Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

Özet

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Özet

Kistik fibroz membran geçirgenliğinin düzenleyicisi (CFTR), taşıyıcıların Kaset (ABC) süper ailesinin ATP bağlayıcı bir benzersiz bir kanal oluşturan bir üyesidir. CFTR fosforilasyon ve nükleotid bağlı klorür kanal etkinliği sık bütün hücre sistemleri ve kesilen membran yamalar tek kanal olarak incelenmiştir. Birçok Kistik Fibroz-neden olan mutasyonlar bu aktiviteyi değiştirmek için gösterilmiştir. Arıtma protokolleri az sayıda yayınlanmış olsa da, kanal aktivitesini muhafaza eden bir hızlı yeniden oluşturma yöntemi ve saflaştırılmış bir sistem içinde nüfus kanalı etkinliğini incelemek için uygun bir yöntem, eksik edilmiştir. Burada hızlı yöntemler düzenlenmiş bir halid kanalı olarak etkinliğini muhafaza eden, lipid tanımlanan bileşimin proteoliposomes haline getirilerek, ve tam uzunluktaki CFTR proteininin işlevsel olarak yeniden tarif edilmiştir. Birlikte kanal aktivitesi olan yeni bir akı bazlı deneyde Bu yeniden oluşturma yöntemi için uygun bir sistemdirvahşi tip CFTR nüfus kanal özelliklerini ve hastalık yapıcı mutantlar F508del- ve G551D-CFTR okuyan. Özel olarak, yöntem, fosforilasyon, nükleotidler ve bu tür CFTR kanal aktivitesi üzerindeki kuvvetlendirici ve inhibitörleri olarak küçük moleküllerin doğrudan etkilerinin araştırılması yararlıdır. yöntem aynı zamanda, anyonik maddeler için başka membran kanal / taşıyıcıların çalışma için uygun.

Giriş

Akciğer, bağırsak, pankreas ve ter bezleri gibi dokularda epitel hücrelerinin apikal membranlar arasında Klorür taşıma öncelikle ABC Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR), bir ATP ve fosforilasyon-regüle üyesi (ATP aracılık ¹ gözden membran proteinlerinin Kaset) C alt ailesini () Bağlayıcı. ABCC alt ailesinin diğer üyeleri gibi CFTR nükleotid-bağlayıcı etki tek mütevazı ATPaz aktivitesine sahip (NBDs), ara yüzünde oluşan iki nükleotid bağlama sahalarında ATP bağlanan bir geniş, çok geçişli bir integral membran proteinidir sitesi. Ancak, diğer ABCC alt familyası üyeleri aksine, CFTR eşsiz düzenlenmiş Cl kanalı olarak yerine aktif bir çözünen taşıyıcı olarak gelişmiştir.

Morbi giden CFTR neden Kistik Fibrozis, akciğerler, gastrointestinal sistem, pankreas ve üreme yolu da dahil olmak üzere birçok organı etkileyen bir hastalık mutasyonlar,Genç erişkinlerde dity ve ölüm. Akciğer hastalığı, genellikle iletken solunum yollarının yüzey epiteli üzerine CFTR fonksiyon kaybı neden olur Kistik Fibrozis erken mortalite ve çoğu durumda hesapları. siliyalı solunum epiteli apikal yüzeyinde sıvı tabakası değiştirmek için yüzey epiteli boyunca ve su hareketi ^- CFTR klorür kanal aktivitesinin eksikliği hem Cl azalmaya neden olur. Bu kirpikli solunum epitel hücrelerinin yeteneğini bozar viskoz havayolu yüzey sıvı sonuçlanır hava yollarının dışında etkin bir açık patojenler için. Sonuç olarak, çoğu CF hasta akciğer enfeksiyonu ve iltihabı nedeniyle akciğer hasarı atakları muzdarip.

Beklendiği gibi, normal bir CFTR proteininin etki mekanizmasının çalışmaları öncelikle kanal yolluk aktivitesinin detaylı elektrofizyolojik çalışmalar üzerinde duruldu. Tek kanallı çalışmalar bir pKa bağımlı Cl gibi doğrudan bu CFTR fonksiyonlarını göstermişlerdir^- ATP düzenlenmiş kapısı ² sahiptir kanalı. Çalışılmıştır herhangi bir tek bir kanal özellikleri dolayısıyla tüm CFTR kanallarının nüfus ve tek kanal yansıtıcı olup olmadığı detaylı elektrofizyolojik çalışmalar tek CFTR kanalları ^1,3 bilgilerin büyük bir sağlamak, ancak endişe olabilir Sonuçlar her zaman makroskobik nüfusu çalışma yöntemleri ile birlikte düşünülmelidir. Saflaştınldı CFTR nüfus kanal aktivitesinin doğrudan tahlil hastalığa neden olan mutasyonlar ile bağlantılı moleküler bozukluğun ilişkin bilgi sağlar ve kimyasal modülatörleri tamir mutan CFTR proteini keşfini potansiyeline sahiptir. Bugüne kadar, Kistik Fibrozis ⁴ neden olduğu düşünülmektedir CFTR 1.900 farklı mutasyonlar aşan vardır. Kuzey Amerika ve Avrupa'da hastaların yaklaşık% 90'ında en az bir alleli bulunan büyük mutasyon, F508del-CFTR, protein hatalı katlanması yol açarendoplazmik retikulum ⁵ nci tutma. F508del-CFTR da arızalı kanal faaliyeti ^6-9 dahil olmak üzere diğer sonuçları vardır. hücre yüzeyinden CFTR elde edilen olmaması şiddetli hastalık ile ilişkilidir. G551D-CFTR, daha az yaygın mutasyon, düzgün henüz katlanmış hücre yüzeyinde ⁶ bir klorür kanalı olarak işlevsiz olduğunu düşünülmektedir. küçük molekül düzelticisi ve güçlendiricileri gelişimi sırasıyla hücre yüzeyi üzerinde mevcut olan bir katlama ve / veya hücre yüzeyine F508del-CFTR gibi mutantların kaçakçılığı ve güçlendirici düzeltilmesi veya bu gibi G551D mutasyonların kanal aktivitesini arttırma amacı vardır . 150 mg KF hastalarında> 6 yıl en az bir G551D ile her 12 saatte de kullanılan, VX-770); düzelticiler, VX-809 ve VX-661 (henüz hastalarda kullanımı, güçlendiricisi Kalydeco (ivacaftor onaylanmayan da -CFTR mutasyon ve daha yakın zamanda hastalar için G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P biriyleve G1349D. Kalydeco CF hastalığının ¹⁰ klinik önlemler, bu küçük molekülün eylem Ancak mekanizması zayıf hastalarda kullanılmak üzere FDA onayı sırasında anlaşılmıştır iyileştirilmesi güvenli ve sonuçları hem de.

CFTR saflaştırma yöntemleri bir avuç önce tamamlamak için önemli bir zaman uzunluğu gerekli çoğu ^2,11-18 tarif edilmiştir. Son zamanlarda yayınlanan ^19, özel bir hızlı saflaştırma ve yeniden çözme yöntemi Sf 9 hücre ifade sistemi içinde aşırı ifade CFTR için tarif edilmiştir ve tanımlanan lipid sistemleri bu saflaştırılmış protein CFTR oluşan bir popülasyon için bir CFTR halojenür kanal etkinliği test geliştirmek için kullanılmıştır moleküller. Tahlil CFTR fonksiyonu fosforilasyon, nükleotidler ve inhibitörlerinin bilinen etkilerini özetler. Sistem bir potansiyatör etkilerini sorgulamak için kullanılmıştır VX-770 / Kalydeco ağırlıkça (vahşi tip), F508del- ve G551D-CFTR ve ilk için gördüilaç için bir nüfus açısından CFTR ve nükleotidler ve küçük moleküller ile mutantların etkileşimi çalışmasında bu yöntemlerin kullanımını, uygulanabilir gösteren, bir ATP-bağımsız bir şekilde, kanal aktivitesini güçlendirmek için, CFTR proteini ile doğrudan etkileşime giren bir zaman protein hakkında klinik olarak ilgili sorulara cevap. yöntemler, başka potansiyatör molekülleri ve bunların türevleri ^20, hem de protein ²¹ aktivitesine küçük bir molekül düzeltici etkilerini incelemek için kullanılmıştır.

Efflux deneyleri daha önce elektrotlar, radyoaktif izleyiciler ve florofor ^22,23 kullanılarak bütün hücre tahlilleri, iyon seçici elektrotlar ²⁴ ile zar vezikülleri dahil olmak üzere CFTR mutantlarının aktivitesini ve etkinliği üzerindeki CFTR modülatör bileşiklerinin etkilerini araştırmak üzere pek çok çalışmada kullanılmıştır ve radyoaktif izleyiciler ²⁵ ile yeniden CFTR saflaştırılmış. Ancak thsaflaştırılmış yeniden CFTR çalışma iyon seçici elektrotlar e kullanımı ilk geçenlerde ¹⁹ bildirilmiştir. Mevcut yöntemin bir adaptasyonu yeniden ve Pseudomonas aeruginosa, ortak bir KF patogen içinde iki membran proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılmıştır. Iyodür akış ölçümleri ile birlikte saf hale alge dış zar proteininin yeniden oluşturulması, bu taşıyıcı ²⁶ boyunca anyonik alginat salgılama için bir model desteklemek için kullanılmıştır. Sulandırma ve iyodür akış ölçümleri, bir model bu protein ²⁷ ile bakteri iç zarı boyunca lipit bağlantılı oligosakarit translokasyon için bir H ⁺ -bağlı antiport mekanizması ileri sürdüler izin saflaştırılmış Wzx protein uygulanmıştır. Bir yerel bir alt-tabaka için beklenebilir daha Her iki durumda da iyodür daha düşük kapasite ile de olsa, anyonik alt-tabaka için bir vekil olarak kullanılmaktadır. yöntem c başka proteinler adaptasyon için uygunanyonik yüzeyler için ationic taşıma veya iletim yolları.

Burada bir hızlı saflaştırma prosedürü CFTR proteini ve tanımlanan lipid proteoliposomes içine yeniden tarif edilmiştir. hızlı yeniden oluşturma işlemi kolayca arıtılmadan kullanılan deterjan türü burada kullanılan yöntemler ile ayrıştığı ya da rekonstitüsyon işlem öncesinde uygun bir deterjan için değiştirilebilmesi şartıyla, diğer yöntemlerle arıtılır CFTR ile kullanım için uygun hale getirilebilir. Saflaştırılmış ve yeniden CFTR proteininin kanal aktivitesinin ölçülmesi için iyodür akış yöntemi ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve bu yöntem kullanılarak elde edilen bazı tipik sonuçlar sunulmaktadır.

Protokol

CFTR 1. Saflaştırma

NOT: Bu protokolde kullanılan ekipman ve malzeme listesi için Malzeme Tablosu ve Ekipmanları bakınız. Detaylı bir protokol Sf 9-bakulovirüs sentezleme sistemi ^17,28 insan Wt-CFTR aşırı ifadesi ve mutantların ihtiyaç duyulmaktadır. CFTR aşırı ifade eden ve bu protokole göre Sf'ye 9 hücreleri topaklar hazırlamak.

1. Kaba membran hazırlanması
   1. Taze elde edilir ya da standart hücre kültür olarak elde edilen aşırı eksprese eden bir C-terminali His ₁₀ -tag ile wildtype-, F508del- veya G551D-CFTR proteini hücre 500 ml'lik bir kültürden bir dondurulmuş Sf 9 hücre pelletini çözülme daha önce ^17,28 tanımladı. Hücre topakları, yaklaşık 5 ml'lik bir hacme ve yaklaşık 5 g ıslak ağırlığa sahip olacaktır.
   2. Süspanse Sf sağlanması, 4 ° C'de proteaz inhibitör kokteyli ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde 20 ml (PBS), pH 7.4 (1 tablet 50 ml solüsyon) içinde 9 hücreleri,Numune görsel homojen görünür ve hücrelerin hiçbir kümeleri kalır.
   3. Geçit başına 2 dakika boyunca 10.000 psi (tercihen 15.000-20.000 psi) az ulaşan bir yüksek basınçlı hücre Topu (Malzeme ve Ekipman Tablo) ile Hücreleri. Liziz ve 4 ° C 'de örnek tutun.
      1. Sonra hemen hücre Topu numuneyi yeniden lizis süre sonra buz üzerinde bir tüp içinde örnek toplayın. Tekrar parçalama işlemi 3 kez. % 10'dan daha az sağlam kalmasını sağlamak için bir mikroskop altında incelenmesi.
         Not: vb cam boncuklar gibi başka yöntemler lize hücrelerin, sıkı, ancak bir kullanıcı, diğer bir yöntem, uygun gelebilir, bu sistem için incelenmiştir edilmemiştir.
   4. 20 dakika boyunca 2000 x g'de yüksek hızlı santrifüj içinde 4 ° C'de santrifüje hücre parçalama malzemesi. Süpernatant toplayın ve pelet atmayın. 20 tüp arasında süpernatan bölün ve ultracen masa üstü 125,000 x g'de, 4 ° C'de 1 saat süre ile numuneler santrifüjtrifuge.
   5. Çıkarın ve kullanılana kadar az 2 ay boyunca -80 ° C de tüplerinde pelet ve mağaza peletler bozmamaya özen supernatant veya buz üzerinde muhafaza eden ve saflaştırılmadan devam edin.
2. CFTR çözündürme
   1. 1-4 taze veya dondurulmuş Sf 9 Kaba membran pelet elde edilir ve Tampon 1, 1 ml her bir tekrar süspansiyon (% 2 fos -choline, tam bir tarifi için bakınız Tablo 1), buz üzerinde 4 ° C de, bir 25 G iğne ve 1 ile solüsyon kadar ml'lik şırınga görünür hücre zarı kümeleri olmadan gözle homojen olduğunu. Birden fazla topak çözündürülmüş olan yerlerde, aşama 1.3.2 numuneler havuzu, paralel olarak aşağıda, tek bir pelet talimatlarına göre her bir örnek tedavi etmek için devam etmektedir.
   2. 1 Tampon 2 ml 1 mini proteaz inhibitörü tablet çözülür (10 mM imidazol; bakınız Tablo 1) fos -choline 14 deterjan yoksun olan (proteaz inhibitörleri 10 katı daha sonra konsantrasyonlar olarakBu noktada tavsiye edilen seyreltme daha puan) ve yeniden süspanse ham membran pelet 100 ul (proteaz inhibitörleri bu noktada tavsiye edilen seyreltme altındadır) ekleyin. Ters çevirme ile 5 kez her 5 dakika karıştırılarak, 45-60 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.
   3. Santrifüj 125,000 x g ve 4 ° C'de 25 dakika boyunca masa üstü bir ultrasantrifüjdeki Kaba membran pelet yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. Çözünmüş CFTR içeren süpernatant, saklayın ve pelet atın.
3. Kolon bağlayıcı, fosforilasyon ve elüsyon
   1. Nikel-NTA (nitrilotriasetik asit) agaroz bulamaç ya da Tampon 2, 1 ml eşdeğer reçine 400 ul yıkayın (10 mM imidazol; bakınız Tablo 1) deterjan yoksun olan, çözücü maddeyi ortadan kaldırmak ve 4 ° C'de tampon. Tekrar yıkama iki kez daha.
   2. (10 mM imidazol, Tablo 1 e bakınız), Tampon 2 ile 10 ml 'lik bir toplam çözündürülmüş CFTR, geri kalan proteaz inhibitörü (900 ul) ve nikel reçinesi (400 ul bulamaçtan) birleştirin ağırlıkarada tutarak bir ilave deterjan yoksundur. fos -choline 14 konsantrasyonu etkili bir şekilde (a / h) Bu adımda% 0.2 kadar seyreltilir. Birden çok boru varsa, çözündürülmüş CFTR, proteaz inhibitörleri, nikel-NTA reçinesi ve% 0.2 ihtiva eden tüm örnekler havuz (a / h) fos -choline-14 bu noktada. Nazik çalkalama ile 4 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
   3. Küçük bir tarama kolonu (Tablo 1) veya eşdeğer bir boş sütun CFTR proteaz inhibitörü nikel NTA çözeltiyi geçirin.
   4. Tampon 3 ilk pelet başına 4 ml ile, kolon içinde alıkonur ve nikel NTA reçinesi, yıkama (10 mM imidazol + DDM; bakınız Tablo 1) fos -choline 14 yoksun ama 1mM DDM (dodesil maltosit deterjan) içeren 4 ° C'de ilave edildi. DDM deterjan eklenmesi önemli ölçüde bu tamponun pH değiştirmez.
   5. 2500, protein kinaz A, katalitik alt birimi, cAMP-bağımlı U (p 25 ul MgATP (5 mM, nihai konsantrasyon) ilave etmek suretiyle, PKA-MgATP çözeltisi hazırlayınTablo 1) kolona, ​​Tampon 3 (10 mM imidazol + DDM 475 ul KA). Bir kapak ya da Parafilm ile sütunun alt ucunun kapatılmasını ve kullanılan her bir başlangıç ​​pelet için pKa MgATP çözeltisi 500 ul eklenmesiyle proteinin fosforile.
   6. PKA, nikel NTA reçinesi bütün yüzeyi ile temas emin olmak için hafif karıştırma ile 1 ml pipet her 2 dakikada kullanılarak reçinenin yeniden süspansiyon haline getirilmesi ile 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (20 ° C) inkübe edilir.
   7. Kapağı çıkarın ve sütundan PKA / MgATP çözüm Zehir. Tampon 3 2 ml kolon yıkaması (10 mM imidazol + DDM; bakınız Tablo 1) 4 ° C'de ilave edildi.
   8. Izin kolona 4 ml tampon ilave edilerek 4 ° C'de, (bakınız Tablo 1, 50 mM imidazol + DDM) Tampon 4 ml bu sayı 4. Yıkama kolon deneyde kullanılan peletler çarpın bu sütunun yanında 4 ml lik ekleyerek yoluyla ve hemen akmaya.
   9. Zehir 1 Tampon 5 ml (600 mM imidazol + DDM; bakınız Tablo 1) geçen protein kolon kuruması için bir duraklama olmadan aynı anda, sütun içinden 1 ml kullanılan başlangıç ​​pelet başına 4 ° C 'de, ve tek bir tüp içinde saflandırıldı CFTR içeren tüm eluat toplar.
   10. 10 mi Tampon 6 arasında bir toplam, örneğin Malzeme ve Ekipman veya başka benzer bir cihaz, Tablo l'de tarif edildiği gibi (100.000 molekül ağırlıklı bir kesim) bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak imidazol ve düşük molekül ağırlıklı bozunma ürünlerinin ayrılması için protein örneği konsantre edin (75 mM ki + DDM; bakınız Tablo 1 2000 x g 'de santrifüj ile) ve 4 ° C, (non-iyodür akış deneyleri için Tamponu 7, 25 mM HEPES + DDM olarak Tablo 1) ya da 1mM DDM ihtiva eden tercih edilen bir başka tampon olabilir bakınız örnek kadar yaklaşık 20 dakika 200 ul ile elde edilebilirler. 10 ml örnek seyreltilir ve konsantrasyon adımı tekrarlanır.
       NOT: Bizim tecrübelerimize göre (yayımlanmamış), imidazol anlamlı INHICFTR ATPaz aktivitesi bitleri ve örnek fonksiyonel ölçümler için kullanılacak ise, en az iki kat seyreltme ve konsantrasyon ile bu aşamada çıkarılmalıdır.
   11. Konsantre arıtıldı CFTR toplayın. 1-2 gün içinde kullanıma kadar DDM tamponu mevcudiyetinde 4 ° C'de tutun veya sulandırma aşamasından hemen devam edin. Biz düşük aktivite gözlemlemek bizim deneyim gibi, saflaştırılmış protein dondurma etmeyin.

CFTR 2. Sulandırma

1. Lipid Preparasyonu
   Not: CFTR başarılı Yumurta PC, POPC içine 2 yeniden edilmiştir: 1 Yumurta PC (ağırlık / ağırlık): POPC (1: 1 a / a) karışımı, veya PE bir karışımı: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (a / a).
   1. Iyodür akış deneyleri, kuru Yumurta PC 5 mg payreks bir ya da düz (non-borosilikat oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bir argon gazı akışı altında (25 mg / ml stok, 200 ul, Malzeme ve Ekipman Tablo) ) cam tüp.
   2. 280 nm'de emicilik kullanılarak, bir ELISA, birssay veya başka bir yöntem olup, saflaştınlmış CFTR proteini numune konsantrasyonunun tahmin edilmektedir. 1 lipid oranı: 300-1: 3000 yeterli bir sinyal üretmek için (a / a) vahşi tipli CFTR iyodür akış deneyler için, bir protein kullanırlar. Akış aktivitesi tespit etmek için 1,200 (ağırlık / ağırlık): 200-1: Yaklaşık 1 lipid oranının: G551D- ve F508del-CFTR, bir protein kullanırlar.
   3. Her bir sistem için lipit oranı: Protein Optimize. Gerekli saflaştırılmış protein miktarını hesaplayın. = Tampon hacmi (protein gerekli çözeltinin hacmi) - 1 mi, örneğin, 1 ml 'lik bir son hacim için gerekli olan, 1 mM DDM ile tampon hacim hesaplanır.
      1. Kurutulmuş lipid 1 mM DDM ile istenilen tampon sisteminin hesaplanan hacim ekleme (ancak şu anda CFTR proteini katmayan) ve Parafilm ile cam tüp kapağı. Iyodür akış deneyler için, tampon 6 lipitleri tekrar süspansiyon (75 mM ki + DDM; bakınız Tablo 1). Diğer deneyler Tampon 8 tekrar süspansiyon için (25 mM HEPES + DDM, bkzTablo 1) ya da 1mM DDM ihtiva eden bir başka istenen iç tampon eklendi.
      2. Oda sıcaklığında 2 dakika vorteksleyin DDM tamponu içinde yağ ve süspansiyon yardımcı olmak için. Seçenek olarak ise, vorteks önce 1-2 dakika süre ile 37 ° C örnek ısıtın.
   4. Lipid film tüpü kenarlarında görünür hale gelene kadar 1 ml şırınga ve 25 G iğne ile oda sıcaklığında arka arkaya lipid süspanse edin. Ince kabarcıklar üretmek ve iyodür ve lipidlerin oksidasyonu yardımcı olur solüsyon içine hava enjekte kaçının.
   5. Parafilm içinde süspansiyon haline getirilmiş lipit bir sonikatör banyosu ihtiva eden bir buz içinde 20 sn kaymasının tüpü kapalı sonikasyon, ve daha sonra 1 dakika boyunca buz hemen aktarın. 3 kez tekrarlayın.
      NOT: Yoğun sonication oksidasyon nedeniyle sarı iyodür çözümler döner. Bu nedenle aşırı sonikasyon kaçının. Renk değişiklikleri için örnek izleyin. Bir renk değişimi tespit edilirse, örnek atmak ve tekrar hazırlamak. nedeniyle bazı oksidasyonu renk değişikliğiiyodür, aynı koşullar altında lipid oksidasyonuna neden olur. Çözüm sonicating önce argon gazı ile tüp havayı yerinden lipid ve iyodür oksidasyonunu önlemeye yardımcı olur. Yoğun sonication kalitesiz veya numune kaybına neden çizik cam tüpler kırabilir.
   6. 1 ml'lik bir son hacim elde etmek için bir ses dalgalarına maruz bırakıldı, lipid numune için adım 2.1.3 hesaplanan arıtıldı CFTR hacim. 25 G iğne ile 1 ml şırınga ile tabanda 10 kez lipit ve deterjan çözeltisi ile protein karıştırın.
   7. Tüp döndürme ile 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir lipid ve protein numune 5 kez her 5 dakika karıştırın.
2. Deterjan bağlayıcı sütun hazırlanması
   1. 1 ml hacim kapasiteli bir tek kullanımlık ticari deterjan bağlayıcı spin kolon (Malzeme ve Ekipmanları Tablo bakınız) elde edilir ve sütun akan başlamak için alt sekmesini kırmak.
   2. Depolama b çıkarmak için 2000 x g'de 2 dakika süre ile sütun santrifüjuffer ve bu tampon atın.
   3. Tampon 7 5 ml kolonuna (75 mM KI, Tablo 1 'e bakınız) ve daha sonra yıkama tamponu elüt edilmesi için 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Depolama tamponu tüm izlerini çıkarmak için 3 yıkamadan toplam Bu adım 2 kere daha tekrar edin. Tüm flow-through atın.
      NOT: Bu sütun yıkamak için kullanılan tampon DDM ya da başka bir deterjan içermeyen önemlidir. Sütun deterjan için sınırlı bir bağlanma kapasitesine sahip olan bir deterjan ihtiva eden bir tampon maddesi kullanıldığında, kolon protein lipit deterjan örnek deterjan kaldırılması etkisiz olacaktır.
   4. Dikkatle kolon reçinenin üst kısmına lipid deterjan protein, tüm numune 1 ml bir örnek ve oda sıcaklığında 2 dakika için sütunun üst kısmında örnek inkübe edilir.
   5. 2000 x g'de, 4 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin ve temiz bir 1.5 ya da 2 ml mikrofüj tüpüne bulutlu proteoliposome örnek ya da bir cam tüp toplamak ve Sam yerBuz üzerinde ple.
   6. Kolonun üstüne 200 Tampon 7 ul (75 mM KI, Tablo 1) ya da (deterjan olmadan) için diğer tampon çözeltisi ilave edilerek kolon içerisinde geri kalan proteoliposomes toplayın ve 2 dakika boyunca santrifüj adımı tekrarlanır.
   7. Bulutlu görünüyor eğer proteoliposome örnek ikinci eluatın ekleyin.
   8. Gece boyunca 4 ° C 'de örnek saklayın, ya da iyodür akış ölçümleri için hemen kullanılır.

Saflaştırılmış yeniden oluşturulmuş CFTR 3. iyodür dışarı atım Ölçümler

1. Proteoliposomal zarı boyunca bir iyodür gradyan üretilmesi
   1. Tampon 9 Ön kabarma Sephadex G50 boncuklar (yaklaşık 5 g kuru boncuk 50 mi tampon maddesi içinde) veya arzu edilen dış Tampon, oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle ya da 4 ile (75 mM K-Glu potasyum glutamat, Tablo 1 e bakınız) gecede ° C.
   2. Tampon 9 doymuş 4 Sephadex G50 sütun hazırlayın ya da (75 mM K-Glu, Tablo 1 e bakınız)¾ en azından sütununda tam reçine yükleyerek küçük tarama sütunlarda tampon.
   3. Reçine aşırı tampon kaldırmak için 2.000 xg'de 4 dakika santrifüj. Santrifüjleme aşamasının sonunda kolonuna paketlenmiş hidratlanmış reçinenin yaklaşık 2.25 mi olmalıdır.
      NOT: Reçine hafifçe sulu ancak sıvı dalmış ve bir sonraki kısa sıkma tampon önemli hacimlerde Zehir olmamalıdır değil edilmelidir. Bu sütun reçine ne çok ıslak ne de çok kuru ve kullanıcı en başarılı tampon değişimi koşullarına aşina olmak için sütunları ile denemeniz gerekebilir olan proteoliposome numunenin başarılı elüsyondan için çok önemlidir.
   4. Dikkatlice 2,000 x g'de, 4 dakika boyunca, her bir sütun ve santrifüj üstüne proteoliposome örnek 125-150 ul ekle.
   5. Havuz proteoliposome iyodür efflux veya diğer deneylerde hemen kullanım için bir arada sıvı kısımlar.
      NOT: Her kolondan ses kabaca olmalı150 ul ve örnek biraz bulutlu, ancak orijinal numune daha az bulutlu olmalıdır. Büyük hacimler veya net eluatlar sütunları yeterince kurutulmuş değil, ya da çok fazla, sırasıyla kurutulmuş edilmiş ve başarılı bir iyodür akış deneyinde neden olmaz düşündürmektedir.
2. Iyodür akış deneyi
   1. Yoğun bir de-iyonize su ile (Malzeme ve Ekipman Tablo) bir iyodür seçici mikro elektrot yıkayın ve daha sonra Tampon 10 deneyden önce 20 dakika süreyle kuluçkalayın (15 uM KI, bakınız Tablo 1). Deiyonize su ile tekrar kapsamlı elektrot yıkayın.
   2. Tampon 9 tahlilde kullanılır (10 uM bir nihai konsantrasyon elde etmek için 20 uM, tipik konsantrasyon) ilacın 150 ul ekle 96 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna Tamponu 9 ya da araç (75 mM K-Glu, Tablo 1 e bakınız) Küçük bir pire karıştırma çubuğu ile.
      1. Mevcut hava kabarcığı olmadığından emin olun. Sokak kaldırmak için bir pipet kullanınkabarcıklar. Bir ilaç çözeltisi kullanılıyorsa, göz içindeki son DMSO konsantrasyonu ((tipik olarak% 0.1-0.2 v / v)) en az% 1 (h / h) olduğundan emin olun.
   3. Tampon 9, Bölüm 3.1'de üretilmiş yeniden CFTR proteininin 150 ul ekle plakasının her bir oyuğuna 300 ul toplam hacim elde etmek için, ilaç ya da tampon maddesi ile bir oyuğa (75 mM K-Glu, bakınız Tablo 1).
   4. Bir karıştırıcı plaka üzerinde 96 oyuklu plaka yerleştirilir ve 130 rpm'de (ya da yaklaşık olarak dörtte maksimum hızının bir orta hızda) karıştırılmıştır.
   5. Dikkatle ucu kuyunun dibine dokunmadan değil veya karıştırma çubuğu ile vurulduktan şekilde numune ile kuyuya iyodür seçici elektrot ucu yerleştirin. Referans elektrot, ayrı ise, iyi çözelti ile temas halinde olduğundan emin olun.
   6. Elektrot ile arayüzleri bir ev yapımı ya da ticari bilgisayar programı kullanarak Kayıt kopyalamaları (detaylar için Materyallerin Tablo ve Ekipmanları bakınız).Bir düşük geçiş filtresi içinden sinyal filtreleme ile 2 Hz'lik bir numune alma oranı, kullanın.
   7. Örnek kayıt sırasında düz ve sabit ya da yakınındaki yassı bir temel hat üretmek için 5 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.
   8. 3 ul MgATP (KOH ile dH ₂ O hazırlandı ve pH 7'ye ayarlandı, 100 mM stok, 1 mM nihai konsantrasyon) ilave örneğe proteini aktif hale getirmek için. ~ 5 dk yeni bir kararlı bir temel ulaşmak için bekleyin. Her zaman dış tampon pH değişiklikleri önlemek için kullanmadan önce nötr 100 mM MgATP stokunun pH ayarlamak.
   9. CFTR ile iyodür seçici iletkenlik tarafından üretilen potansiyel farkı değişiklikleri şant örnek (20 nM nihai konsantrasyon 2 uM) stok Valinomycin 3 ul ekle. En az 5 dakika süre ile bağlı CFTR aracılı iyodür akış aktivitesi azalan eğimi (mV azalma) kaydedin.
   10. , Proteoliposome lümeninde iyodür bindirme yeterli olduğundan emin olmak% 10 3 ul eklemek (h / h) Triton X-100 örnek. Significant ve ani iyodür salma yeterli iyodür tutucu 3.2.9 belirlenen eğim değişiklikleri daha çok CFTR aracılı etkinliği için sınırlayıcı bir faktör değildir, öyle ki veziküller sıkışıp olduğunu gösterir.
   11. Bu reaktiflerin tüm izlerini sonraki numunenin kirlenmesini önlemek için çıkarılmış olmak üzere ilaç veya Triton X-100 ile örnekleri tedaviden sonra de-iyonize su ile iyice elektrot ve bir karıştırma çubuğu yıkayın.
   12. Tamponu içinde nanomolar aralıkta 9 mikromolar seyreltilmiş KI bir seri yoğunluğunun hazırlanması (K-Glu tamponu, bakınız Tablo 1). Hazırlanan en yüksek konsantrasyonda 0 ilâ her bir konsantrasyonu için elektrot mV yanıtı kaydeder. Prob yanıtı (mV) molar iyodür konsantrasyonunun günlüğüne karşı çizilen bir standart eğri Construct. Serbest iyodür konsantrasyonuna akış deney sırasında prob mV tepkisini dönüştürmek için standart eğri kullanın.
       NOT: Bir kalibrasyon cur hazırlayınBir kullanıcı emin olana kadar haftalık olarak ziyaretinde ne kadar hızlı sistemi değişiklikleri tepkisi. Zamanla prob cevap ve hassasiyet bir sürüklenme olacaktır. Prob yaş olarak, yanıt düşer. Bu kısmen periyodik iç çözümler değişen ve kullanımdan sonra su prob ucunun geniş yıkama, prob yüzeyine moleküllerin muhtemel sınırları bağlılık tarafından iptal edilebilir.
   13. MgATP ilave edilmeden önce son 30 saniye boyunca her proteoliposome numune için zaman grafiği konsantrasyona hattının ortalama eğimi belirlemek ve Valinomycin ilave edilmesinden sonra, ancak, Triton X-100 ilave edilmeden önce. Bu örnek CFTR-aracılı iyodür akış etkinliğini belirlemek için Valinomycin bazal eğim çıkarın.

Sonuçlar

Bu yazılı yayında tarif, arındırmak sulandırmak ve CFTR proteininin düzenlenmiş kanal aktivitesini ölçmek için yöntemler bulunmaktadır. 1a saflaştırma, yeniden ve iyodür akış prosedürleri için iş akışını göstermektedir. Iyodür akı yeniden oluşturma ve kanal Aktivite ölçümleri için yöntemler de ilgili video daha ayrıntılı olarak gösterilmektedir.

Proteoliposomes içine CFTR saflaştırma ve yeniden çözme

Tartışmalar

Hücresel aşırı ekspresyonu sistemleri çeşitli, tam uzunluktaki fonksiyonel CFTR izolasyonu için saflaştırma protokolleri sınırlı sayıda olmuştur. Bu ATP ve düzlemsel iki tabakalı, tek kanallı ölçümleri de dahil olmak üzere kanal fonksiyonunun doğrudan ölçümleri, aşağıdakileri içeren deneylerde son derece işlevseldir, Wt-CFTR veya orta miktarlarda F508del- ve G551D-CFTR yüksek zenginlikte hızlı saflaştırılmasına olanak tanımaktadır burada tarif edilen yöntem avantajlıdır, Küçü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
fos-choline 14 detergent	Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)	F312	Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche (www.roche-applied-science.com)	04 693 132 001	EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack	Roche (www.roche-applied-science.com)	05 892 791 001
Ni-NTA Agarose	Qaigen GmbH	1018240
Fisherbrand Screening columns	Fisher Healthcare	11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K	Millipore (www.millipore.com)	UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit	New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)		Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	840051C
POPC	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	850457C
PS, Porcine Brain	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	840032C	CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	841118C
Ergosterol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	45480
Pierce Detergent removal spin column	Thermo Scientific	87779	1 ml capacity columns
valinomycin	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	V-0627
VX-770 (ivacaftor)	Selleck Chemicals	S1144
iodide selective microelectrode	Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)	LIS-146ICM
[header]
Clampex 8.1 software	Axon Instruments (www.axon.com)		we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System	Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)	LIS-146LICM-XS	Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars	Big Science Inc (www.stirbars.com)	SBM-0502-CMB	choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine	GE Health Care (www.gelifesciences.com)	17-0042-01
Sonicator	Laboratory Supplies Co, Inc.	G112SP1G	Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable