A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
שתואר כאן הוא הליך מהיר ויעיל לכינון מחדש פונקציונלי של מטוהר wild-type וחלבון CFTR מוטציה המשמרת את פעילות לערוץ כלוריד הזה, שהוא פגום בסיסטיק פיברוזיס. זרימת יודיד מproteoliposomes מחדש בתיווכו של CFTR מאפשרת לימודים של פעילות ערוץ ואת ההשפעות של מולקולות קטנות.
סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR) הוא חבר יוצרי ערוץ ייחודי של ATP כריכת קלטת superfamily (ABC) של מובילים. פעילות ערוץ זירחון וכלוריד התלוי נוקלאוטיד של CFTR נחקרה לעתים קרובות במערכות תא כולו וכערוצים בודדים בתיקוני קרום נכרתו. מוטציות הגורם לסיסטיק פיברוזיס רבים הוכחו לשנות פעילות זו. בעוד מספר קטן של פרוטוקולי טיהור פורסמו, שיטה מהירה לשיקום שומרת פעילות ערוץ ושיטה מתאימה ללימוד פעילות ערוץ אוכלוסייה במערכת מטוהרת היו חסרה. שיטות כאן מהירות מתוארות לטיהור וכינון מחדש תפקודי של חלבון CFTR באורך המלא לproteoliposomes של הרכב שומנים בדם מוגדר ששומר על פעילות כערוץ הליד מוסדר. שיטה זו הכינון מחדש יחד עם assay מבוסס שטף רומן של פעילות ערוץ היא מערכת מתאימה ללומד את מאפייני אוכלוסייה של ערוץ CFTR סוג בר ומוטציות הגורמות למחל F508del- וG551D-CFTR. באופן ספציפי, יש לו את השיטה שירות בלימוד ההשפעות הישירות של זירחון, נוקלאוטידים ומולקולות קטנות כגון potentiators ומעכבים על פעילות ערוץ CFTR. השיטות גם נתונים למחקר של ערוצים / מובילי קרום אחרים למצעי anionic.
תחבורת כלוריד פני ממברנות הפסגה של תאי האפיתל ברקמות כגון בלוטות ריאות, מעי, הלבלב וזיעה מתווכת בעיקר על ידי סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR), ATP- וחבר-מוסדר זירחון של ABC (ATP- כריכת subfamily הקלטת) C של חלבונים בממברנה (הנסקרת ב 1). כמו חברים אחרים של תת-משפחת Abcc, CFTR הוא חלבון גדול, רב-פורש נפרד קרום שקושר ATP בשני אתרי קישור נוקלאוטיד נוצרו בממשק של תחומים מחייב נוקלאוטיד (NBDs), בם יש לי פעילות ATPase צנועה באחת אתר. עם זאת, בניגוד לחברים תת-משפחת Abcc אחרים, CFTR התפתח כערוץ Cl מוסדר ייחודי ולא כטרנספורטר המומס פעיל.
מוטציות בגורם CFTR סיסטיק פיברוזיס, מחלה הפוגעת באיברים רבים, כולל ריאות, מערכת עיכול, לבלב ואיברי רבייה, שמובילות לmorbidity ותמותה במבוגרים צעירים. מחלת ריאות בדרך כלל חשבונות לתמותה מוקדמת בסיסטיק פיברוזיס וברוב המקרים נגרמת על ידי אובדן תפקוד CFTR על האפיתל של דרכי הנשימה ביצוע המשטח. חוסר בפעילות ערוץ כלוריד CFTR גורם להפחתה בשני Cl - ותנועת מים על פני האפיתל פני השטח כדי לשנות את שכבת הנוזל על משטח הפסגה של אפיתל הנשימה ריסי. התוצאה היא נוזל צמיג שטח בדרכי נשימה שפוגע ביכולת של תאי אפיתל נשימה ריסי ליעילות פתוגנים מדרך הנשימה ברורים. כתוצאה מכך, רוב חולי CF סובלים מהתקפים חוזרים ונשנים של דלקת ריאות ונזק ריאות בשל דלקת.
כצפוי, מחקרים של מנגנון פעולה של חלבון CFTR הנורמלי התמקדו בעיקר במחקרי אלקטרו מפורטים של פעילות gating הערוץ שלה. מחקרי ערוץ אחד הראו כי פונקציות ישירות CFTR כPKA-תלוי Cl- ערוץ שבו בעל שער מוסדר ATP 2. מחקרי אלקטרו מפורטים לספק מידע רב על ערוצי CFTR יחידים 1,3, אולם ייתכנו דאגה באשר לשאלה האם המאפיינים של כל ערוץ אחד מסוים שנחקר הוא שיקוף של כל אוכלוסיית ערוצי CFTR ולכן ערוץ אחד תוצאות תמיד צריכים לשקול יחד עם שיטות ללמוד האוכלוסייה מקרוסקופית. assay הישיר של פעילות ערוץ האוכלוסייה של CFTR מטוהר יש הפוטנציאל לספק תובנה הפגם המולקולרי הקשורים למוטציות הגורמות למחלות ולנהוג גילוי מאפננים כימיים שתיקון חלבוני CFTR המוטציה. נכון להיום, יש עודף של 1,900 מוטציות שונות בCFTR חשבו לגרום סיסטיק פיברוזיס 4. המוטציה הגדולה, F508del-CFTR, הנמצאת באלל אחד לפחות בכ -90% מהחולים בצפון אמריקה ובאירופה מובילה לחלבון misfoldingשמירת nd בreticulum endoplasmic 5. F508del-CFTR יש גם השלכות אחרות, הכולל את פעילות ערוץ פגום 6-9. היעדרות כתוצאה של CFTR מתא השטח מזוהה עם מחלה קשה. G551D-CFTR, מוטציה נפוצה פחות, הוא חשב להיות מקופל עדיין כראוי הוא לא מתפקד כערוץ כלוריד על פני תא 6. הפיתוח של מתקן מולקולה קטן וpotentiators יש את המטרה של תיקון מתקפל ו / או סחר של מוטציות כגון F508del-CFTR לשטח פני התא, וpotentiating או הגדלת פעילות הערוץ של מוטציות כגון G551D כאשר קיים על פני התא, בהתאמה . בעוד מתקן VX-809 וVX-661 (עדיין לא אושר לשימוש בחולים, potentiator Kalydeco (ivacaftor; VX-770) נמצא בשימוש ב 150 מ"ג כל 12 שעות בחולי CF> 6 שנים עם לפחות אחד G551D מוטציה -CFTR, ולאחרונה בחולים עם אחד מG178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255PוG1349D. Kalydeco הוא גם בטוח וגם תוצאות בשיפור אמצעים קליניים של המחלה CF 10, אולם מנגנון פעולה של מולקולה קטנה זה הבין היטב בעת אישור ה- FDA לשימוש בחולים.
קומץ של שיטות טיהור CFTR תוארו בעבר 2,11-18, שרבים מהם דורשים אורך ניכר של זמן כדי להשלים. בפרסום האחרון 19, שיטת טיהור והכינון מחדש מהירה ייחודית תוארה לCFTR ביטוי יתר במערכת הביטוי 9 תא f S, וחלבון מטוהר זה במערכות שומנים מוגדרות שימש לפיתוח assay פעילות ערוץ הליד CFTR לאוכלוסייה של CFTR מולקולות. Assay משחזר את ההשפעות הידועות של זירחון, נוקלאוטידים ומעכבים על תפקוד CFTR. המערכת הייתה בשימוש כדי לחקור את ההשפעות של potentiator VX-770 / Kalydeco על Wt- (wild-type), F508del- וG551D-CFTR וזה הוצגו בראשוןזמן שתרופת אינטראקציה ישירות עם חלבון CFTR להגברת פעילות הערוץ שלה באופן ATP-עצמאי, הממחישה את התועלת ותחולתה של שיטות אלה לחקר האינטראקציה של CFTR ומוטציות עם נוקלאוטידים ומולקולות קטנות מנקודת מבט אוכלוסייה ל לענות על שאלות רלוונטיות מבחינה קלינית על החלבון. השיטות יש גם שימשו ללמוד מולקולות אחרות potentiator ונגזרותיהם 20, כמו גם את ההשפעות של מתקן מולקולה קטן בפעילות של החלבון 21.
מבחני בזרימת היו בשימוש במחקרים רבים בעבר כדי לחקור את הפעילות של מוטציות CFTR ואת ההשפעות של תרכובות CFTR-modulatory על פעילותה, ובכלל זה מבחני תא כולו באמצעות אלקטרודות, קליעים נותבים רדיואקטיבי וfluorophores 22,23, שלפוחית עם קרום אלקטרודות סלקטיבית יון 24 , וטהר CFTR מחדש עם קליעים נותבים רדיואקטיבי 25. עם זאת thשימוש בדואר של אלקטרודות סלקטיבית היון ללמוד מטוהר CFTR מחדש דווח לראשונה לאחרונה 19. הסתגלות של השיטה הנוכחית הייתה בשימוש כבר הכינון מחדש ואפיון פונקציונלי של שני חלבוני קרום בPseudomonas aeruginosa, הפתוגן CF נפוץ. הכינון מחדש חלבון מטוהר alge חיצוני קרום יחד עם מדידות זרימת יודיד שלהם המשמשים לתמיכת מודל להפרשת אלגינט anionic דרך טרנספורטר זה 26. כינונה מחדש ומדידות זרימת יודיד יושמו חלבון Wzx המטוהר, שאיפשר מודל להצעה שמציעה H + מנגנון antiport + תלוי לטרנסלוקציה oligosaccharide צמוד שומנים על פני הקרום הפנימי החיידקים על ידי חלבון זה 27. בשני המקרים יודיד שימש כתחליף למצע anionic, אם כי בתפוקה נמוכה יותר מכפי שאפשר לצפות למצע ילידים. השיטה עשויה להיות מתאימה להסתגלות לחלבונים אחרים עם גמסלולי תחבורה או הולכה ationic מצעי anionic.
כאן תהליך טיהור מהיר מתואר לחלבון CFTR והרכבתה מחדש לproteoliposomes של שומנים בדם מוגדרים. הליך הכינון מחדש המהיר יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם CFTR מטוהר על ידי שיטות אחרות, ובלבד שהסוג של חומר ניקוי בטיהור ניתן להסרה בשיטות המשמשות כאן או ניתן להחליף אבקת כביסה מתאימה לפני הליך הכינון מחדש. שיטת זרימת יודיד למדידת פעילות ערוץ חלבון CFTR המטוהר והמשוחזר של מתוארת בפירוט וכמה תוצאות טיפוסיות שניתן להשיג משיטה זו מוצגות.
1. טיהור של CFTR
הערה: נא ראה טבלה של חומרים וציוד לרשימה של ציוד וחומרים המשמשת בפרוטוקול זה. פרוטוקול מפורט קיים לביטוי יתר של האדם WT-CFTR ומוטציות בf S מערכת ביטוי 9-baculovirus 17,28. ביטוי יתר CFTR ולהכין כדורים של f S 9 תאים על פי פרוטוקול זה.
2. כינונה מחדש של CFTR
3. מדידות יודיד בזרימת לCFTR מזוקק, כששב ל
מתוארים בפרסום בכתב זה הם שיטות לטיהור, מחדש ולמדוד את פעילות ערוץ מוסדרת של חלבון CFTR. איור 1 א מציג את זרימת העבודה לטיהור, הכינון מחדש ונהלים בזרימת יודיד. שיטות למדידת הכינון מחדש ופעילות ערוץ על-ידי שטף יודיד גם מוצגות בפירוט נוסף בווידאו קשור.
יש כבר מספר מוגבל של פרוטוקולי טיהור לאורך מלא, בידוד CFTR פונקציונלי, ממגוון רחב של מערכות ביטוי יתר סלולריות. השיטה המתוארת כאן היא יתרון שכן היא מאפשרת טיהור מהירה של WT-CFTR או גבוהה העשרת F508del- וG551D-CFTR בכמויות מתונות שהיא מאוד פונקציונלי במבחנים כוללים ATPase ומדידות ישיר...
המחברים מודים לעצתו של ד"ר Mohabir Ramjeesingh במהלך פיתוח של שיטות הטיהור שתוארו כאן. מחקרים אלה נתמכו על ידי מענקים תפעוליים לCEB מהמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) וציסטיק פיברוזיס קנדה (CFC). PDWE נתמך בחלקו על ידי פרסים מלגה דרך CIHR וCFC. המחברים מודים מתן המתקן, potentiator ותרכובות מעכב מד"ר ר 'גשרים (אוניברסיטת רוזלינד של רפואה ומדע) והפצה על ידי Therapeutics האיגוד סיסטיק פיברוזיס (CFFT). המחברים גם להכיר בשירות יוצא מן הכלל על ידי המתקן ביילור תרבית תאים (CA125123 P30 מענק NIH) בביטוי WT וחלבון CFTR מוטציה שימוש במערכת baculovirus. אנלוגי VX-770 לא פעיל, V-09-1188, היה מתנה של תרופות ורטקס.
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001) |
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w) |
PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
[header] | |||
Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup. |
small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved