مختبر الأحيائي تغذية الأسماك لتقييم آخر Antipredatory من المركبات الثانوية من الأنسجة من الكائنات البحرية

Summary

هذا الأحيائي توظف الأسماك المفترسة نموذج لتقييم وجود نواتج التغذية رادع من مقتطفات العضوية من أنسجة الكائنات البحرية في تركيزات الطبيعية باستخدام غذائيا مقارنة مصفوفة الغذاء.

Abstract

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

Introduction

علم البيئة الكيميائية وضعت من خلال التعاون من الكيميائيين وعلماء البيئة. في حين كان subdiscipline من الأرضية البيئة الكيميائية في جميع أنحاء لبعض الوقت، أن علم البيئة الكيميائية البحرية ليست سوى بضعة عقود القديمة ولكن قدمت معلومات هامة في البيئة والمجتمع هيكل التطوري للكائنات البحرية ^1-8. الاستفادة من التكنولوجيات الناشئة من رياضة الغطس وNMR الطيفي، ولدت علماء الكيمياء العضوية بسرعة عدد كبير من المنشورات التي تصف نواتج جديدة من اللافقاريات والطحالب البحرية القاعية في 1970s و 1980s ^9. على افتراض أن المركبات الثانوية يجب أن يخدم بعض الأغراض، وكثير من هذه المنشورات المنسوبة بيئيا الخصائص الهامة لمركبات جديدة دون أدلة تجريبية. وفي الوقت نفسه، تم أخذ علماء البيئة أيضا الاستفادة من ظهور الغوص ويصف التوزيعات وفرة من الحيوانات والنباتات القاعية التي كانت تعرف سابقا جيئة وذهابام طرق أخذ العينات غير فعالة نسبيا مثل التجريف. كان الافتراض من هؤلاء الباحثين أن أي شيء لاطئة وميسرة جسديا يجب الدفاع عنه كيميائيا لتجنب الاستهلاك بنسبة ¹⁰ الحيوانات المفترسة. في محاولة لإدخال التجريبية إلى ما كان العمل صفي خلاف ذلك على وفرة الأنواع، بدأت بعض علماء البيئة استقراء الدفاعات الكيميائية من المقايسات سمية ^11. وشملت معظم فحوصات السمية تعرض الأسماك الكاملة أو الكائنات الأخرى لتعليق المائية من مقتطفات العضوية الخام من الأنسجة اللافقارية، مع قرار لاحق للتركيز كتل جافة مقتطفات مسؤولة عن قتل نصف الكائنات الحية الفحص. ومع ذلك، فحوصات السمية لا تحاكي الطريقة التي الحيوانات المفترسة المحتملة ترى فريسة تحت الظروف الطبيعية، وقد وجدت الدراسات اللاحقة عدم وجود علاقة بين سمية واستساغة ^12-13. ومن المثير للدهشة أن المنشورات في المجلات المرموقة تستخدم تقنيات وجود ضئيلة أو معدومة ECOLOGICAلتر أهمية ^14-15 وأن هذه الدراسات لا تزال استشهد على نطاق واسع اليوم. بل لعله أكثر إثارة للقلق أن نلاحظ أن استمرار الدراسات على أساس بيانات السمية التي ستنشر ^16-18. تم تطوير طريقة الأحيائي الموصوفة هنا في أواخر 1980s لتوفير نهج ذات الصلة بيئيا لعلماء البيئة البحرية الكيميائية لتقييم الدفاعات الكيميائية antipredatory. يتطلب الأسلوب المفترس نموذج لعينة استخراج العضوية الخام من الكائن المستهدف عند تركيز الطبيعي في غذائيا مقارنة مصفوفة الأغذية وتوفير البيانات استساغة التي هي أكثر وضوحا من الناحية البيئية من بيانات السمية.

النهج العام لتقييم النشاط antipredatory من أنسجة الكائنات البحرية ويشمل أربعة معايير المهم: (1) يجب أن تستخدم وهو مفترس اختصاصي المناسب في المقايسات التغذية، (2) الأيض العضوية من جميع أقطاب يجب أن يكون استخراجه مستفيض من أنسجة استهداف الحي، (3) يجب على الأيض بالبريد مختلطة في الغذاء التجريبي المناسب من الناحية التغذوية في نفس التركيز الحجمي كما هو موجود في الكائن الحي من التي تم استخراجها، و (4) التصميم التجريبي والمنهج الإحصائي يجب أن توفر مغزى متري للإشارة distastefulness النسبي.

تم تصميم الإجراء المذكورة أدناه خصيصا لتقييم الدفاعات الكيميائية antipredatory في اللافقاريات البحرية في منطقة البحر الكاريبي. نحن توظيف اللبروس bluehead، Thalassoma bifasciatum، باعتباره الأسماك المفترسة نموذجية لهذا النوع شائع على الشعاب المرجانية في الكاريبي وكما هو معروف لتذوق تشكيلة واسعة من اللافقاريات القاعية ^19. يتم استخراج الأنسجة من الكائنات المستهدفة أولا، ثم مجتمعة مع خليط الغذاء، وأخيرا عرضت مجموعة من T. bifasciatum لمراقبة ما إذا كانوا يرفضون الأطعمة المعالجة استخراج. وقد وفرت بيانات الفحص باستخدام هذه الطريقة معلومات هامة في الكيمياء دفاعي من الكائنات البحرية ^12،20-21، لالتاريخ IFE المفاضلات ^22-24، والبيئة المجتمعية ^25-26.

Protocol

ملاحظة: الخطوة 3 من هذا البروتوكول تتضمن موضوعات الحيوانات الفقارية. وقد تم تصميم هذا الإجراء بحيث تتلقى الحيوانات العلاج الأكثر إنسانية ممكن، وتمت الموافقة من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة ولاية كارولينا الشمالية ويلمنجتون.

1) استخلاص الأنسجة

1. استخدام النسيج الذي هو في حالته الطبيعية من الماء وليس ضغط، والمجففة التدريجي أو الرطب بشكل مفرط حيث سيؤدي ذلك إلى تغيير التركيز الحجمي من المركبات الثانوية. قطع أو ختم الأنسجة إلى قطع أو شرائح التي يمكن إدراجها في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. ملاحظة: الأنسجة الطازجة يمكن استخدامها في بعض الحالات، ولكن من الأفضل في كثير من الأحيان إلى قطع أو ختم الأنسجة المجمدة، والتي لا تخضع لعصر عندما قطع.
2. تضاف قطع الأنسجة إلى 30 مل من 1: 1 خليط من ثنائي كلورو ميثان (DCM) والميثانول (MeOH) في أنبوب الطرد المركزي تخرج حتى الحجم النهائي من 40 مل يتم التوصل إليه. يجب التأكد من إجراء جميع الخطوات التي تنطوي على نقلالمذيبات في غطاء الدخان مع التهوية الكافية.
3. غطاء الأنبوب وعكس ذلك عدة مرات، ثم تستنهض الهمم مرارا وتكرارا خلال فترة استخراج 4 ساعة. ملاحظة: خلال هذه الفترة، ويجمع الماء مع MeOH وMeOH الناتجة: المرحلة الماء يفصل من مرحلة DCM. تتعرض الأنسجة بالتناوب لDCM وMeOH: الماء كما مستحلب كما يتم تحريكها الأنابيب.
4. نقل استخراج DCM إلى دورق كروي وتتبخر إلى جفاف على المبخر الدوار باستخدام حرارة منخفضة (<40 ° C). باستخدام الحد الأدنى من المذيبات، ونقل استخراج المجففة إلى 20 مل التلألؤ القارورة. تناسب القارورة مع محول المبخر الدوار، ومرة ​​أخرى تتبخر للجفاف على المبخر الدوار باستخدام حرارة منخفضة (<40 ° C).
   ملاحظة: تتطلب الخطوة التالية استخدام أداة ضغط محلية الصنع التي يمكن تجميعها من قبل الشد العناصر التالية في ترتيب تسلسلي إلى نهاية قضيب الخيوط: (1) الجوز (2) غسالة، و (3) الجوز بلوط. يجب أن تكون إما مثقبة غسالة أوتركيبها بحيث يكون أقل من القطر الداخلي للأنبوب الطرد المركزي 50 مل.
5. العودة إلى أنبوب الطرد المركزي تخرج يحتوي على الأنسجة وMeOH: استخراج المياه، والضغط المتوسط ​​استخراج من الأنسجة من خلال الضغط. نقل MeOH: استخراج المياه لنفس دورق كروي وتخزين مبردة (<10 ° C).
6. إضافة MeOH إلى أنبوب الطرد المركزي تخرج حتى يتم المغمورة الأنسجة الآن المجففة لاستخراج الثاني من 2 إلى 6 مدة ساعة، ثم نقل MeOH جديد استخراج إلى دورق كروي المبردة التي تحتوي على MeOH: استخراج المياه. إذا كان هناك أي قلق من أن الأنسجة لم يتم استخراج تماما، كرر استخراج MeOH 2 إلى 6 ساعة.
7. تجف قبالة MeOH على المبخر الدوار باستخدام الحرارة المنخفضة (<40 ° C). نقل المستخلص المائي المتبقية من دورق كروي إلى القارورة التلألؤ التي تحتوي على مستخلص قطبي المجففة، وذلك باستخدام حجم الأدنى من MeOH لشطف دورق كروي.
8. Evaporate المستخلص المائي للجفاف باستخدام حرارة منخفضة (<40 ° C) على المكثف فراغ. يحتوي على قارورة التلألؤ الآن مجموع الجاف استخراج العضوية الخام من 10 مل من الأنسجة. إخلاء مساحة الرأس من القارورة مع N ₂ الغاز لمنع أكسدة، وختم بإحكام، وتخزين تجميد (-20 ° C).

2) إعداد الطعام

1. إعداد الحبار مسحوق عباءة تجميد المجفف.
   ملاحظة: توفر عباءة الحبار مصدر التغذية التي هي مماثلة لتلك التي من اللافقاريات القاعية أخرى، وسيتم استخدامها كعنصر في substeps 2.2.
   1. حلقات المجمدة ذوبان الجليد من عباءة الحبار في منزوع الأيونات الدافئة (DI) الماء، ثم هريس لهم في خلاط عالية السرعة.
   2. صب طبقة رقيقة من المهروس الحبار عباءة على ورقة الكعكة الضحلة وتجميد (-20 ° C)، ثم كسر ورقة من هريس الحبار المجمد الى قطع صغيرة ليتم مجفف بالتجميد.
   3. يجفد والمجمدة والحبار عباءة هريس بعد إجراءات التشغيل من الاب-eeze أكثر جفافا.
   4. يطحنون القطع مجفف بالتجميد من الحبار عباءة هريس في الخلاط عالية السرعة لتشكيل مسحوق.
   5. في غطاء الدخان، صب عباءة الحبار المجفف في الدقيق المغربل الدوارة وتدقيق لفصل أجزاء كبيرة من الأنسجة من مسحوق ناعم.
   6. نقل عباءة الحبار مسحوق غرامة لوعاء قابل للغلق. إخلاء الحاوية مساحة الرأس مع N ₂ الغاز لمنع الأكسدة وتخزين مجمدة (-20 ° C).
2. تحضير خليط المواد الغذائية.
   ملاحظة: عند تشغيل فحوصات متعددة متتالية، فمن العملي لإعداد ~ 100 مل من خليط الغذاء، ولكن هذه الوصفة قد يمكن تحجيمها إلى حجم أصغر إذا لزم الأمر.
   1. الجمع بين خليط من 3 غرام حمض الألجنيك و 5 ز تجميد المجفف مسحوق عباءة الحبار مع 100 مل من الماء DI في كوب 150 مل. يحرك بقوة مع microspatula لبضع دقائق حتى المسحوق هو رطب تماما ويصبح الخليط متجانسا.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن إضافة تلوين الطعام في هذه الحاديالجيش الشعبي: أنه من الأسهل لإضافة صبغة إلى خليط المواد الغذائية من شأنها أن تولد كل من الخلائط السيطرة المعالجة و(اخفاء الصباغ الطبيعي للاستخراج في استخراج معاملة خليط) بدلا من محاولة لتتناسب مع لون من استخراج معاملة الخليط بإضافة صبغ إلى خليط السيطرة. ومخضر أو ​​البني لون الطعام وغالبا ما يكون من المرغوب فيه لإخفاء أي أصباغ في استخراج النفط الخام.
   2. تحميل بالضبط 10 مل من خليط الغذاء إلى حقنة تخرج. الحرص على تجنب إدراج فقاعات الهواء أثناء هذه العملية.
   3. إزالة 20 مل قارورة التلألؤ مع الجاف استخراج العضوية الخام من الثلاجة. إضافة قطرة أو اثنتين من MeOH، ثم يقلب استخراج في خليط متجانس مع microspatula.
   4. إخراج تحميل حقنة 10 مل من مصفوفة الغذاء في التلألؤ قارورة 20 مل ويحرك مع microspatula لتجانس استخراج معاملة خليط الغذاء.
      ملاحظة: قد تساعد على إخراج الحقنة في دفعات صغيرة (أي إخراج 2 مل والتجانس، ثم ص.EPEAT حتى كل مل 10 تم المتجانس).
3. إعداد الكريات الفحص.
   1. تحميل حجم صغير جدا من خليط استخراج (~ 1 مل) في حقنة، وغمر طرف الحقنة في حل من 0.25 M CaCl _2. إخراج محتويات حقنة لتشكيل طويلة، تشبه السباغيتي حبلا.
   2. بعد بضع دقائق، وإزالة حبلا صلابة، ختم عليها إلى 4 مم الكريات طويلة على لوحة قطع الزجاج بشفرة حلاقة، ثم يشطف في ماء البحر.
   3. كرر الخطوات من 2.3.1 و2.3.2 دون بما في ذلك استخراج النسيج لجعل الكريات السيطرة. تأكد لعلاج الكريات السيطرة مع حجم مماثل من المذيبات (انظر إضافة MeOH إلى الخليط المعالج في الخطوة 2.2.3) للسيطرة على إضافة مذيب. إذا كان المطلوب السيطرة السلبية للتأكد من أن الأسماك الفحص يمكن ردعها من التغذية، إضافة ديناتونيوم بنزوات بتركيز 2 ملغ مل ^-1 إلى خليط المواد الغذائية الخام ^27.

3) استساغة الاكلاختبارات بيولوجية

1. أداء المقايسات التغذية مع الصفراء مراحل اللبروس bluehead البرية اشتعلت، Thalassoma bifasciatum، وأبقى في مجموعات من ثلاثة في مقصورات مبهمة من جانب من أحواض المختبر.
2. تقديم الغذاء الكريات من دورق مياه البحر باستخدام ماصة الزجاج مع لمبة المطاط. ملاحظة: قد يستغرق بضعة أيام لتدريب السمك للحصول على الغذاء في هذه الطريقة. والتحفيز تكييف (على سبيل المثال عدد قليل من الصنابير من ماصة على الزجاج حوض السمك) التي تسبق تسليم الأغذية قد تكون مفيدة لتدريب الأسماك أن نتوقع إضافة الكريات الغذاء.
3. وسجل الكريات. النظر في قبول بيليه إذا استهلك بسهولة من قبل الأسماك. النظر في رفض بيليه إذا لم يؤكل بعد مدة لا تقل عن ثلاث محاولات الأسماك واحد أو أكثر من أخذه بعين تجويف الفم، أو إذا اقترب من بيليه وتجاهلها بعد واحدة من هذه المحاولة.
4. عينات التهديف. ملاحظة: وصفت الإجراء فحص باعتباره المخطط الانسيابي في الشكل 1 مجموعة من الأسماك التي ترفض أكل.لا تعتبر الكريات السيطرة على أي خطوة في بروتوكول أبعد من ذلك. هناك نوعان من النتائج المحتملة لتشغيل واحد للمقايسة: العينة إما قبول أو رفض.
   1. تبدأ مع بيليه تحكم للتأكد من أن مجموعة من الأسماك التعاونية. تقدم بيليه المعالجة. إذا كان السمك تقبل بيليه المعالجة، يسجل العينة كما قبلت. إذا كان السمك ترفض بيليه المعالجة، وتقديم بيليه السيطرة لاحق لتحديد ما إذا كانت الأسماك قد توقفت التغذية. إذا كان السمك تقبل سيطرة بيليه لاحق، والنتيجة العينة مرفوضا.
5. النسخ المتماثل. كرر الإجراء فحص مع عشر مجموعات مستقلة من الأسماك لكل استخراج.

4) تقييم أهمية

1. تقييم أهمية الاختلافات في استهلاك السيطرة مقابل الكريات تعامل مع نسخة معدلة من اختبار فيشر الدقيق ^26. تعديل الاختبار بحيث يتم إصلاح المجاميع الهامشية من أجل السيطرة وكريات تعامل، وعلاج لهم على حد سواء عينات عشوائية كما. ملاحظة: هذا يوفر ع = 0.057 عندما تؤكل 7 الكريات. وبالتالي، يعتبر أي استخراج رادع إذا تؤكل 6 أو أقل الكريات، وقبولا إذا تؤكل 7 أو أكثر الكريات.
2. لمقارنة استساغة النسبي بين مجموعات من مقتطفات، حساب متوسط ​​عدد الكريات تؤكل داخل كل مجموعة. الحفاظ على عتبة 6 في الكريات ذلك تعتبر مجموعة من مقتطفات تكرار رادع إذا كان متوسط ​​عدد الكريات تؤكل + الخطأ المعياري (SE) ≤6. ملاحظة: في نتائج تمثيلية، تعيين مجموعة من الأنواع، لذلك تكرار مقتطفات تأتي من الأفراد متميزة ويمكن مقارنة استساغة النسبي بين الأنواع.

النتائج

نحن هنا تقرير نتائج هذا الأحيائي لستة أنواع من الإسفنج البحر الكاريبي المشتركة (الشكل 2). ونشرت هذه البيانات في البداية في عام 1995 من قبل بوليك وآخرون. ¹² وتظهر قوة هذا النهج لدراسة الاختلافات في استراتيجيات الدفاع الكيميائية بين الأصناف التي تحدث ا?...

Discussion

الإجراء الموصوفة هنا يوفر بروتوكول مختبر بسيط نسبيا، ذات الصلة من الناحية البيئية لتقييم الدفاعات الكيميائية antipredatory في الكائنات البحرية. نحن هنا استعراض المعايير الهامة التي يتم توفيرها من قبل هذه المجموعة من الأساليب:

(1) المف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dichloromethane	Fisher Scientific	D37-20
Methanol	Fisher Scientific	A41220
Anhydrous Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid	Fisher Scientific	20-548-146	For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity	MP Biomedicals	154723
Squid mantle rings	N/A	N/A	Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate	Aldrich	D5765
50 ml graduated centrifuge tube	Fisher Scientific	14-432-22
20 ml scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-7
Disposable Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets	Fisher Scientific	03-448-24
Red bulbs for pellet delivery	Fisher Scientific	03-448-27
250 ml round-bottom flask	Fisher Scientific	10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap	Fisher Scientific	K747130-1324
Weightboats	Fisher Scientific	02-202B
Microspatula	Fisher Scientific	21-401-10
5 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-53
10 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-54
Razor blade	Fisher Scientific	S17302