Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

Zusammenfassung

Beschrieben wird hier ein schnelles und wirksames Verfahren für die funktionelle Rekonstitution von gereinigten Wildtyp- und mutierten CFTR-Proteins, die die Aktivität für dieses Chloridkanal, der bei zystischer Fibrose fehlerhaft ist bewahrt. Iodid-Efflux aus rekonstituierter Proteo von CFTR vermittelten ermöglicht Untersuchungen der Kanalaktivität und die Auswirkungen von kleinen Molekülen.

Zusammenfassung

Die Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ist eine eindeutige Kanal-Bildungselement von der ATP-Bindungskassette (ABC) -Superfamilie von Transportern. Die Phosphorylierung und Nucleotid-abhängigen Chlorid-Kanal-Aktivität von CFTR wurde häufig in Ganzzellsystemen und als einzelne Kanäle in abgetrennten Membranflecken untersucht. Viele Mukoviszidose verursachenden Mutationen wurde gezeigt, dass diese Aktivität ändern. Obwohl eine kleine Anzahl von Reinigungsprotokolle sind veröffentlicht worden, haben eine schnelle Rekonstitution Methode Kanalaktivität beibehält und ein geeignetes Verfahren zur Untersuchung Population Kanalaktivität in einem gereinigten System fehlte. Hier schnelle Methoden zur Reinigung und funktionelle Rekonstitution des Volllängen-CFTR-Protein in Proteoliposomen von definierten Lipid-Zusammensetzung, die eine Aktivität als geregelter Halogenid Kanal beibehält beschrieben. Diese Rekonstiutionsmethode zusammen mit einem neuen Fluß basierenden Assay Kanalaktivität ist ein geeignetes System zurStudium der Bevölkerung Kanaleigenschaften von Wildtyp-CFTR und die krankheitserregenden Mutanten F508del- und G551D-CFTR. Insbesondere weist das Verfahren die Anwendung in der Untersuchung der direkten Effekte der Phosphorylierung, Nukleotide und kleine Moleküle wie Potentiatoren und Inhibitoren auf die CFTR-Kanalaktivität. Die Verfahren sind sich auch zur Untersuchung anderer Membrankanäle / Transporter für anionische Substrate.

Einleitung

Chlorid-Transports durch die apikale Membran von Epithelzellen in Geweben wie der Lunge, des Darms, der Bauchspeicheldrüse und Schweißdrüsen wird primär von der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), einem ATP- und Phosphorylierung reguliert Mitglied der ABC (ATP-vermittelten Binding Cassette) C-Unterfamilie von Membranproteinen (in ¹ überprüft). Wie andere Mitglieder der ABCC Familie ist CFTR eine große, mehr Spanning integrales Membranprotein, das an zwei ATP-Nukleotid-Bindungsstellen an der Schnittstelle ihrer Nukleotid-(NBDs), wo es geringe ATPase-Aktivität besitzt, in einer einzigen gebildet bindet Website. Im Gegensatz zu anderen ABCC Familie Mitglieder CFTR wurde als einzigartiges geregelten Cl Kanal anstatt als aktiven gelösten Transporter entwickelt.

Mutationen im CFTR Ursache Mukoviszidose, einer Krankheit, die mehrere Organe wie die Lunge, Magen, Darm, Pankreas-und Fortpflanzungsorgane, was zu morbidity und Mortalität bei jungen Erwachsenen. Lungenerkrankungen nimmt normalerweise Frühletalität bei zystischer Fibrose und in den meisten Fällen wird durch den Verlust der CFTR-Funktion auf dem Oberflächenepithel der leitenden Atemwegen verursacht wird. Der Mangel an CFTR Chlorid-Kanal-Aktivität führt zu einer Verringerung sowohl der Cl ^- und Wasserbewegung über die Oberfläche Epithel, um die Fluidschicht auf der apikalen Oberfläche der Wimper Respirationsepithels modifizieren. Dies führt zu einem viskosen Atemwegsoberflächenflüssigkeit, die die Fähigkeit von Wimper respiratorischen Epithelzellen beeinträchtigt effektiv klare Pathogenen aus den Atemwegen. Als Folge sind die meisten CF-Patienten leiden unter wiederkehrenden Anfällen von Lungenentzündung und Lungenschäden aufgrund einer Entzündung.

Wie erwartet, Studien über den Wirkungsmechanismus des normalen CFTR-Protein konzentrierte sich hauptsächlich auf detaillierten elektrophysiologische Untersuchungen der Kanalöffnung Aktivität. Einkanal-Studien haben direkt, dass CFTR fungiert als PKA-abhängige Cl gezeigt^- Kanal, der ein ATP-regulierten Tor ² besitzt. Detaillierte elektrophysiologische Studien bieten eine Vielzahl von Informationen über einzelne CFTR-Kanäle ^1,3, es kann jedoch Sorge, ob die Eigenschaften eines bestimmten einzelnen Kanal, der untersucht wurde, ist repräsentativ für die gesamte Bevölkerung von CFTR-Kanäle und damit die einzelnen Kanal Testergebnisse sollten stets zusammen mit Methoden, um die makroskopischen Bevölkerung studieren berücksichtigt werden. Direkter Assay der Bevölkerung Kanalaktivität von gereinigtem CFTR hat das Potential, um einen Einblick in die molekularen Defekts mit krankheitsverursachenden Mutation assoziiert ist und Entdeckung chemischer Modulatoren, die Reparatur mutierten CFTR-Proteine ​​zu treiben. Bis heute gibt es mehr als 1.900 verschiedene Mutationen im CFTR gedacht, um Mukoviszidose ⁴ verursachen. Der Haupt Mutation F508del-CFTR, auf mindestens einem Allel in etwa 90% der Patienten in Nordamerika und Europa führt zu Proteinfehlfaltung and Retention im endoplasmatischen Retikulum ^5. F508del-CFTR hat auch andere Folgen, einschließlich defekte Kanalaktivität ^6-9. Die sich ergebende Fehlen von CFTR von der Zelloberfläche ist mit einer schweren Erkrankung. G551D-CFTR, eine weniger häufige Mutation, wird angenommen, dass noch richtig gefaltet dysfunktional als Chlorid-Kanal an der Zelloberfläche ⁶ ist. Die Entwicklung niedermolekularer Korrektoren und Potentiatoren hat das Ziel, Korrektur Faltung und / oder Menschen von Mutanten, wie F508del-CFTR an der Zelloberfläche und potenzierende oder Erhöhung der Kanalaktivität von Mutationen wie G551D, wenn sie auf der Zelloberfläche vorhanden sind, jeweils . Während die Korrektoren VX-809 und VX-661 (noch nicht zur Anwendung bei Patienten zugelassen, die Potentiator Kalydeco (Ivacaftor, VX-770) wird auf 150 mg alle 12 h bei CF-Patienten> 6 Jahre mit mindestens einem G551D verwendet -CFTR Mutation, und in jüngerer Zeit für Patienten mit einem G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pund G1349D. Kalydeco sowohl sicher und führt zu einer Verbesserung der klinischen Maßnahmen CF Krankheit ¹⁰ ist jedoch der Mechanismus der Wirkung des kleinen Moleküls war schlecht bei der FDA-Zulassung für die Anwendung bei Patienten verstanden.

Eine Handvoll von CFTR Reinigungsverfahren wurden zuvor ^2,11-18, von denen viele erfordern eine beträchtliche Zeitdauer in Anspruch beschrieben. In einer kürzlich erschienenen Publikation ¹⁹ wurde eine einzigartige schnelle Reinigung und Rekonstitution Verfahren zur CFTR in Sf 9-Zellen-Expressionssystem überexprimiert beschrieben, und das gereinigte Protein in definierten Lipidsystem wurde verwendet, um ein CFTR Halogenid Kanalaktivitätstest für eine Population von CFTR entwickeln Molekülen. Der Assay fasst die bekannten Wirkungen der Phosphorylierung, Nukleotide und Inhibitoren auf die CFTR-Funktion. Das System wurde verwendet, um die Wirkungen der Potentiator abzufragen VX-770 / Kalydeco auf Wt (Wildtyp), F508del- und G551D-CFTR und es wurde zum ersten Mal gezeigtZeit, die das Arzneimittel interagiert direkt mit dem CFTR-Protein, seine Kanalaktivität in einem ATP-unabhängigen Weise zu verstärken, was die Nützlichkeit und Anwendbarkeit dieser Verfahren auf die Untersuchung der Wechselwirkung von CFTR und Mutanten mit Nukleotiden und kleinen Molekülen aus einer Population Perspektive beantworten klinisch relevante Fragen zum Protein. Die Verfahren sind auch verwendet worden, um andere Potentiator Moleküle und deren Derivate ^20, als auch die Auswirkungen eines kleinen Moleküls Korrektor auf die Aktivität des Proteins ²¹ zu studieren.

Efflux-Assays wurden in vielen Studien verwendet worden, die zuvor um die Aktivität des CFTR-Mutanten und die Wirkungen von CFTR-modulatorische Verbindungen auf ihre Aktivität, einschließlich der Gesamtzelltests unter Verwendung von Elektroden, radioaktiven Tracer und Fluorophore ^22,23, Membranvesikel mit ionenselektiven Elektroden ²⁴ zu untersuchen und gereinigt wieder hergestellt CFTR mit radioaktiver Tracer ^25. Allerdings the Verwendung von ionenselektiven Elektroden zu reinig wiederhergestellt CFTR Studie wurde vor kurzem ¹⁹ ausgewiesen. Eine Anpassung der aktuellen Methode ist für die Rekonstitution und funktionelle Charakterisierung der beiden Membranproteine ​​von Pseudomonas aeruginosa, einem gemeinsamen CF Pathogen verwendet. Rekonstitution von gereinigten Alge Protein der äußeren Membran gekuppelt mit Jodid Efflux-Messungen wurden verwendet, um ein Modell für die anionische Alginat Sekretion durch diese Transporter ²⁶ zu unterstützen. Rekonstitution und Iodid Auslauf Messungen wurden mit dem gereinigten WZX Protein, das ein Modell vorgeschlagen werden, die ein H ⁺ -abhängigen Antiport-Mechanismus für die Lipid-verknüpftes Oligosaccharid Translokation über die bakteriellen Innenmembran schlägt dieses Protein ²⁷ dürfen angewandt. In beiden Fällen wurde Jodid als Surrogat für die anionische Substrat bei geringeren Durchsatz verwendet, wenn auch, als man für eine native Substrat erwarten. Das Verfahren kann für die Anpassung an andere Proteine, die mit c istationic Transport oder Leitungsbahnen für die anionische Substrate.

Hier wird eine schnelle Reinigungsverfahren ist für den CFTR-Proteins und seiner Rekonstitution in Proteoliposomen von definierten Lipid beschrieben. Die rasche Rekonstitution kann leicht zur Verwendung mit CFTR durch andere Verfahren gereinigt zugeschnitten werden, dass die Art des Detergens in der Reinigung verwendet zugänglich ist, um die Entfernung von den hier verwendeten Methoden oder nach einem geeigneten Detergens vor der Rekonstitution ausgetauscht werden. Das Iodid Efflux Verfahren zur Messung der Kanalaktivität der gereinigten und rekonstituierten CFTR-Protein ist im Detail beschrieben, und einige typische Ergebnisse, die durch dieses Verfahren erhalten werden können, sind dargestellt.

Protokoll

1. Reinigung von CFTR

HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien und Geräte für eine Liste von Waren und Materialien in diesem Protokoll verwendet. Ein detailliertes Protokoll besteht für die Überexpression des menschlichen Wt-CFTR und Mutanten in der S f 9-Baculovirus-Expressionssystem ^17,28. Überexprimieren CFTR und bereiten Pellets von Sf 9-Zellen gemäß diesem Protokoll.

1. Crude Membranpräparation
   1. Beschaffen einer neuen oder Auftauen einer gefrorenen S f 9 Zellpellet aus einer 500 ml Zellkultur-Überexpression Wildtyp-, F508del- oder G551D-CFTR-Proteins mit einem C-terminalen His ₁₀ -tag von Standardzellkulturverfahren gezüchtet, wie zuvor beschrieben ^17,28. Zellpellets wird ein Volumen von etwa 5 ml und einem Feuchtgewicht von etwa 5 g.
   2. Resuspendieren Sf 9-Zellen in 20 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 mit Protease-Inhibitor-Cocktail (1 Tablette pro 50 ml) bei 4 ° C, bei denen dieProbe erscheint optisch homogen und keine Zellklumpen zu bleiben.
   3. Lyse Zellen unter Verwendung einer Hochdruckzelle Disruptor (Tabelle der Materialien und Geräte) und erreichte ein Minimum von 10.000 psi (vorzugsweise 15.000-20.000 psi) für 2 Minuten pro Durchgang. Halten Sie die Probe bei 4 ° C während der Lyse.
      1. Die Probe wird in einem Röhrchen auf Eis nach der Lyse Zeitraum dann sofort laden Sie die Probe in der Zelle Disruptor. Wiederholen Lyseverfahren 3 mal. Untersuchen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, kleiner als 10% erhalten bleibt.
         HINWEIS: andere Verfahren zur Lyse Zellen, wie Glasperlen, usw. sind nicht streng auf dieses System untersucht, jedoch kann ein Benutzer ein solches alternatives Verfahren geeignet finden.
   4. Zentrifuge Zelllyse Material bei 4 ° C in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 2.000 · g für 20 min. Die überstehende Flüssigkeit und entsorgen des Pellets. Teilen Sie den Überstand unter 20 Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben für 1 Stunde bei 4 ° C bei 125.000 · g in einer Tisch ultracenZentrifuge.
   5. Entfernen Sie den Überstand, darauf achten, daß das Pellet, und speichern Pellets in denselben Röhrchen bei -80 ° C für weniger als 2 Monate zu stören bis zur Verwendung oder zu halten auf dem Eis und fahren Sie mit der Reinigung sofort.
2. CFTR Solubilisierung
   1. Erhalten 1-4 frische oder gefrorene Sf 9 rohe Membranpellets und Resuspendieren in je 1 ml Puffer 1 (2% fos Cholin; siehe Tabelle 1 für die vollständige Rezeptur) bei 4 ° C auf Eis, mit einer 25 G Nadel und 1 ml Spritze, bis die Lösung ohne sichtbare Zellmembran Klumpen mit dem Auge homogen. Wenn mehr als ein Pellet wird als solubilisierte, weiterhin jede Probe gemäß den Anweisungen für eine einzelne Pellet unten parallel zu behandeln, die Bündelung der Proben in Schritt 1.3.2.
   2. Lösen Sie 1 Mini-Protease-Inhibitor-Tablette in 1 ml Puffer 2 (10 mM Imidazol; siehe Tabelle 1), die fos Cholin 14 Reinigungsmittel fehlt (Protease-Inhibitoren sind 10x concentbewertet als die empfohlene Anwendungskonzentration an dieser Stelle) und fügen Sie 100 ul zu der resuspendierten rohe Membranpellet (Protease-Inhibitoren sind in der jeweils empfohlenen Verdünnung an dieser Stelle). Auf Eis für 45 bis 60 min unter Mischen durch Inversion 5 mal alle 5 min.
   3. Zentrifuge resuspendiert rohe Membranpellet in einer Tischultrazentrifuge für 25 Minuten bei 125.000 × g und 4 ° C. Behalten Sie den Überstand, der solubilisiertes CFTR enthält und entsorgen Sie die Pellets.
3. Column verbindlich, Phosphorylierung und Elution
   1. Waschen 400 ul von Nickel-NTA (Nitrilotriessigsäure) Agarose-Aufschlämmung oder äquivalente Harz mit 1 ml Puffer 2 (10 mM Imidazol, siehe Tabelle 1), die Waschmittel fehlt, um Lösungsmittel zu entfernen und Puffer bei 4 ° C. Wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal.
   2. Kombinieren solubilisierten CFTR verbleibende Proteaseinhibitor (900 ul) und Nickel-Harz (von 400 ul Aufschlämmung) zu insgesamt 10 ml mit Puffer 2 (10 mM Imidazol; siehe Tabelle 1) which fehlt jegliche hinzugefügt Reinigungsmittel. Fos- Cholin 14 Konzentration effektiv zu 0,2% (w / v) in diesem Schritt verdünnt. Wenn es mehrere Rohre, bündeln alle Proben, enthaltend solubilisiertes CFTR, Proteaseinhibitoren, Nickel-NTA-Harz und 0,2% (w / v) fos Cholin-14 an dieser Stelle. Inkubieren für 60 min bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
   3. Pass CFTR-Protease-Inhibitor-Nickel-NTA-Lösung auf ein kleines Screening Spalte (Tabelle 1) oder einen gleichwertigen, leere Spalte.
   4. Wasche die Nickel NTA-Harz, das in der Säule zurückgehalten wird, mit 4 ml pro anfängliche Pellet aus Puffer 3 (10 mM Imidazol + DDM, siehe Tabelle 1) fos Cholin 14, fehlen, die jedoch enthält 1 mM DDM (Dodecylmaltosid Waschmittel), bei 4 ° C. Zugabe von DDM Waschmittel nicht den pH dieses Puffers nicht signifikant.
   5. Bereiten PKA-MgATP Lösung durch Zugabe von 25 ul (5 mM, Endkonzentration) MgATP, 2.500 U des cAMP-abhängige Proteinkinase A, katalytische Untereinheit (PKA) auf 475 & mgr; l Puffer 3 (10 mM Imidazol + DDM, siehe Tabelle 1) in die Kolonne. Phosphorylieren Proteins durch Abdichten des unteren Endes der Säule mit einer Kappe oder einem Parafilm und der Zugabe von 500 ul der PKA-MgATP Lösung für jede anfängliche Pellet verwendet.
   6. Inkubieren bei Raumtemperatur (20 ° C) für 20 Minuten unter leichtem Mischen und Resuspendieren des Harzes unter Verwendung einer 1 ml Pipette alle 2 Minuten, um sicherzustellen, dass die PKA ist in Kontakt mit der gesamten Oberfläche der Nickel NTA Harz kommen.
   7. Entfernen Sie die Kappe und Elution der PKA / MgATP Lösung aus der Säule. Die Säule wird mit 2 ml Puffer 3 (10 mM Imidazol + DDM; siehe Tabelle 1) bei 4 ° C.
   8. Multiplizieren die Anzahl der Pellets, die in dem Experiment 4. Waschen der Säule mit dieser Anzahl von ml Puffer 4 verwendet (50 mM Imidazol + DDM, siehe Tabelle 1) bei 4 ° C, durch Zugabe von 4 ml Puffer auf die Säule, so dass er durch und unmittelbar zu fließen, indem sie das nächste 4 ml Aliquots auf die Säule.
   9. Eluiere das Protein, indem man 1 ml Puffer 5 (600 mM Imidazol + DDM, siehe Tabelle 1) bei 4 ° C pro anfängliche Pellet durch die Säule bei einer Zeit verwendet wird, 1 ml ohne eine Pause, damit die Säule, um zu trocknen, und sammeln Sie das gesamte Eluat, das gereinigt CFTR in einer einzigen Röhre.
   10. Konzentrieren Proteinprobe auf Imidazol- und Molekulargewichtsabbau günstig Produkte zu entfernen unter Verwendung einer Zentrifuge Filtereinrichtung (100.000 Molekulargewicht cut-off), wie in der Tabelle von Materialien und Ausrüstung oder eine andere ähnliche Vorrichtung beschrieben, in einem Gesamtvolumen von 10 ml Puffer 6 (75 mM KI + DDM, siehe Tabelle 1) oder einem anderen Puffer der Wahl, das 1 mM DDM (wie Puffer 7 für nicht Iodid Efflux Experimenten 25 mM HEPES + DDM, siehe Tabelle 1), durch Zentrifugation bei 2.000 × g und 4 ° C für etwa 20 min, bis die Probe konzentriert, um 200 & mgr; l. Verdünnte Probe auf 10 ml und wiederholen Sie den Konzentrationsschritt.
       HINWEIS: Nach unserer Erfahrung (unveröffentlicht), Imidazol deutlich INHIbits der ATPase-Aktivität von CFTR und sollte in diesem Schritt durch Verdünnung und Konzentration mindestens zweimal zu entfernen, wenn die Probe für funktionelle Messungen verwendet werden.
   11. Sammeln Sie konzentrierten gereinigt CFTR. Halten bei 4 ° C in Gegenwart von DDM Puffer bis zur Verwendung innerhalb von 1-2 Tagen bzw. fortsetzen sofort dem Rekonstitution. Das gereinigte Protein Nicht einfrieren, wie in unserer Erfahrung, die wir beobachten, verminderte Aktivität.

2. Rekonstitution von CFTR

1. Lipid Vorbereitung
   HINWEIS: CFTR wurde erfolgreich in Ei-PC, POPC, 2 rekonstituiert: 1 (w / w), Ei-PC: POPC (1: 1 w / w) Mischung, oder einer Mischung aus PE: PS: PC: Ergosterol, 5: 2, : 2: 1 (w / w).
   1. Für Iodid Auslaufversuche, trockenen 5 mg Ei-PC (200 ul von 25 mg / ml Stamm, siehe Tabelle der Materialien und Geräte) unter einem Strom von Argongas für 20 min bei Raumtemperatur in einem Pyrex oder andere feste (non-Borosilikat- ) Glasrohr.
   2. Verwendung der Absorption bei 280 nm, ein ELISA assay oder eine andere Methode, eine Schätzung der Konzentration der gereinigten Protein CFTR Probe. Für Jodid Efflux Experimente mit Wildtyp-CFTR, mit einem Protein: Lipid-Verhältnis von 1: 300-1: 3000 (w / w), um ein ausreichendes Signal zu erzeugen. Für G551D- und F508del-CFTR, mit einem Protein: Lipid-Verhältnis von ungefähr 1: 200-1: 1200 (w / w), um die Ausfluss Aktivität nachzuweisen.
   3. Optimieren Sie die Protein: Lipid-Verhältnis für jedes einzelne System. Berechnen des Volumens des gereinigten Proteins erforderlich. Berechnen des Volumens der Puffer mit 1 mM DDM benötigt, um ein Endvolumen von 1 ml, also 1 ml zu - (Volumen des erforderlichen Proteinlösung) = Volumen des Puffers.
      1. Die berechnete Volumen des gewünschten Puffersystem mit 1 mM DDM zu dem getrockneten Lipid (aber nicht das CFTR-Protein zu diesem Zeitpunkt hinzuzufügen) und bedecken die Glasröhre mit Parafilm. Für Jodid Efflux Experimenten resuspendieren Lipide in Puffer 6 (75 mM KI + DDM, siehe Tabelle 1). Für andere Experimente resuspendieren in Puffer 8 (25 mM HEPES + DDM findenTabelle 1) oder einer anderen gewünschten internen Puffer, der 1 mM DDM.
      2. Wirbel für 2 min bei Raumtemperatur in Suspension des Lipids im DDM Puffer unterstützen. Alternativ Erwärmung der Probe auf 37 ° C für 1-2 min, bevor Vortexen.
   4. Suspendiere das Lipid wiederholt bei Raumtemperatur mit einer 1 ml Spritze und 25 G-Nadel, bis keine Lipidfilms auf den Seiten der Röhre sichtbar ist. Vermeiden Einblasen von Luft in der Lösung, die feinen Blasen zu produzieren und zu unterstützen in Oxidation von Iodid und Lipide würden.
   5. Beschallen die suspendierte Lipid in der Parafilm abgedeckt Rohr für einen 20 s-Burst in einem Ultraschallbad Eis enthielt, und dann unverzüglich in Eis für 1 min. 3-mal wiederholen.
      HINWEIS: Intensive Ultraschall stellt sich Jodid-Lösungen gelb durch Oxidation. Übermäßigen Beschallung. Überwachen Sie die Probe für Farbwechsel. Wenn ein Farbwechsel festgestellt wird, entsorgen Sie die Probe und erneut vorzubereiten. Die Farbänderung infolge der Oxidation einigerdas Iodid würde Oxidation der Lipide unter den gleichen Bedingungen führen. Verdrängen der Luft aus dem Rohr mit Argongas zuvor Beschallen der Lösung wird verhindert, dass die Oxidation von Lipiden und Iodid. Intensive Ultraschall kann schlechte Qualität oder zerkratzte Glasröhren, was zum Verlust der Probe zu brechen.
   6. Hinzufügen des Volumens gereinigt CFTR in Schritt 2.1.3 beschallten Lipidprobe, um einen berechneten erreichen ein Endvolumen von 1 ml. Mischen das Protein mit dem Lipid und Detergenslösung durch Resuspension 10 mal mit einer 25 G Nadel und 1 ml Spritze.
   7. Eingestellt Lipid- und Proteinprobe auf Eis für 30 min unter Schwenken der Röhre zu 5 mal je 5 min mischen.
2. Reinigungsmittel-bindenden Spalte Vorbereitung
   1. Besorgen Sie sich einen einmaligen Gebrauch kommerziellen Reinigungsmittel-bindenden Spin-Säule (siehe Tabelle der Materialien und Geräte) mit einer 1 ml Fassungsvermögen und brechen Sie auf die Registerkarte unten beginnen die Säule fließt.
   2. Zentrifugieren Sie die Spalte für 2 min bei 2000 x g, um das Speicher b entfernenuffer, und entsorgen Sie diesen Puffer.
   3. 5 ml Puffer 7 (75 mM KI, siehe Tabelle 1) auf die Säule, und dann bei 200 × g zentrifugieren für 4 Minuten, um den Waschpuffer eluieren. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male für insgesamt 3 Waschschritten, um alle Spuren der Speicherpuffer zu entfernen. Entsorgen Sie alle Durchfluss.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass der Puffer verwendet, um die Säule zu waschen NICHT DDM oder andere Reinigungsmittel enthalten. Die Säule hat eine begrenzte Bindekapazität für Reinigungsmittel und ein Puffer, wenn Waschmittel, das verwendet wird, wird die Säule unwirksam bei der Entfernung des Detergens aus der Protein-Lipid-Detergens-Probe sein.
   4. Sie 1 ml des Lipid-Detergens-Protein-Probe vorsichtig Aliquot auf die Oberseite des Säulenharz und inkubieren Probe an der Spitze der Säule für 2 min bei Raumtemperatur.
   5. Zentrifugieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 4 min bei 2000 xg und sammeln das trübe Proteoliposom Probe in ein sauberes 1,5 oder 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen oder ein Glasrohr und legen Sie das samweise auf Eis.
   6. Sammeln verbleibende Proteoliposomen in der Säule durch Zugabe von 200 ul Puffer 7 (75 mM KI, Tabelle 1) oder andere Puffer (ohne Detergens) zu dem oberen Ende der Säule und wiederholen den Zentrifugationsschritt für 2 min.
   7. Fügen Sie den zweiten Eluats auf die Proteoliposom Probe bei bewölktem Himmel sieht.
   8. Die Probe bei 4 ° C über Nacht oder sofort verwenden für Iodid Auslaufmessungen.

3. Iodid Efflux Messungen für gereinigtes, Rekonstituierte CFTR

1. Erzeugung eines Iodid-Gradient über die Membran proteoliposomal
   1. Vorzuquellen Sephadex G50 Perlen in Puffer 9 (75 mM K-Glu, Kaliumglutamat, siehe Tabelle 1), (etwa 5 g trockene Kügelchen in 50 ml Puffer) oder gewünschte externe Puffer bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden oder bei 4 ° C über Nacht.
   2. Herstellung von 4 Sephadex G50 Säulen in Puffer 9 gesättigt (75 mM K-Glu, siehe Tabelle 1) oder andererPuffer in kleinen Spalten Screening durch Laden Harz mindestens ¾ voll in der Säule.
   3. Zentrifugieren für 4 min bei 2000 × g, um überschüssige Puffer aus dem Harz zu entfernen. Es sollte etwa 2,25 ml gepackte hydratisierten Harzes in der Säule am Ende der Zentrifugation Schritt.
      HINWEIS: Resin sollten leicht hydratisiert werden, jedoch nicht in Flüssigkeit eingetaucht und einer anschließenden kurzen Spin nicht eluieren signifikante Volumina Puffer. Es ist kritisch für die erfolgreiche Elution des Proteoliposom Probe, die Säule Harz ist weder zu feucht noch zu trocken, und der Benutzer muss möglicherweise mit den Säulen, um sich mit den erfolgreichsten Pufferaustauschbedingungen vertraut experimentieren.
   4. 125-150 ul Proteoliposom Probe vorsichtig in den oberen Rand jeder Spalte und Zentrifuge 4 min bei 2000 x g.
   5. Pool Proteoliposom Eluaten zusammen für den sofortigen Einsatz in Iodid Efflux oder andere Experimente.
      HINWEIS: Die eluierte Volumen von jeder Säule sollte etwa sein150 ul und die Probe sollte etwas bewölkt, aber weniger trübe als die ursprüngliche Probe sein. Größere Mengen oder klar Eluate legen nahe, dass die Säulen zuvor nicht ausreichend getrocknet sind oder die durch Trocknen zu viel sind, und nicht in einem erfolgreichen Iodid Auslaufversuch führen.
2. Iodid-Efflux-Assay
   1. Ein Iodid selektiven Mikroelektrode (Tabelle der Materialien und Geräte) ausgiebig mit entionisiertem Wasser gewaschen und dann für 20 min inkubiert, bevor das Experiment in Puffer 10 (15 & mgr; M KI, siehe Tabelle 1). Waschen Sie die Elektrode wieder ausgiebig mit deionisiertem Wasser.
   2. Jeweils 150 ul des Arzneimittels in Puffer 9 (20 uM typische Konzentration, um eine Endkonzentration von 10 & mgr; M in dem Test zu erzeugen) (75 mM K-Glu, siehe Tabelle 1), die bzw. das in Puffer 9 in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einem kleinen Floh Rührstab.
      1. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen vorhanden sind. Verwenden Sie eine Pipettenspitze entfernen StreuBlasen. Wenn eine Arzneimittellösung verwendet wird, sicherzustellen, dass die DMSO-Endkonzentration in der Vertiefung weniger als 1% (v / v) (typischerweise 0,1-0,2% (v / v)).
   3. Fügen Sie 150 ul des rekonstituierten CFTR-Protein, das in Abschnitt 3.1 in Puffer 9 hergestellt wurde (75 mM K-Glu, siehe Tabelle 1) in die gut mit Drogen-oder Puffer, um ein Gesamtvolumen von 300 ul in der Vertiefung der Platte zu produzieren.
   4. Platzieren Sie die Platten mit 96 Vertiefungen auf einer Rührplatte gegeben und bei 130 Umdrehungen pro Minute (oder bei mäßiger Geschwindigkeit von ca. ¼ der Maximalgeschwindigkeit).
   5. Führen Sie die Spitze des Iodid selektive Elektrode vorsichtig in die Vertiefung mit der Probe, so dass die Spitze der Boden des Bohrlochs nicht berühren oder durch den Rührstab zu schlagen. Sicherzustellen, daß die Referenzelektrode, wenn getrennte, ist auch in Kontakt mit der Lösung in den Brunnen.
   6. Nehmen Sie Kurven mit einem hausgemachten oder kommerzielle Computerprogramm, das mit der Elektrodenschnittstellen (siehe Tabelle der Materialien und Geräte für Details).Eine Abtastrate von 2 Hz, mit einer Filterung des Signals durch ein Tiefpassfilter.
   7. Die Probe wird für 5 Minuten ins Gleichgewicht kommen, um eine stabile flache oder fast flache Basislinie erzeugen während der Aufnahme.
   8. In 3 ul MgATP (100 mM Stamm in dH ₂ O hergestellt und mit KOH auf pH 7 eingestellt; 1 mM Endkonzentration) auf die Probe, um das Protein zu aktivieren. Lassen Sie ca. 5 min, eine neue stabile Basislinie zu erreichen. Immer den pH-Wert der 100 mM MgATP Lager einzustellen, um neutral vor Gebrauch auf Änderungen des pH-Werts des externen Puffer vermeiden.
   9. In 3 ul Valinomycin Lager (2 uM; 20 nM Endkonzentration) auf die Probe, um Veränderungen in der Potentialdifferenz durch Jodid selektive Leitung durch CFTR erzeugt Shunt. Notieren Sie sich die abnehmende Steigung (Abnahme in mV) durch CFTR-vermittelten Efflux Iodid Aktivität für mindestens 5 min.
   10. Um sicherzustellen, dass das Einfangen von Iodid in den Proteoliposom Lumen ausreichend war, werden 3 ul 10% (v / v) Triton X-100 zu der Probe. Significant und sofortige Iodid Freisetzung zeigt an, dass ausreichend Iodid in den Vesikeln, daß war Einfangen nicht der limitierende Faktor für die Veränderungen in der Steigung in 3.2.9 festgelegt, sondern vielmehr der CFTR-vermittelte Aktivität gefangen.
   11. Gründlich waschen die Elektrode und Rührstab mit entionisiertem Wasser nach der Behandlung von Proben mit Drogen oder mit Triton X-100, um sicherzustellen, alle Spuren dieser Reagenzien wurden entfernt, um eine Verunreinigung der nächsten Probe zu vermeiden.
   12. Bereiten Sie eine Reihe von verdünnten KI-Konzentrationen im mikromolaren bis nanomolaren Bereich im Puffer 9 (K-Glu-Puffer, siehe Tabelle 1). Den mV-Reaktion der Elektrode auf jede Konzentration von 0 bis zur höchsten Konzentration. Eine Standardkurve, wo die Sonde Antwort (mV) wird gegen log der molaren Iodid-Konzentration aufgetragen. Verwenden Sie die Standardkurve, um die mV Reaktion der Sonde während der Auslauf Experiment Konzentration von Iodid frei konvertieren.
       HINWEIS: Eine Eich Aktuellhabe auf einer wöchentlichen Basis, bis ein Anwender sicher ist, wie schnell die Reaktion der Sonde ändert. Es wird eine Drift in der Antwort und Empfindlichkeit der Sonde über die Zeit sein. Da die Sonde im Alter wird die Reaktion beeinträchtigen. Dies kann teilweise durch eine Änderung der internen Lösungen periodisch und ausgiebigem Waschen der Sondenspitze in Wasser nach dem Gebrauch, was wahrscheinlich Grenzen Anhaften von Molekülen an der Sondenoberfläche aufzuheben.
   13. Bestimmen Sie die mittlere Neigung der Linie der Konzentration gegen die Zeit für jeden Proteoliposom Probe für die letzten 30 Sekunden vor der Zugabe von MgATP, und nach Zugabe von Valinomycin aber vor der Zugabe von Triton X-100. Subtrahieren Sie die Grundneigung vom Valinomycin, das CFTR-vermittelten Efflux Iodid Tätigkeit der Probe zu bestimmen.

Ergebnisse

In dieser Publikation geschrieben werden Verfahren zur Reinigung, zu rekonstruieren und zu messen geregelten Kanalaktivität des CFTR-Proteins. 1a zeigt den Arbeitsablauf für die Reinigung, Wiederherstellung und Iodid Auslaufverfahren. Verfahren zur Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen durch Jodid Fluss auch in weiteren Einzelheiten in der zugeordneten Video gezeigt.

Reinigung und Wiederherstellung der CFTR in Proteo

CFTR funktionell in ...

Diskussion

Es gab eine beschränkte Anzahl von Reinigungsprotokolle für Volllängen-funktionelle CFTR Isolierung war, aus einer Vielzahl von Zellexpression Systemen. Das hier beschriebene Verfahren ist vorteilhaft, da sie ermöglicht eine schnelle Reinigung von Wt-CFTR oder hohe Anreicherung von F508del- und G551D-CFTR in moderaten Mengen, die hochfunktionell in Assays einschließlich ATPase und direkte Messungen der Kanalfunktion, einschließlich Einzelkanalmessungen in planaren Doppelschicht Systeme und zeigte Maßnahmen CFTR P...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
fos-choline 14 detergent	Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)	F312	Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche (www.roche-applied-science.com)	04 693 132 001	EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack	Roche (www.roche-applied-science.com)	05 892 791 001
Ni-NTA Agarose	Qaigen GmbH	1018240
Fisherbrand Screening columns	Fisher Healthcare	11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K	Millipore (www.millipore.com)	UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit	New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)		Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	840051C
POPC	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	850457C
PS, Porcine Brain	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	840032C	CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	841118C
Ergosterol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	45480
Pierce Detergent removal spin column	Thermo Scientific	87779	1 ml capacity columns
valinomycin	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	V-0627
VX-770 (ivacaftor)	Selleck Chemicals	S1144
iodide selective microelectrode	Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)	LIS-146ICM
[header]
Clampex 8.1 software	Axon Instruments (www.axon.com)		we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System	Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)	LIS-146LICM-XS	Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars	Big Science Inc (www.stirbars.com)	SBM-0502-CMB	choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine	GE Health Care (www.gelifesciences.com)	17-0042-01
Sonicator	Laboratory Supplies Co, Inc.	G112SP1G	Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable