Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen

Zusammenfassung

Dieser Bioassay verwendet ein Modell Raubfische, die Anwesenheit von Futter Abschreckung Metaboliten aus organischen Extrakte der Gewebe von Meeresorganismen auf natürlichen Konzentrationen mit einem ernährungsphysiologisch vergleichbaren Lebensmittelmatrix zu bewerten.

Zusammenfassung

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

Einleitung

Chemische Ökologie durch die Zusammenarbeit von Chemikern und Ökologen entwickelt. Während der Teildisziplin der terrestrischen chemischen Ökologie gibt es schon seit einiger Zeit, dass der Meeres chemische Ökologie ist nur ein paar Jahrzehnte alt, hat aber wichtige Einblicke in die Evolutionsökologie und Gemeinschaftsstruktur von Meeresorganismen ^8.1 zur Verfügung gestellt. Sie profitieren von den neuen Technologien von Tauchen und NMR-Spektroskopie, Organiker schnell erzeugt eine große Anzahl von Veröffentlichungen, die neuartige Stoffwechselprodukte von benthischen wirbellosen Meerestieren und Algen in den 1970er und 1980er Jahren ^9. Unter der Annahme, dass sekundäre Pflanzenstoffe muss einen Zweck haben viele dieser Publikationen ist ohne empirische Beweise zugeschrieben ökologisch wichtigen Eigenschaften, neue Verbindungen zu dienen. Etwa zur gleichen Zeit wurden Ökologen auch die Vorteile der Einführung von Tauchen und Beschreibung der Verteilungen und Häufigkeiten von Bodentieren und Pflanzen früher her bekanntbin relativ unwirksam Probenahmeverfahren wie Baggerarbeiten. Die Annahme dieser Forscher war, dass nichts festsitzenden und weichen Körper muss chemisch verteidigt werden Verbrauch von Raubtieren ¹⁰ zu vermeiden. In dem Bemühen, den Empirismus zu dem, was sonst beschreibende Arbeiten an Arten Häufigkeiten einzuführen, begannen einige Ökologen Extrapolation chemische Abwehr von Toxizitätstests ^11. Die meisten Toxizitätstests ging es um die Exposition der ganze Fische oder andere Organismen, um wässrige Suspensionen von rohen organischen Extrakte der wirbellosen Gewebe, mit anschließender Bestimmung der Trockenmasse Konzentrationen von Extrakten für die Tötung der Hälfte der Testorganismen verantwortlich. Allerdings sind Toxizitätstests nicht emulieren die Art, in der potenzielle Räuber wahr Beute unter natürlichen Bedingungen, und nachfolgende Studien haben keinen Zusammenhang zwischen Toxizität und Schmackhaftigkeit ^12-13 gefunden. Es überrascht, dass Publikationen in renommierten Fachzeitschriften verwendet Techniken, die wenig oder gar keine ecological Relevanz ^14-15 und dass diese Studien sind immer noch weit zitiert heute. Es ist noch alarmierender zu beachten, dass Studien, die auf Toxizitätsdaten weiterhin veröffentlicht ^16-18 werden. Die hier beschriebene Bioassay-Methode wurde in den späten 1980er Jahren entwickelt, um eine ökologisch relevanten Ansatz für die Meeres chemischen Ökologen sorgen zu antipredatory chemische Abwehr zu bewerten. Das Verfahren erfordert ein Modell Raubtier, um eine rohe organische Extrakt aus den Zielorganismus zu einem natürlichen Konzentration in einer ernährungs vergleichbaren Lebensmittelmatrix probieren und bietet Schmackhaftigkeit Daten, die ökologisch sinnvoller als Toxizitätsdaten.

Der allgemeine Ansatz zur Bewertung der antipredatory Aktivität der Gewebe von Meeresorganismen enthält vier wichtige Kriterien: (1) eine angemessene Generalist Räuber müssen in Fütterungstests verwendet werden, (2) Bio-Stoffwechselprodukte aller Polaritäten müssen erschöpfend aus dem Gewebe der extrahiert werden Zielorganismus, (3) die Metaboliten muss be an der gleichen Volumenkonzentration in einer ernährungs geeigneten experimentellen Nahrung vermischt als in dem Organismus, aus dem sie entnommen wurden, und (4) das experimentelle Design und statistische Ansatz müssen einen sinn Metrik relativ distastefulness hindeuten.

Die unten aufgeführten Verfahren ist speziell auf antipredatory chemische Abwehr in der Karibik wirbellose Meerestiere zu bewerten. Wir beschäftigen die bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, als Modell Raubfische, weil diese Art häufig auf karibischen Korallenriffe und ist dafür bekannt, ein breites Sortiment von Makrozoobenthos ¹⁹ kosten. Gewebe aus dem Zielorganismus wird zuerst extrahiert, dann kombiniert mit einer Futtermischung, und schließlich, um Gruppen von T. angeboten bifasciatum zu beobachten, ob sie den Extrakt behandelten Lebensmitteln abzulehnen. Assay-Daten mit dieser Methode haben wichtige Einblicke in die Defensive Chemie mariner Organismen ^12,20-21, l bereitgestelltife Geschichte Kompromisse ^22-24 und Gemeinschaftsökologie ^25-26.

Protokoll

HINWEIS: Schritt 3 dieses Protokolls betrifft Wirbeltier Themen. Das Verfahren ist so konzipiert, dass die Tiere erhalten die humane Behandlung möglich und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der University of North Carolina Wilmington zugelassen.

1) Gewebeentnahme

1. Verwenden Gewebe, das in seinem natürlichen Zustand der Flüssigkeitszufuhr und nicht gequetscht, ausgetrocknete oder übermäßig nass ist, da dies die Volumenkonzentration von Sekundärmetaboliten zu ändern. Geschnitten oder hacken Gewebe in Stücke oder Scheiben, die in ein 50 ml Zentrifugenrohr eingeschoben werden kann. Hinweis: Frisches Gewebe kann in einigen Fällen verwendet werden, aber es ist oft besser, schneiden oder hacken gefrorenem Gewebe, das nicht Gegenstand zu quetschen, wenn sie geschnitten.
2. Hinzufügen Gewebestücke zu 30 ml einer 1: 1 Mischung von Dichlormethan (DCM) und Methanol (MeOH) in einem graduierten Zentrifugenröhrchen bis zu einem Endvolumen von 40 ml erreicht wird. Achten Sie darauf, alle Schritte, die die Übertragung von durchführenLösungsmittel in einem Abzug bei ausreichender Belüftung verwenden.
3. Das Röhrchen verschließen und schwenken es mehrmals, dann während einer 4 Stunden Extraktionsdauer mehrmals schütteln. Hinweis: In dieser Zeit verbindet Wasser mit MeOH und der resultierende MeOH: Wasserphase trennt sich von der DCM-Phase. Das Gewebe wird wechselweise mit DCM und MeOH: Wasser als Emulsion wie die Röhren geschüttelt.
4. Übertragen der DCM-Extrakt in einen Rundkolben überführt und verdampft zur Trockne auf einem Rotationsverdampfer unter Verwendung niedriger Wärme (<40 ° C). Mit minimalen Lösungsmittel, überweisen Sie den Trockenextrakt auf eine 20 ml Szintillationsfläschchen. Setzen Sie die Flasche mit einem Rotationsverdampfer Adapter und erneut zur Trockene verdampft auf einem Rotationsverdampfer mit geringer Hitze (<40 ° C).
   Hinweis: Der nächste Schritt ist die Verwendung eines selbst gemachten Druckinstrument, das durch Einschrauben die folgenden Punkte der Reihe nach auf das Ende einer Gewindestange montiert werden können: (1) Mutter (2) Waschmaschine, und (3) Hutmutter. Die Scheibe muss entweder perforiert oderversehen, so dass er kleiner als der Innendurchmesser eines 50 ml Zentrifugenröhrchens ist.
5. Zurückkehrend zu dem graduierten Zentrifugenröhrchen, das Gewebe und das MeOH enthält: Wasserextrakt, quetschen das Extraktionsmittel aus dem Gewebe durch Kompression. Übertragen Sie die MeOH: Wasser-Extrakt auf den gleichen Rundkolben und speichern gekühlt (<10 ° C).
6. In MeOH in den Messzentrifugenröhrchen, bis die nun entwässert Gewebe wird für eine zweite Extraktion von 2 bis 6 Stunden Dauer untergetaucht, dann übertragen die neue MeOH zu extrahieren, um den gekühlten Rundkolben mit dem MeOH: Wasser-Extrakt. Wenn es irgendeine Besorgnis, dass das Gewebe nicht vollständig entnommen worden ist, wiederholen die 2 bis 6 h MeOH Extraktion.
7. Trocknen Sie den MeOH am Rotationsverdampfer mit geringer Hitze (<40 ° C). Die restliche wässrige Extrakt aus dem Rundkolben zur Szintillationsfläschchen, das das getrocknete unpolaren Extrakt, mit einem minimalen Volumen MeOH, den Rundbodenkolben zu spülen.
8. Evaporate des wässrigen Extrakts zur Trockne unter Verwendung niedriger Wärme (<40 ° C) auf einem Vakuum-Konzentrator. Die Szintillationsfläschchen enthält nun die Gesamttrocken rohe organische Extrakt aus 10 ml Gewebe. Evakuieren Sie den Kopfraum der Flasche mit _N2-Gas, um Oxidation zu verhindern, dicht schließen und Lagerung tiefgefroren (-20 ° C).

2) Nahrungszubereitung

1. Bereiten gefriergetrockneten Tintenfisch Mantel-Pulver.
   Hinweis: Squid Mantel stellt eine Nahrungsquelle, die vergleichbar mit der von anderen Makrozoobenthos ist und wird als Bestandteil in den Teilschritten von 2,2 verwendet werden.
   1. Gefrorene Tintenfischringe Mantel in warmem deionisiertem (DI) Wasser, dann pürieren in einem High-Speed-Mixer.
   2. Gießen Sie eine dünne Schicht aus pürierten Tintenfisch Mantel auf ein flaches Backblech und Einfrieren (-20 ° C), dann bricht das Blatt von gefrorenen Kalmaren Püree in kleine Stücke zu gefriergetrocknet werden.
   3. Lyophilisieren die gefrorene Kalmare Mantel Püree im Anschluss an die Betriebsabläufe des freeze Trockner.
   4. Pulverisierten das lyophilisierte Stücke squid Mantel Püree in einem Hochgeschwindigkeitsmischer, um ein Pulver zu bilden.
   5. In einer Abzugshaube, gießen Sie das pulverisierte Tintenfisch Mantel in eine Dreh Mehlsieb und zu sichten, um große Teile des Gewebes aus dem feinen Pulver zu trennen.
   6. Übertragen Sie die fein pulverisierte Tintenfisch Mantel an einen verschließbaren Behälter. Evakuieren Sie den Behälterkopfraum mit _N2-Gas, um Oxidation zu verhindern und Lagerung tiefgefroren (-20 ° C).
2. Bereiten Sie die Futtermischung.
   Hinweis: Bei der Ausführung von mehreren aufeinander folgenden Assays praktisch ~ vorbereiten 100 ml Futtermischung ist es jedoch dieses Rezept kann auf kleinere Volumina skaliert werden, wenn nötig.
   1. Kombinieren einer Mischung von 3 g Alginsäure und 5 g gefriergetrocknete squid Mantel-Pulver mit 100 ml entionisiertem Wasser in einem 150 ml Becherglas. Rühre kräftig mit einem Mikrospatel für ein paar Minuten, bis das Pulver vollständig hydratisiert ist, und die Mischung homogen ist.
      Hinweis: Wenn gewünscht, Lebensmittelfarbe kann zu diesem st hinzugefügt werdenep: es ist einfacher, Farbstoff auf das Nahrungsmittelmischung, die sowohl behandelten und Kontrollmischungen erzeugen wird (Maskierung des natürlichen Pigments der Extrakt in dem Extrakt behandelten Mischung) hinzuzufügen, anstatt zu versuchen, die Farbe des Extraktes behandelten Mischung durch Zugabe überein Farbstoff auf das Kontrollgemisch. Eine grünliche oder bräunliche Lebensmittelfarbe ist oft wünschenswert, keine Pigmente im Rohextrakt zu maskieren.
   2. Laden genau 10 ml Futtermischung in einen graduierten Spritze. Achten Sie darauf, um den Einschluss von Luftblasen während dieses Prozesses zu vermeiden.
   3. Nehmen Sie die 20 ml Szintillationsfläschchen mit trockenen rohen organischen Extrakt aus der Tiefkühltruhe. Fügen Sie ein oder zwei Tropfen MeOH, dann rühren den Extrakt zu einer homogenen Mischung mit einem Mikrospatel.
   4. Entnehmen Sie die eingesetzte 10-ml-Spritze von Lebensmittelmatrix in die 20 ml Szintillationsfläschchen und rühren mit einem Mikrospatel, um den Extrakt behandelten Futtermischung zu homogenisieren.
      Hinweis: Es kann helfen, die Spritze in kleineren Schritten (dh auswerfen auswerfen 2 ml und homogenisieren, dann r.EPEAT, bis alle 10 ml wurden homogenisiert wurde).
3. Bereiten Sie die Assay-Pellets.
   1. Lädt ein sehr kleines Volumen der Extraktmischung (~ 1 ml) in eine Spritze aufgezogen und tauchen die Spitze der Spritze in eine Lösung von 0,25 M CaCl _2. Werfen Sie den Inhalt der Spritze, um eine lange, spaghettiartigen Strang zu bilden.
   2. Nach ein paar Minuten wird der gehärtete Strang, hacken sie in 4 mm lange Pellets auf ein Glas Schneidebrett mit einer Rasierklinge, dann spülen Sie im Meerwasser.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 und 2.3.2 ohne einschließlich Gewebeextrakt, die Kontrolle Pellets zu machen. Achten Sie darauf, die Kontrolle-Pellets mit einem äquivalenten Volumen des Lösungsmittels zu behandeln (siehe Zusatz von MeOH zu behandelnde Mischung in Schritt 2.2.3) bis zur Lösungsmittelzugabe steuern. Wenn eine negative Kontrolle gewünscht, um zu bestätigen, dass Test Fisch aus Fütterung abgeschreckt werden, fügen Denatoniumbenzoat in einer Konzentration von 2 mg ml ^-1 in die Rohkost Mischung ^27.

3) Die SchmackhaftigkeitBioassays

1. Führen Fütterungstests mit wild gefangenen Gelbphase bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, gehalten in Dreiergruppen in undurchsichtigen seitige Fächer von Labor Aquarien.
2. Liefern Futterpellets aus einem Becherglas von Meerwasser mit einer Glaspipette mit einem Gummiball. Hinweis: Es kann ein paar Tage dauern, um Fische zu trainieren, um Essen auf diese Weise erhalten. Ein Anlage Stimulus (zB ein paar Hähne der Pipette auf die Aquarienscheibe), die die Lieferung von Lebensmitteln voran kann hilfreich sein, um die Fische zu trainieren, um die Zugabe von Futterpellets erwarten.
3. Scoring-Pellets. Betrachten wir ein Pellet akzeptiert, wenn ohne weiteres durch den Fisch verzehrt. Betrachten wir ein Pellet verworfen wird, wenn nicht nach einer mindestens drei Versuchen durch ein oder mehrere Fische, um sie in ihrer Mundhöhle nehmen gegessen oder wenn das Pellet wird angefahren und nach einer solchen Versuch ignoriert.
4. Scoring Proben. Hinweis: Das Testverfahren ist als Flußdiagramm in Figur 1 dargestellten Gruppen von Fischen, die Futteraufnahme verweigern.Steuer Pellets bei jedem Schritt im Protokoll werden nicht weiter berücksichtigt. Es gibt zwei mögliche Ergebnisse von einem einzigen Durchlauf des Tests: Die Probe wird entweder angenommen oder abgelehnt.
   1. Beginnen Sie mit einer Steuer Pellet, um zu bestätigen, dass die Gruppe der Fische ist kooperativ. Bieten Sie einen behandelten Pellets. Wenn die Fische nehmen die behandelten Pellets, punkten die Probe als angenommen. Wenn die Fische weisen die behandelten Pellets bieten eine anschließende Kontrolle Pellet zu bestimmen, ob die Fische Fütterung eingestellt. Wenn die Fische nehmen die anschließende Kontrolle Pellet, punkten die Probe als abgelehnt.
5. Replication. Wiederholen Sie den Testverfahren mit zehn unabhängige Gruppen von Fisch für jeden Extrakt.

4) Bewertung der Bedeutung

1. Bewerten Sie die Signifikanz der Unterschiede in den Konsum von Steuer vs behandelten Pellets mit einer modifizierten Version des Fisher-Test ^26. Ändern Sie den Test, so dass die Randsummen für Kontroll- und behandelten Pellets Fest, Behandeln sie beide als Stichproben. Hinweis: Diese bietet p = 0,057 bei 7 Pellets gegessen; daher wird jeder Extrakt als Abschreckung, wenn 6 oder weniger Pellets werden gegessen und schmackhaft, wenn 7 oder mehr Pellets werden gegessen.
2. Um die relative Schmackhaftigkeit zwischen Gruppen von Extrakten zu vergleichen sind die mittlere Anzahl von Pellets in jeder Gruppe gegessen. Halten Sie eine Schwelle von 6 Pellets so eine Gruppe von Wiederholungs Extrakte werden als abschreckend, wenn die mittlere Anzahl von Pellets gegessen + Standardfehler (SE) ≤6. Hinweis: In den repräsentativen Ergebnissen, ist die Gruppenzuordnung Arten, so replizieren Auszüge stammen aus verschiedenen Individuen und die relative Schmackhaftigkeit bei den einzelnen Spezies verglichen werden.

Ergebnisse

Hier berichten wir über Ergebnisse der biologischen Tests für sechs Arten von gemeinsamen karibischen Schwämmen (Abbildung 2). Diese Daten wurden ursprünglich im Jahr 1995 von Pawlik et al. ¹² veröffentlicht und zeigen, die Macht dieser Ansatz für die Unterschiede in der chemischen Abwehrstrategien unter Co-auftretende Taxa Umfrage. Die Ergebnisse wurden als mittlere Anzahl von Futterpellets Standardfehler (SE) für die einzelnen Arten gegessen + wiesen. Fast keine Pellets wurd...

Diskussion

Das hier beschriebene Verfahren stellt ein relativ einfaches, ökologisch relevanten Laborprotokoll für die Bewertung antipredatory chemische Abwehr in Meeresorganismen. Hier beschreiben wir die wichtigsten Kriterien, die von diesem Satz von Methoden erfüllt werden:

(1) Geeignete Raubtier. Das Fütterungstest verwendet den bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, einer der am häufigsten vorkommenden Fische auf Korallenriffe in der Karibik. Die bluehead ist ein Genera...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dichloromethane	Fisher Scientific	D37-20
Methanol	Fisher Scientific	A41220
Anhydrous Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid	Fisher Scientific	20-548-146	For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity	MP Biomedicals	154723
Squid mantle rings	N/A	N/A	Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate	Aldrich	D5765
50 ml graduated centrifuge tube	Fisher Scientific	14-432-22
20 ml scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-7
Disposable Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets	Fisher Scientific	03-448-24
Red bulbs for pellet delivery	Fisher Scientific	03-448-27
250 ml round-bottom flask	Fisher Scientific	10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap	Fisher Scientific	K747130-1324
Weightboats	Fisher Scientific	02-202B
Microspatula	Fisher Scientific	21-401-10
5 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-53
10 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-54
Razor blade	Fisher Scientific	S17302