JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שתואר כאן הוא הליך מהיר ויעיל לכינון מחדש פונקציונלי של מטוהר wild-type וחלבון CFTR מוטציה המשמרת את פעילות לערוץ כלוריד הזה, שהוא פגום בסיסטיק פיברוזיס. זרימת יודיד מproteoliposomes מחדש בתיווכו של CFTR מאפשרת לימודים של פעילות ערוץ ואת ההשפעות של מולקולות קטנות.

Abstract

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR) הוא חבר יוצרי ערוץ ייחודי של ATP כריכת קלטת superfamily (ABC) של מובילים. פעילות ערוץ זירחון וכלוריד התלוי נוקלאוטיד של CFTR נחקרה לעתים קרובות במערכות תא כולו וכערוצים בודדים בתיקוני קרום נכרתו. מוטציות הגורם לסיסטיק פיברוזיס רבים הוכחו לשנות פעילות זו. בעוד מספר קטן של פרוטוקולי טיהור פורסמו, שיטה מהירה לשיקום שומרת פעילות ערוץ ושיטה מתאימה ללימוד פעילות ערוץ אוכלוסייה במערכת מטוהרת היו חסרה. שיטות כאן מהירות מתוארות לטיהור וכינון מחדש תפקודי של חלבון CFTR באורך המלא לproteoliposomes של הרכב שומנים בדם מוגדר ששומר על פעילות כערוץ הליד מוסדר. שיטה זו הכינון מחדש יחד עם assay מבוסס שטף רומן של פעילות ערוץ היא מערכת מתאימה ללומד את מאפייני אוכלוסייה של ערוץ CFTR סוג בר ומוטציות הגורמות למחל F508del- וG551D-CFTR. באופן ספציפי, יש לו את השיטה שירות בלימוד ההשפעות הישירות של זירחון, נוקלאוטידים ומולקולות קטנות כגון potentiators ומעכבים על פעילות ערוץ CFTR. השיטות גם נתונים למחקר של ערוצים / מובילי קרום אחרים למצעי anionic.

Introduction

תחבורת כלוריד פני ממברנות הפסגה של תאי האפיתל ברקמות כגון בלוטות ריאות, מעי, הלבלב וזיעה מתווכת בעיקר על ידי סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR), ATP- וחבר-מוסדר זירחון של ABC (ATP- כריכת subfamily הקלטת) C של חלבונים בממברנה (הנסקרת ב 1). כמו חברים אחרים של תת-משפחת Abcc, CFTR הוא חלבון גדול, רב-פורש נפרד קרום שקושר ATP בשני אתרי קישור נוקלאוטיד נוצרו בממשק של תחומים מחייב נוקלאוטיד (NBDs), בם יש לי פעילות ATPase צנועה באחת אתר. עם זאת, בניגוד לחברים תת-משפחת Abcc אחרים, CFTR התפתח כערוץ Cl מוסדר ייחודי ולא כטרנספורטר המומס פעיל.

מוטציות בגורם CFTR סיסטיק פיברוזיס, מחלה הפוגעת באיברים רבים, כולל ריאות, מערכת עיכול, לבלב ואיברי רבייה, שמובילות לmorbidity ותמותה במבוגרים צעירים. מחלת ריאות בדרך כלל חשבונות לתמותה מוקדמת בסיסטיק פיברוזיס וברוב המקרים נגרמת על ידי אובדן תפקוד CFTR על האפיתל של דרכי הנשימה ביצוע המשטח. חוסר בפעילות ערוץ כלוריד CFTR גורם להפחתה בשני Cl - ותנועת מים על פני האפיתל פני השטח כדי לשנות את שכבת הנוזל על משטח הפסגה של אפיתל הנשימה ריסי. התוצאה היא נוזל צמיג שטח בדרכי נשימה שפוגע ביכולת של תאי אפיתל נשימה ריסי ליעילות פתוגנים מדרך הנשימה ברורים. כתוצאה מכך, רוב חולי CF סובלים מהתקפים חוזרים ונשנים של דלקת ריאות ונזק ריאות בשל דלקת.

כצפוי, מחקרים של מנגנון פעולה של חלבון CFTR הנורמלי התמקדו בעיקר במחקרי אלקטרו מפורטים של פעילות gating הערוץ שלה. מחקרי ערוץ אחד הראו כי פונקציות ישירות CFTR כPKA-תלוי Cl- ערוץ שבו בעל שער מוסדר ATP 2. מחקרי אלקטרו מפורטים לספק מידע רב על ערוצי CFTR יחידים 1,3, אולם ייתכנו דאגה באשר לשאלה האם המאפיינים של כל ערוץ אחד מסוים שנחקר הוא שיקוף של כל אוכלוסיית ערוצי CFTR ולכן ערוץ אחד תוצאות תמיד צריכים לשקול יחד עם שיטות ללמוד האוכלוסייה מקרוסקופית. assay הישיר של פעילות ערוץ האוכלוסייה של CFTR מטוהר יש הפוטנציאל לספק תובנה הפגם המולקולרי הקשורים למוטציות הגורמות למחלות ולנהוג גילוי מאפננים כימיים שתיקון חלבוני CFTR המוטציה. נכון להיום, יש עודף של 1,900 מוטציות שונות בCFTR חשבו לגרום סיסטיק פיברוזיס 4. המוטציה הגדולה, F508del-CFTR, הנמצאת באלל אחד לפחות בכ -90% מהחולים בצפון אמריקה ובאירופה מובילה לחלבון misfoldingשמירת nd בreticulum endoplasmic 5. F508del-CFTR יש גם השלכות אחרות, הכולל את פעילות ערוץ פגום 6-9. היעדרות כתוצאה של CFTR מתא השטח מזוהה עם מחלה קשה. G551D-CFTR, מוטציה נפוצה פחות, הוא חשב להיות מקופל עדיין כראוי הוא לא מתפקד כערוץ כלוריד על פני תא 6. הפיתוח של מתקן מולקולה קטן וpotentiators יש את המטרה של תיקון מתקפל ו / או סחר של מוטציות כגון F508del-CFTR לשטח פני התא, וpotentiating או הגדלת פעילות הערוץ של מוטציות כגון G551D כאשר קיים על פני התא, בהתאמה . בעוד מתקן VX-809 וVX-661 (עדיין לא אושר לשימוש בחולים, potentiator Kalydeco (ivacaftor; VX-770) נמצא בשימוש ב 150 מ"ג כל 12 שעות בחולי CF> 6 שנים עם לפחות אחד G551D מוטציה -CFTR, ולאחרונה בחולים עם אחד מG178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255PוG1349D. Kalydeco הוא גם בטוח וגם תוצאות בשיפור אמצעים קליניים של המחלה CF 10, אולם מנגנון פעולה של מולקולה קטנה זה הבין היטב בעת אישור ה- FDA לשימוש בחולים.

קומץ של שיטות טיהור CFTR תוארו בעבר 2,11-18, שרבים מהם דורשים אורך ניכר של זמן כדי להשלים. בפרסום האחרון 19, שיטת טיהור והכינון מחדש מהירה ייחודית תוארה לCFTR ביטוי יתר במערכת הביטוי 9 תא f S, וחלבון מטוהר זה במערכות שומנים מוגדרות שימש לפיתוח assay פעילות ערוץ הליד CFTR לאוכלוסייה של CFTR מולקולות. Assay משחזר את ההשפעות הידועות של זירחון, נוקלאוטידים ומעכבים על תפקוד CFTR. המערכת הייתה בשימוש כדי לחקור את ההשפעות של potentiator VX-770 / Kalydeco על Wt- (wild-type), F508del- וG551D-CFTR וזה הוצגו בראשוןזמן שתרופת אינטראקציה ישירות עם חלבון CFTR להגברת פעילות הערוץ שלה באופן ATP-עצמאי, הממחישה את התועלת ותחולתה של שיטות אלה לחקר האינטראקציה של CFTR ומוטציות עם נוקלאוטידים ומולקולות קטנות מנקודת מבט אוכלוסייה ל לענות על שאלות רלוונטיות מבחינה קלינית על החלבון. השיטות יש גם שימשו ללמוד מולקולות אחרות potentiator ונגזרותיהם 20, כמו גם את ההשפעות של מתקן מולקולה קטן בפעילות של החלבון 21.

מבחני בזרימת היו בשימוש במחקרים רבים בעבר כדי לחקור את הפעילות של מוטציות CFTR ואת ההשפעות של תרכובות CFTR-modulatory על פעילותה, ובכלל זה מבחני תא כולו באמצעות אלקטרודות, קליעים נותבים רדיואקטיבי וfluorophores 22,23, שלפוחית ​​עם קרום אלקטרודות סלקטיבית יון 24 , וטהר CFTR מחדש עם קליעים נותבים רדיואקטיבי 25. עם זאת thשימוש בדואר של אלקטרודות סלקטיבית היון ללמוד מטוהר CFTR מחדש דווח לראשונה לאחרונה 19. הסתגלות של השיטה הנוכחית הייתה בשימוש כבר הכינון מחדש ואפיון פונקציונלי של שני חלבוני קרום בPseudomonas aeruginosa, הפתוגן CF נפוץ. הכינון מחדש חלבון מטוהר alge חיצוני קרום יחד עם מדידות זרימת יודיד שלהם המשמשים לתמיכת מודל להפרשת אלגינט anionic דרך טרנספורטר זה 26. כינונה מחדש ומדידות זרימת יודיד יושמו חלבון Wzx המטוהר, שאיפשר מודל להצעה שמציעה H + מנגנון antiport + תלוי לטרנסלוקציה oligosaccharide צמוד שומנים על פני הקרום הפנימי החיידקים על ידי חלבון זה 27. בשני המקרים יודיד שימש כתחליף למצע anionic, אם כי בתפוקה נמוכה יותר מכפי שאפשר לצפות למצע ילידים. השיטה עשויה להיות מתאימה להסתגלות לחלבונים אחרים עם גמסלולי תחבורה או הולכה ationic מצעי anionic.

כאן תהליך טיהור מהיר מתואר לחלבון CFTR והרכבתה מחדש לproteoliposomes של שומנים בדם מוגדרים. הליך הכינון מחדש המהיר יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם CFTR מטוהר על ידי שיטות אחרות, ובלבד שהסוג של חומר ניקוי בטיהור ניתן להסרה בשיטות המשמשות כאן או ניתן להחליף אבקת כביסה מתאימה לפני הליך הכינון מחדש. שיטת זרימת יודיד למדידת פעילות ערוץ חלבון CFTR המטוהר והמשוחזר של מתוארת בפירוט וכמה תוצאות טיפוסיות שניתן להשיג משיטה זו מוצגות.

Protocol

1. טיהור של CFTR

הערה: נא ראה טבלה של חומרים וציוד לרשימה של ציוד וחומרים המשמשת בפרוטוקול זה. פרוטוקול מפורט קיים לביטוי יתר של האדם WT-CFTR ומוטציות בf S מערכת ביטוי 9-baculovirus 17,28. ביטוי יתר CFTR ולהכין כדורים של f S 9 תאים על פי פרוטוקול זה.

  1. הכנת קרום גולמי
    1. להשיג טרי או להפשיר תא גלולה קפוא S f 9 מתרבות 500 מיליליטר של תאי חלבון wildtype-, F508del-, או G551D-CFTR עימו 10 -tag C-המסוף להביע מעל, גדל בשיטות תרבית תאים סטנדרטיים, כפי שתואר לעיל 17,28. כדורי תא יהיו בהיקף של כ 5 מיליליטר ומשקל רטוב של כ 5 גרם.
    2. f S Resuspend 9 תאים ב 20 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS) pH 7.4 עם מעכבי פרוטאז קוקטייל (1 לוח לכל 50 מיליליטר) בשעה 4 ° C, על מנת להבטיחמדגם מופיע חזותי הומוגנית וללא גושים של תאים נשארים.
    3. תאי Lyse באמצעות משבש תא לחץ גבוה (טבלה של חומרים וציוד), והגיע למינימום של 10,000 psi (רצוי 15,000-20,000 psi) עבור 2 דקות למעבר. שמור את המדגם על 4 מעלות צלזיוס במהלך תמוגה.
      1. לאסוף את הדגימה בצינור על קרח לאחר תקופת תמוגה לאחר מכן טען המדגם במשבש התא באופן מיידי. הליך תמוגה חזור 3 פעמים. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח פחות מ -10% יישארו ללא שינוי.
        הערה: תאי שיטות אחרות לlyse, כגון חרוזי זכוכית, וכו 'כאמורים לא נבדקו בקפדנות למערכת זו, עם זאת, משתמש עשוי למצוא שיטה חלופית כמתאימה.
    4. חומר צנטריפוגה תמוגה תא על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה במהירות גבוהה XG ב 2000 עבור 20 דקות. לאסוף את supernatant ולהשליך את הכדור. מחלקים את supernatant בין 20 צינורות וצנטריפוגה הדגימות עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס ב125,000 XG בראש טבלת ultracentrifuge.
    5. להסיר ולסלק supernatant, נזהר שלא להפריע את הכדור, וכדורי חנות באותו הצינורות ב -80 המעלות צלזיוס למשך פחות מ -2 חודשים עד לשימוש, או לשמור על קרח ולהמשיך בטיהור באופן מיידי.
  2. solubilization CFTR
    1. להשיג 1-4 9 כדורי קרום גולמי f S טריים או קפוא וresuspend כל 1 מיליליטר של הצפת 1 (FOS 2% -choline; ראה טבלה 1 למתכון מלא) בשעה 4 ° C על קרח, באמצעות מחט 25 G ו 1 מזרק מיליליטר עד הפתרון הוא הומוגנית לפי העין ללא גושי קרום תא גלויים. איפה גלולה יותר מפעם אחת הוא להיות solubilized, תמשיך לטפל בכל דגימה להוראות לגלולה אחת מתחת במקביל, איגום הדגימות בשלב 1.3.2.
    2. לפזר לוח מעכב פרוטאז מיני 1 ב 1 מיליליטר של הצפת 2 (imidazole 10 מ"מ; ראה טבלה 1) שאין בו חומר הניקוי 14 -choline Fos (מעכבי פרוטאז הם 10x concent יותרדירוג מאשר הדילול מומלץ בשלב זה) ולהוסיף לגלולת הקרום הגולמי resuspended 100 μl (מעכבי פרוטאז הם בדילול מומלץ בשלב זה). קבע על קרח במשך 45-60 דקות עם ערבוב על ידי היפוך 5 פעמים כל 5 דקות.
    3. צנטריפוגה resuspended גלולה קרום גולמי בultracentrifuge בראש טבלה במשך 25 דקות ב 125,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. שמור את supernatant, אשר מכיל CFTR solubilized וזורקים את הכדור.
  3. טור מחייב, זירחון וelution
    1. שטוף 400 μl של ניקל-נ.ת.ע slurry (חומצת nitrilotriacetic) agarose או שרף שווה ערך עם 1 מיליליטר של הצפת 2 (imidazole 10 מ"מ; ראה טבלה 1) שאין בו חומרי ניקוי, כדי להסיר ממס וחיץ על 4 מעלות צלזיוס. חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
    2. לשלב CFTR solubilized, מעכב פרוטאז שנותר (900 μl) ושרף ניקל (מ -400 slurry μl) לסך של 10 מיליליטר עם הצפת 2 (10 imidazole מ"מ; ראה טבלה 1) which חסר כל חומר ניקוי הוסיף. הריכוז 14 -choline פוס מדולל ביעילות ל -0.2% (w / v) בשלב זה. אם יש צינורות מרובים, בריכה כל הדגימות המכילות CFTR solubilized, מעכבי פרוטאז, שרף ניקל-נת"ע ו -0.2% (w / v) -choline-14 Fos בשלב זה. דגירה של 60 דקות ב 4 ° C עם רעד עדין.
    3. לעבור פתרון נת"ע המעכב-ניקל CFTR-פרוטאז את טור קטן הקרנה (טבלה 1) או עמודה ריקה שווה ערך.
    4. לשטוף את שרף נת"ע ניקל, אשר נשמרת בעמודה, עם 4 מיליליטר לגלולה ראשונית של הצפת 3 (imidazole 10 מ"מ + DDM; ראה טבלה 1) שאין בו Fos -choline 14 אך מכילה 1 מ"מ DDM (חומר ניקוי maltoside dodecyl), ב 4 מעלות צלזיוס. תוספת של חומר ניקוי DDM אינה משנה באופן משמעותי את ה- pH של חיץ זה.
    5. הכן פתרון PKA-MgATP על ידי הוספת 25 μl (5 מ"מ, ריכוז סופי) של MgATP, 2500 U של cAMP-dependent kinase החלבון, מקטע קטליטי (PKA) 475 μl של הצפת 3 (10 מ"מ imidazole + DDM; ראה טבלה 1) לעמודה. Phosphorylate חלבון על ידי איטום הקצה התחתון של העמודה עם כובע או Parafilm, והוספת 500 μl של פתרון PKA-MgATP לכל גלולה ראשונית בשימוש.
    6. דגירה בטמפרטורת חדר (C ° 20) במשך 20 דקות עם ערבוב וresuspension של השרף באמצעות pipettor 1 מיליליטר כל 2 דקות עדינים על מנת להבטיח שPKA בא במגע עם פני השטח של שרף נת"ע ניקל.
    7. הסר את המכסה וelute פתרון PKA / MgATP מהעמודה. לשטוף את העמודה עם 2 מיליליטר של חיץ 3 (10 מ"מ imidazole + DDM; ראה טבלה 1) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
    8. להכפיל את מספר כדורים ששמשו בניסוי על ידי 4. לשטוף את העמודה עם מספר כזה של 4 מיליליטר של הצפת (imidazole 50 מ"מ + DDM; ראה טבלה 1) על 4 מעלות צלזיוס, על ידי הוספת 4 מיליליטר של חיץ לעמודה, המאפשר לה לזרום דרך ומייד הוסיף aliquot 4 מיליליטר ליד העמודה.
    9. Elute החלבון על ידי העברה (imidazole 600 מ"מ + DDM; ראה טבלה 1) 1 מיליליטר של הצפת 5 על 4 מעלות צלזיוס לגלולה ראשונית המשמשת דרך העמודה, 1 מיליליטר בכל פעם בלי הפסקה כדי לאפשר לטור לייבוש, ו לאסוף את כל eluate מכיל CFTR מטוהר בצינור אחד.
    10. להתרכז מדגם חלבון כדי להסיר מוצרי imidazole והשפלה משקל מולקולרי נמוכה באמצעות מכשיר סינון צנטריפוגה (חתוך 100,000 משקל מולקולרי) כאמור בטבלה של חומרים וציוד או מכשיר דומה אחר, בסכום כולל של 10 מיליליטר הצפת 6 (75 מ"מ KI + DDM; ראה טבלה 1) או חיץ אחר של בחירה המכילה 1 מ"מ DDM (כגון 7 הצפת לניסויים בזרימת בלתי יודיד, 25 מ"מ HEPES + DDM; ראה טבלה 1), על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 ו- 4 מעלות צלזיוס במשך כ -20 דקות עד המדגם מתרכזת 200 μl. לדלל מדגם 10 מ"ל ולחזור על שלב הריכוז.
      הערה: מניסיוננו (לא פורסם), imidazole inhi באופן משמעותירסיסים את פעילות ATPase של CFTR, ויש להסיר בשלב זה על ידי דילול וריכוז לפחות פעמיים אם המדגם ישמש למדידות פונקציונליות.
    11. לאסוף CFTR מטוהר מרוכז. שמור על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות של חיץ DDM עד לשימוש בתוך 1-2 ימים או להמשיך באופן מיידי לצעד הכינון מחדש. אין להקפיא חלבון המטוהר, כמו בניסיון שלנו אנו רואים את פעילותו המצומצמת.

2. כינונה מחדש של CFTR

  1. הכנת שומנים בדם
    הערה: CFTR כבר מחדש בהצלחה לביצה PC, POPC, 2: 1 (w / w) PC ביצה: POPC (1: 1 w / w) תערובת, או תערובת של PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (w / w).
    1. בניסויים יודיד בזרימת, מ"ג היבש 5 של ביצת PC (200 μl של 25 מ"ג / מיליליטר מניות, ראה טבלה של חומרים וציוד) תחת זרם של גז ארגון במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בפיירקס או יציב אחרים (לא ורוסיליקט ) שפופרת זכוכית.
    2. באמצעות הספיגה ב 280 ננומטר, ELISAssay או שיטה אחרת, להעריך את הריכוז של מדגם חלבון CFTR המטוהר. לניסויים בזרימת יודיד עם CFTR wildtype, להשתמש חלבון: יחס שומנים של 1: 300-1: 3000 (w / w) כדי לייצר אות מספיק. לG551D- וF508del-CFTR, להשתמש חלבון: יחס שומנים של כ 1: 200-1: 1,200 (w / w) כדי לזהות פעילות בזרימת.
    3. לייעל את החלבון: יחס שומנים למערכת מסוימת כל אחד. חשב את הנפח של חלבון מטוהר הנדרש. חשב את הנפח של חיץ עם 1 מ"מ DDM הנדרש כדי להפוך את נפח סופי של 1 מיליליטר, כלומר, 1 מיליליטר - (נפח של פתרון חלבון הנדרש) = נפח של חיץ.
      1. הוסף את הנפח המחושב של מערכת החיץ הרצויה עם 1 מ"מ DDM לשומנים בדם המיובש (אך לא להוסיף את חלבון CFTR בשלב זה) ולכסות את שפופרת הזכוכית עם Parafilm. לניסויים בזרימת יודיד, resuspend שומנים במאגר 6 (75 מ"מ KI + DDM; ראה טבלה 1). בניסויים אחרים resuspend במאגר 8 (25 מ"מ HEPES + DDM, לראותטבלת 1) או אחר חיץ פנימי רצוי המכיל 1 מ"מ DDM.
      2. מערבולת למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר כדי לסייע בהשעיה של השומנים בדם במאגר DDM. לחלופין, לחמם את המדגם ל -37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות לפני vortexing.
    4. להשעות את השומנים בדם שוב ושוב בטמפרטורת חדר עם מזרק 1 מיליליטר ומחט 25 G עד שלא סרט שומנים גלוי על הצדדים של הצינור. הימנע מהזרקת אוויר לתוך הפתרון שמייצר בועות עדינות ולסייע בחמצון של יודיד ושומנים.
    5. Sonicate השומנים התלויים בParafilm מכוסה צינור לפרץ 20 שניות בקרח sonicator אמבטיה המכיל, ולאחר מכן להעביר מייד לקרח 1 דקות. חזור 3 פעמים.
      הערה: sonication אינטנסיבי הופכת פתרונות יודיד צהובים עקב חמצון. לכן להימנע sonication מוגזם. לפקח על המדגם לשינויי צבע. אם שינוי צבע יצוין, לבטל את המדגם ולהכין שוב. השינוי בצבע עקב חמצון של חלק מיודיד יביא חמצון של השומנים באותם תנאים. עקירת האוויר מהצינור עם גז ארגון לפני sonicating הפתרון תסייע למנוע חמצון של שומנים ויודיד. sonication האינטנסיבי יכול לשבור באיכות ירודה או צינורות זכוכית שרוטים ותוצאה הוא אובדן של המדגם.
    6. הוסף את הנפח של CFTR מטוהר מחושב בשלב 2.1.3 למדגם השומנים sonicated להשגת נפח סופי של 1 מיליליטר. מערבבים את החלבון עם פתרון השומנים וחומרי ניקוי על ידי resuspension 10 פעמים עם מזרק מחט 25 G ומ"ל 1.
    7. מדגם שומנים וחלבונים שנקבע על קרח למשך 30 דקות עם מתערבל של צינור לערבב 5 פעמים כל 5 דקות.
  2. הכנת טור מחייב חומר ניקוי
    1. השג טור ליחד מסחרי מחייב חומר ניקוי ספין (ראה טבלה של חומרים וציוד) עם קיבולת נפח 1 מ"ל ולשבור את הכרטיסייה התחתונה כדי להתחיל את הטור זורם.
    2. צנטריפוגה העמודה במשך 2 דקות XG ב 2000 כדי להסיר את האחסון בuffer, וזורקי החיץ הזה.
    3. הוסף 5 מיליליטר של חיץ 7 (75 מ"מ KI, ראה טבלה 1) לעמודה ואז צנטריפוגות ב XG 200 למשך 4 דקות לelute החיץ לשטוף. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר עבור הסכום כולל של 3 שוטף כדי להסיר כל העקבות של חיץ האחסון. מחק את כל הזרימה דרך.
      הערה: זה קריטי, כי המאגר משמש כדי לשטוף את העמודה אינו מכיל DDM או כל חומר ניקוי אחר. יש עמודת קיבולת מחייבת סופית לחומרי ניקוי ואם מאגר המכיל חומר ניקוי משמש, הטור לא יהיה יעיל בהסרת חומר הניקוי ממדגם החלבון-שומני חומר הניקוי.
    4. aliquot בעיון את כל 1 מיליליטר של מדגם שומני חומר ניקוי החלבון על החלק העליון של שרף טור דגירה מדגם בחלק העליון של העמודה במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר.
    5. צנטריפוגה המדגם בטמפרטורת חדר למשך 4 דקות XG ב 2000 ולאסוף את מדגם מעונן proteoliposome בצינור microfuge נקי של 1.5 או 2 מיליליטר או שפופרת זכוכית ולמקם את סםPLE על קרח.
    6. לאסוף proteoliposomes שנותר בעמודה על ידי הוספת 200 μl של הצפת 7 (75 מ"מ KI, טבלת 1) או חיץ אחר (ללא חומר ניקוי) לחלק העליון של העמודה ולחזור על שלב צנטריפוגה למשך 2 דקות.
    7. הוסף את eluate השני למדגם proteoliposome אם זה נראה מעונן.
    8. חנות המדגם ב 4 ° C למשך הלילה או להשתמש באופן מיידי למדידות זרימת יודיד.

3. מדידות יודיד בזרימת לCFTR מזוקק, כששב ל

  1. דור של שיפוע יודיד על פני קרום proteoliposomal
    1. חרוזים טרום להתנפח Sephadex G50 במאגר 9 (75 מ"מ K-Glu; גלוטמט אשלגן, ראו טבלה 1), (חרוזים כ 5 גרם יבשים ב 50 מיליליטר חיץ) או חיץ חיצוני רצוי בטמפרטורת חדר למשך לפחות שעה 2 או 4 ° C למשך הלילה.
    2. הכן 4 עמודות Sephadex G50 רוויות במאגר 9 (75 מ"מ K-Glu, ראה טבלה 1) או אחרתחיץ בטורי הקרנה קטנים על ידי טעינת שרף לפחות ¾ מלא בעמודה.
    3. צנטריפוגה למשך 4 דקות XG ב 2000 כדי להסיר חיץ עודף מהשרף. לא צריך להיות כ 2.25 מיליליטר של שרף hydrated ארוז בטור בסוף צעד צנטריפוגה.
      הערה: שרף צריך להיות התייבשות קלה אך לא שקוע בנוזל וספין קצר לאחר מכן לא צריך elute היקפים משמעותיים של מאגר. זה קריטי לelution המוצלחת של מדגם proteoliposome ששרף הטור הוא לא רטוב מדי ולא יבש מדי והמשתמש עשוי להזדקק להתנסות עם העמודות כדי להכיר את תנאי חילופי חיץ המוצלחים ביותר.
    4. בזהירות להוסיף 125-150 μl של proteoliposome מדגם לחלק העליון של כל עמודה ו צנטריפוגות במשך 4 דקות ב2,000 g x.
    5. proteoliposome הבריכה eluates יחד לשימוש מיידי בזרימת יודיד או ניסויים אחרים.
      הערה: נפח eluted מכל עמודה צריך להיות בערך150 μl והמדגם צריך להיות קצת מעונן, אבל פחות מעונן מהמדגם המקורי. נפחים גדולים יותר או eluates ברור מצביעים על כך שהטורים לא היו מיובשים מספיק, או שהתייבשו יותר מדי, בהתאמה, ולא יגרמו לניסוי בזרימת יודיד מוצלח.
  2. assay הזרימה יודיד
    1. לשטוף אלקטרודה יודיד סלקטיבית מיקרו (טבלה של חומרים וציוד) בהרחבה במי דה המיונן, ואז דגירה במשך 20 דקות לפני הניסוי במאגר 10 (15 מיקרומטר KI, ראה טבלה 1). שטוף את האלקטרודה שוב בהרחבה במי דה המיונן.
    2. להוסיף 150 μl של תרופה (ריכוז טיפוסי 20 מיקרומטר לייצר ריכוז סופי של 10 מיקרומטר בassay) במאגר 9 (75 מ"מ K-Glu, ראה טבלה 1) או רכב ב9 הצפת ולאחת מצלחת 96-היטב עם בר ומערבב פשפשים קטן.
      1. ודא שאין בועות בהווה. השתמש קצה פיפטה כדי להסיר תועהבועות. אם נעשה שימוש בפתרון תרופתי, להבטיח כי ריכוז DMSO הסופי בבאר הוא פחות מ -1% (V / V) (בדרך כלל 0.1-0.2% (V / V)).
    3. להוסיף 150 μl חלבון CFTR מחדש שהופק בסעיף 3.1 במאגר של 9 (75 מ"מ K-Glu, ראה טבלה 1) להיטב עם תרופה או חיץ, כדי לייצר בנפח כולל של 300 μl בבאר של הצלחת.
    4. מניחים את צלחת 96-היטב על צלחת ומערבבים ומערבבים ב 130 סל"ד (או במהירות בינונית של כ ¼ של המהירות המרבית).
    5. הכנס את קצה האלקטרודה סלקטיבית יודיד בזהירות לתוך הבאר עם המדגם כזה הקצה לא נוגע בתחתית הבאר או מפגיעת בר והמערבב. ודא שאלקטרודה ההתייחסות, אם נפרד, גם היא במגע עם הפתרון בבאר.
    6. העתקי שיא באמצעות תוכנת מחשב תוצרת בית או מסחרי ממשקים עם אלקטרודה (ראו טבלה של חומרים וציוד לפרטים נוספים).השתמש בקצב דגימה של 2 הרץ, עם סינון של האות דרך מסנן מעביר נמוך.
    7. לאפשר את המדגם כדי לאזן במשך 5 דקות כדי לייצר בסיס שטוח יציב שטוח, או בסמוך בעת ההקלטה.
    8. הוסף 3 μl MgATP (100 מניות מ"מ מוכנות ב DH 2 O ומותאמים pH 7 עם KOH; 1 מ"מ ריכוז סופי) לדוגמא, כדי להפעיל את החלבון. לאפשר ~ 5 דקות כדי להגיע לבסיס יציב חדש. תמיד להתאים את ה- pH של מניית מ"מ MgATP 100 לניטראליים לפני השימוש כדי להימנע משינויים ב- pH של החיץ החיצוני.
    9. הוסף 3 μl של valinomycin מניות (2 מיקרומטר; 20 ננומטר ריכוז סופי) לדוגמה כדי לדחוק שינויים בפרש פוטנציאל שנוצר על ידי מוליכות יודיד סלקטיבי דרך CFTR. רשום את מדרון הירידה (ירידה בmV) עקב פעילות בזרימת יודיד בתיווך CFTR במשך 5 דקות לפחות.
    10. כדי להבטיח שהלכידה של יודיד בלומן proteoliposome הייתה מספיק, להוסיף 3 μl של 10% (v / v) טריטון X-100 לדוגמא. משמעותיתt ושחרור יודיד מיידי מצביעים על כך שיודיד מספיק כבר לכוד בשלפוחית ​​כך שההשמנה לא הייתה הגורם המגביל לשינויים במדרון שנקבעו ב3.2.9 אלא הפעילות בתיווך CFTR.
    11. שטוף את בר אלקטרודה ומערבבים היטב במים דה המיונן לאחר הטיפול של דגימות עם תרופה או עם Triton X-100 כדי להבטיח את כל העקבות של חומרים כימיים אלה הוסרו כדי למנוע זיהום של המדגם הבא.
    12. הכן סדרה של ריכוזי KI לדלל במייקרו למגוון של ננו-מולר במאגר 9 (חיץ K-Glu, ראה טבלה 1). רשום את תגובת mV של האלקטרודה לכל ריכוז שבין 0 ל הריכוז הגבוה ביותר שהוכן. בניית עקומה סטנדרטית שבו תגובת הבדיקה (mV) היא להתוות לעומת יומן של ריכוז יודיד טוחנת. השתמש בעקומה סטנדרטית להמיר את תגובת mV של החללית במהלך ניסוי הזרימה לריכוז של יודיד שוחרר.
      הערה: הכן נוכ כיולve על בסיס שבועי עד משתמש הוא בטוח באיזו מהירות התגובה של שינויי הבדיקה. יהיה להיסחף בתגובה והרגישות של הבדיקה לאורך זמן. כפי גילאי הבדיקה, התגובה תהיה לבזות. זה עשוי להיות מבוטל באופן חלקי על ידי שינוי הפנימי הפתרונות מעת לעת ושטיפה נרחבת של הבדיקה הקצה במים לאחר שימוש, שדבקות סביר גבולות של מולקולות על פני השטח הבדיקה.
    13. לקבוע את השיפוע הממוצע של הקו של הריכוז לעומת עלילת זמן עבור כל דגימת proteoliposome במשך 30 שניות האחרונות לפני תוספת של MgATP, ולאחר תוספת של valinomycin אבל לפני תוספת של Triton X-100. הפחת את מדרון הבסיס מvalinomycin כדי לקבוע את הפעילות בזרימת יודיד בתיווך CFTR למדגם ש.

תוצאות

מתוארים בפרסום בכתב זה הם שיטות לטיהור, מחדש ולמדוד את פעילות ערוץ מוסדרת של חלבון CFTR. איור 1 א מציג את זרימת העבודה לטיהור, הכינון מחדש ונהלים בזרימת יודיד. שיטות למדידת הכינון מחדש ופעילות ערוץ על-ידי שטף יודיד גם מוצגות בפירוט נוסף בווידאו קשור.

Discussion

יש כבר מספר מוגבל של פרוטוקולי טיהור לאורך מלא, בידוד CFTR פונקציונלי, ממגוון רחב של מערכות ביטוי יתר סלולריות. השיטה המתוארת כאן היא יתרון שכן היא מאפשרת טיהור מהירה של WT-CFTR או גבוהה העשרת F508del- וG551D-CFTR בכמויות מתונות שהיא מאוד פונקציונלי במבחנים כוללים ATPase ומדידות ישיר...

Disclosures

המחברים מודים לעצתו של ד"ר Mohabir Ramjeesingh במהלך פיתוח של שיטות הטיהור שתוארו כאן. מחקרים אלה נתמכו על ידי מענקים תפעוליים לCEB מהמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) וציסטיק פיברוזיס קנדה (CFC). PDWE נתמך בחלקו על ידי פרסים מלגה דרך CIHR וCFC. המחברים מודים מתן המתקן, potentiator ותרכובות מעכב מד"ר ר 'גשרים (אוניברסיטת רוזלינד של רפואה ומדע) והפצה על ידי Therapeutics האיגוד סיסטיק פיברוזיס (CFFT). המחברים גם להכיר בשירות יוצא מן הכלל על ידי המתקן ביילור תרבית תאים (CA125123 P30 מענק NIH) בביטוי WT וחלבון CFTR מוטציה שימוש במערכת baculovirus. אנלוגי VX-770 לא פעיל, V-09-1188, היה מתנה של תרופות ורטקס.

Acknowledgements

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
fos-choline 14 detergentAnatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)F312Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tabletsRoche (www.roche-applied-science.com)04 693 132 001EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack Roche (www.roche-applied-science.com)05 892 791 001
Ni-NTA AgaroseQaigen GmbH1018240
Fisherbrand Screening columnsFisher Healthcare11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100KMillipore (www.millipore.com)UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic SubunitNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken EggAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840051C
POPCAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)850457C
PS, Porcine BrainAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840032CCFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken EggAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)841118C
ErgosterolSigma (www.sigmaaldrich.com)45480
Pierce Detergent removal spin columnThermo Scientific877791 ml capacity columns
valinomycinSigma (www.sigmaaldrich.com)V-0627
VX-770 (ivacaftor)Selleck ChemicalsS1144
iodide selective microelectrodeLazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)LIS-146ICM 
 
 
 
 
 
[header]
Clampex 8.1 softwareAxon Instruments (www.axon.com)we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)LIS-146LICM-XSLazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir barsBig Science Inc (www.stirbars.com)SBM-0502-CMBchoose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fineGE Health Care (www.gelifesciences.com)17-0042-01
SonicatorLaboratory Supplies Co, Inc.G112SP1GBath sonicators from other manufacturers should also be suitable

References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  5. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
  6. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
  7. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
  8. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
  9. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  10. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
  11. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  12. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
  13. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
  14. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
  15. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
  16. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  17. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  18. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
  19. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
  20. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
  21. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
  22. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
  23. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
  24. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
  25. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
  26. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
  27. Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
  28. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
  29. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
  30. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
  31. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  32. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
  33. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
  34. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
  35. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97CFTR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved