde pendant l'expérience d'efflux de la concentration d'iodure libéré.
       NOTE: Préparer un chien d'étalonnageve sur une base hebdomadaire jusqu'à ce que l'utilisateur est certain de la rapidité de la réponse des modifications de la sonde. Il y aura une dérive de la réponse et la sensibilité de la sonde dans le temps. Avec le vieillissement de la sonde, la réponse se dégrade. Ceci peut être partiellement supprimé par la modification des solutions internes et périodiquement un lavage poussé de la pointe de la sonde dans l'eau après utilisation, ce qui limite l'adhésion susceptibles de molécules à la surface de la sonde.
   13. Déterminer la pente moyenne de la ligne de la concentration en fonction du tracé de temps pour chaque échantillon de protéoliposome pour les 30 dernières secondes avant l'addition de MgATP, et après addition de la valinomycine, mais avant l'addition de Triton X-100. Soustraire la pente de référence de la valinomycine pour déterminer l'activité d'efflux d'iodure à médiation par la protéine CFTR pour cet échantillon.

Résultats

Décrit dans cette publication écrite sont des méthodes pour purifier, reconstituer et de mesurer l'activité des canaux réglementé de la protéine CFTR. Figure 1a montre le flux de travail pour la purification, la reconstitution et procédures d'efflux d'iodure. Méthodes pour la reconstitution et l'activité du canal de flux iodure mesures sont également présentés plus en détail dans la vidéo associée.

Purification et la reconstitution de la prot?...

Discussion

Il n'y a eu qu'un nombre limité de protocoles de purification de pleine longueur, l'isolement de la protéine CFTR fonctionnelle, à partir d'une variété de systèmes de surexpression cellulaire. Le procédé décrit ici est avantageuse car elle permet une purification rapide de WT-CFTR ou haute enrichissement de F508del- et G551D-CFTR dans des quantités modérées qui est très fonctionnel dans des dosages compris ATPase et des mesures directes de la fonction du canal, y compris les mesures de canal...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
fos-choline 14 detergent	Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)	F312	Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche (www.roche-applied-science.com)	04 693 132 001	EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack	Roche (www.roche-applied-science.com)	05 892 791 001
Ni-NTA Agarose	Qaigen GmbH	1018240
Fisherbrand Screening columns	Fisher Healthcare	11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K	Millipore (www.millipore.com)	UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit	New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)		Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	840051C
POPC	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	850457C
PS, Porcine Brain	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	840032C	CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	841118C
Ergosterol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	45480
Pierce Detergent removal spin column	Thermo Scientific	87779	1 ml capacity columns
valinomycin	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	V-0627
VX-770 (ivacaftor)	Selleck Chemicals	S1144
iodide selective microelectrode	Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)	LIS-146ICM
[header]
Clampex 8.1 software	Axon Instruments (www.axon.com)		we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System	Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)	LIS-146LICM-XS	Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars	Big Science Inc (www.stirbars.com)	SBM-0502-CMB	choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine	GE Health Care (www.gelifesciences.com)	17-0042-01
Sonicator	Laboratory Supplies Co, Inc.	G112SP1G	Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable