Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l'attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

Riepilogo

Questo saggio biologico si avvale di un modello di pesce predatore per valutare la presenza di metaboliti di alimentazione-deterrenti da estratti organici dei tessuti degli organismi marini a concentrazioni naturali utilizzando un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare.

Abstract

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

Introduzione

Ecologia chimica sviluppata attraverso la collaborazione di chimici ed ecologisti. Mentre la sotto-disciplina di terrestre ecologia chimica è stato intorno per qualche tempo, quello di ecologia chimica marina è solo pochi decenni vecchio, ma ha fornito importanti conoscenze sulla ecologia e comunità la struttura evolutiva degli organismi marini ^1-8. Sfruttando le tecnologie emergenti di immersioni subacquee e di spettroscopia NMR, i chimici organici rapidamente generato un gran numero di pubblicazioni che descrivono nuovi metaboliti bentoniche invertebrati e alghe marine negli anni 1970 e 1980 ^9. Supponendo che metaboliti secondari devono servire a qualcosa, molte di queste pubblicazioni ascritti ecologicamente importanti proprietà a nuovi composti senza prove empiriche. Nello stesso tempo, gli ecologisti sono stati anche approfittando dell'avvento di immersioni subacquee e descrivere le distribuzioni e abbondanze di animali bentonici e piante precedentemente noti from metodi di campionamento relativamente inefficaci come il dragaggio. L'assunzione di questi ricercatori è che qualsiasi cosa sessili e corpo molle devono essere difesi chimicamente per evitare il consumo da parte di predatori ^10. Nel tentativo di introdurre l'empirismo a quello che era il lavoro altrimenti descrittivo sulle specie abbondanze, alcuni ecologisti hanno cominciato estrapolando difese chimiche da saggi di tossicità ^11. La maggior parte dei test di tossicità l'esposizione di pesci interi o di altri organismi a sospensioni acquose di estratti organici grezzi di tessuti invertebrati, con successiva determinazione delle concentrazioni in massa a secco di estratti responsabili dell'uccisione metà gli organismi di analisi. Tuttavia, i saggi di tossicità non emulare il modo in cui i potenziali predatori percepiscono preda in condizioni naturali, e gli studi successivi hanno trovato alcuna relazione tra la tossicità e l'appetibilità ^12-13. E 'sorprendente che le pubblicazioni su riviste prestigiose utilizzate tecniche minimo o nullo ecological rilevanza ^14-15 e oggi che questi studi sono ancora ampiamente citati. E 'ancora più allarmante notare che gli studi basati su dati di tossicità continuano ad essere pubblicati ^16-18. Il metodo di analisi biologico descritto è stato sviluppato alla fine del 1980 per fornire un approccio ecologicamente rilevante per gli ecologi marini chimiche per valutare le difese chimiche antipredatory. Il metodo richiede un modello predatore di assaggiare un estratto organico greggio da parte dell'organismo bersaglio ad una concentrazione naturale in un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare, fornendo dati appetibilità che sono più ecologicamente significativo di dati sulla tossicità.

L'approccio generale per valutare l'attività antipredatory dei tessuti di organismi marini comprende quattro criteri importanti: (1) un appropriato predatore generalista deve essere utilizzato in saggi di alimentazione, (2) metaboliti organici di tutte le polarità devono essere esaustivo estratte dal tessuto del bersaglio organismo, (3) i metaboliti devono be mescolato in un alimento nutrizionalmente sperimentale appropriata alla stessa concentrazione volumetrica come trovato nell'organismo da cui sono stati estratti, e (4) il disegno sperimentale e approccio statistico devono fornire una metrica significativa per indicare relativa distastefulness.

La procedura descritta di seguito è stato progettato specificamente per valutare le difese chimiche antipredatory in Caraibi invertebrati marini. Impieghiamo il wrasse bluehead, Thalassoma bifasciatum, come un modello di pesce predatore, perché questa specie è comune in barriere coralline dei Caraibi ed è noto per degustare un vasto assortimento di invertebrati bentonici ^19. Tissue da parte dell'organismo bersaglio viene dapprima estratta, poi combinata con una miscela di cibo, e infine offerto ai gruppi di T. bifasciatum osservare se rifiutano i cibi estratto trattati. Dati del dosaggio con questo metodo hanno fornito importanti conoscenze sulla chimica di difesa degli organismi marini ^12,20-21, lstoria ife compromessi ^22-24, e la comunità ecologia ^25-26.

Protocollo

NOTA: Fase 3 del presente protocollo coinvolge soggetti animali vertebrati. La procedura è stata progettata in modo che gli animali ricevano il trattamento più umano possibile ed è stato approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso la University of North Carolina Wilmington.

1) Estrazione del tessuto

1. Utilizzare tessuto che è nel suo stato naturale di idratazione e non spremuto, secchi-out o eccessivamente umido come questo altera la concentrazione volumetrica di metaboliti secondari. Tagliare o tagliare il tessuto in pezzi o fette che possono essere inseriti in un tubo da centrifuga da 50 ml. Nota: tessuto fresco può essere utilizzato in alcuni casi, ma spesso è meglio tagliare o tritare tessuti congelati, che non è soggetta a spremitura al taglio.
2. Aggiungere pezzi di tessuto a 30 ml di una miscela 1: 1 di diclorometano (DCM) e metanolo (MeOH) in una provetta da centrifuga graduata fino ad un volume finale di 40 ml è raggiunto. Assicurarsi di eseguire tutti i passaggi che comportano il trasferimento disolvente in una cappa aspirante con ventilazione adeguata.
3. Tappare la provetta e capovolgerla più volte, poi agitare più volte nel corso di un periodo di estrazione 4 ore. Nota: Durante questo periodo, l'acqua si combina con il MeOH e il risultante MeOH: fase acquosa si separa dalla fase DCM. Il tessuto è alternativamente esposto al DCM e MeOH: acqua come emulsione come i tubi sono agitati.
4. Trasferire l'estratto DCM in un pallone a fondo rotondo ed evaporare a secchezza su un evaporatore rotante utilizzando basse temperature (<40 ° C). Utilizzando solventi minimal, trasferire l'estratto secco di 20 ml di scintillazione flacone. Montare la fiala con un adattatore evaporatore rotante e di nuovo evaporare a secco in un evaporatore rotante con fuoco basso (<40 ° C).
   Nota: Il passo successivo richiede l'uso di uno strumento di compressione casalingo che possono essere assemblati avvitando i seguenti elementi in ordine sequenziale sull'estremità di un'asta filettata: (1) il dado (2) Rondella, e (3) dado cieco. La rondella deve o essere perforato omontata in modo che sia inferiore al diametro interno di un tubo da centrifuga da 50 ml.
5. Tornando al tubo da centrifuga graduato contenente tessuti e MeOH: estratto dall'acqua, premere il mezzo di estrazione di tessuto attraverso la compressione. Trasferire il MeOH: estratto acquoso allo stesso pallone a fondo tondo e memorizzare refrigerati (<10 ° C).
6. Aggiungere MeOH al tubo da centrifuga graduata finché il tessuto ora disidratato è sommerso per una seconda estrazione di 2 a 6 durata ore, poi trasferire la nuova MeOH estratto nel pallone a fondo tondo refrigerati contenente la MeOH: estratto acquoso. Se non vi è alcuna preoccupazione che il tessuto non è stato completamente estratto, ripetere l'estrazione MeOH 2 a 6 ore.
7. Asciugare la MeOH su un evaporatore rotante con fuoco basso (<40 ° C). Trasferire l'estratto acquoso rimanente dal pallone a fondo tondo nella fiala di scintillazione contenente l'estratto secco non polare, con un volume minimo di MeOH per risciacquare il pallone a fondo tondo.
8. Evaporate l'estratto acquoso di essiccazione, a fuoco basso (<40 ° C) su un concentratore a vuoto. La fiala di scintillazione ora contiene l'estratto grezzo organico secco totale di 10 ml di tessuto. Evacuare spazio di testa del flaconcino con N ₂ gas per prevenire l'ossidazione, sigillare ermeticamente e conservare congelato (-20 ° C).

2) Preparazione alimentare

1. Preparare calamari polvere manto liofilizzata.
   Nota: mantello Squid fornisce una fonte di alimentazione che è paragonabile a quella di altri invertebrati bentonici, e verrà utilizzato come ingrediente nelle sottofasi di 2.2.
   1. Anelli surgelati Scongelare del mantello calamari a deionizzata calda (DI) di acqua, poi purea in un frullatore ad alta velocità.
   2. Versate un sottile strato di purè calamari mantello su una teglia bassa e congelamento (-20 ° C), quindi rompere il foglio di congelato purea calamari a pezzetti per essere liofilizzato.
   3. Lyophilize la calamari congelati manto purea seguendo le modalità di funzionamento del freeze-essiccatore.
   4. Polverizzare i pezzi liofilizzate di calamari mantello purea in un frullatore ad alta velocità per formare una polvere.
   5. In una cappa aspirante, versare il mantello calamaro in polvere in una farina setaccio rotante e vagliare separare grossi pezzi di tessuto dalla polvere fine.
   6. Trasferire la multa in polvere manto calamari in un contenitore sigillato. Evacuare spazio di testa del contenitore con N ₂ gas per prevenire l'ossidazione e memorizzare congelati (-20 ° C).
2. Preparare l'impasto alimentare.
   Nota: Durante l'esecuzione di più test consecutivi, è pratico di preparare ~ 100 ml di miscela di cibo, ma questa ricetta può essere scalata a volumi più piccoli, se necessario.
   1. Combinare una miscela di 3 g di acido alginico e 5 g liofilizzata mantello polvere calamari con 100 ml di acqua deionizzata in un bicchiere da 150 ml. Mescolare energicamente con una microspatula per qualche minuto fino a quando la polvere è completamente idratata e la miscela è omogenea.
      Nota: Se si desidera, colorante alimentare può essere aggiunto a questo step: è facile aggiungere alla miscela colorante alimentare che genererà entrambe le miscele trattate e di controllo (mascherare il pigmento naturale dell'estratto nella miscela estratto trattati) anziché cercare di abbinare il colore della miscela dell'estratto trattati aggiungendo tingere alla miscela di controllo. Colorante alimentare verde o marrone è spesso desiderabile per mascherare eventuali pigmenti nell'estratto greggio.
   2. Caricare esattamente 10 ml di miscela di cibo in una siringa graduata. Fare attenzione ad evitare l'inclusione di bolle d'aria nel corso di questo processo.
   3. Rimuovere l'20 ml scintillazione flacone con estratto biologico greggio asciutto dal freezer. Aggiungere una o due gocce di MeOH, quindi mescolare l'estratto in una miscela omogenea con un microspatula.
   4. Espellere il caricata siringa da 10 ml di matrice alimentare in 20 ml di scintillazione fiala e mescolare con una microspatula per omogeneizzare la miscela alimentare estratto trattati.
      Nota: Può essere utile per espellere la siringa in incrementi più piccoli (cioè, espellere 2 ml e omogeneizzare, poi r.EPEAT fino tutti i 10 ml sono stati omogeneizzati).
3. Preparare il pellet di analisi.
   1. Caricare un volume molto piccolo della miscela dell'estratto (~ 1 ml) in una siringa, e immergere la punta della siringa in una soluzione di 0,25 M CaCl _2. Estrarre il contenuto della siringa per formare un lungo spaghetto-like.
   2. Dopo pochi minuti, togliere il filo indurito, tritarlo in 4 mm di lunghezza pellet su un tagliere di vetro con una lama di rasoio, poi sciacquare in acqua di mare.
   3. Ripetere i punti 2.3.1 e 2.3.2 senza includere l'estratto di tessuto per fare pellet di controllo. Assicurarsi di trattamento pellets di controllo con un volume equivalente di solvente (vedi aggiunta di MeOH al composto trattata nel passaggio 2.2.3) per controllare per aggiunta di solventi. Se un controllo negativo è desiderato per confermare che il pesce saggio può essere indotta a rinunciare alimentazione, aggiungere denatonium benzoato ad una concentrazione di 2 mg ml ^-1 al cibo miscela grezza ^27.

3) AppetibilitàBioassays

1. Eseguire test di alimentazione con il giallo-fase wrasse bluehead catturati, Thalassoma bifasciatum, tenuti in gruppi di tre in compartimenti opaco facciate di acquari di laboratorio.
2. Invia pellets alimentari da un bicchiere di acqua di mare con una pipetta di vetro con un bulbo di gomma. Nota: Potrebbero essere necessari alcuni giorni per addestrare i pesci per ricevere il cibo in questo modo. Uno stimolo condizionata (es pochi tocchi della pipetta sul vetro dell'acquario) che precede la consegna di cibo può essere utile per addestrare il pesce aspettarsi l'aggiunta di pellets alimentari.
3. Punteggio pellet. Si consideri un pellet accettato se prontamente consumato dai pesci. Si consideri un pellet respinta se non mangiato, dopo un minimo di tre tentativi da parte di uno o più pesci di prenderlo nella loro cavità orale, o se il pellet si avvicina e ignorato dopo un tentativo del genere.
4. Campioni di punteggio. Nota: La procedura di test è raffigurato come un diagramma di flusso in Figura 1 Gruppi di pesci che si rifiutano di mangiare.pellets di controllo in qualsiasi fase del protocollo non sono considerati ulteriormente. Ci sono due possibili risultati di una singola esecuzione del test: il campione viene accettato o respinto.
   1. Inizia con un pellet di controllo per confermare che il gruppo di pesci è cooperativa. Offrire un pellet trattata. Se i pesci accettano il pellet trattata, segnare il campione accettata. Se i pesci rifiutano il pellet trattato, offrire una successiva pellet di controllo per determinare se i pesci hanno cessato l'alimentazione. Se i pesci accettano la successiva pellet di controllo, segnare il campione respinta.
5. Replica. Ripetere la procedura di test con dieci gruppi indipendenti di pesce per ogni estratto.

4) Significato Valutazione

1. Valutare la significatività delle differenze di consumo di controllo vs pellet trattate con una versione modificata del test esatto di Fisher ^26. Modificare il test in modo che siano fissati i totali marginali per il controllo e pellet trattati, Trattandoli due campioni casuali. Nota: Questo fornisce p = 0,057 quando 7 pellet sono mangiati; quindi, ogni estratto è considerato deterrente se 6 o meno pellet sono mangiati, e appetibile se 7 o più pellet sono mangiati.
2. Per confrontare l'appetibilità relativa tra i gruppi di estratti, calcolare un numero medio di pellet consumato all'interno di ogni gruppo. Mantenere la soglia a 6 pellet così un gruppo di estratti repliche sono considerati deterrente se il numero medio di pellet consumato + errore standard (SE) ≤6. Nota: Nei risultati rappresentativi, l'assegnazione del gruppo è di specie, così replicano estratti provengono da individui distinti e la relativa appetibilità possono essere confrontati tra le specie.

Risultati

Qui riportiamo i risultati di questo saggio biologico per sei specie di spugne caraibiche comuni (Figura 2). Questi dati sono stati inizialmente pubblicati nel 1995 da Pawlik et al. ¹² e dimostrano la potenza di questo approccio per esaminare le differenze nelle strategie di difesa chimiche tra taxa concomitanti. I risultati sono stati riportati come un numero medio di pellet cibo mangiato + errore standard (SE) per ogni specie. Quasi nessun pellet sono stati consumati in test con es...

Discussione

La procedura qui descritta prevede un protocollo di laboratorio relativamente semplice, ecologicamente rilevanti per valutare le difese chimiche antipredatory negli organismi marini. Qui passiamo in rassegna i criteri importanti che sono soddisfatte da questo insieme di metodi:

(1) appropriata predatore. Questa analisi alimentare impiega il wrasse bluehead, Thalassoma bifasciatum, uno dei pesci più abbondanti sulle barriere coralline in tutti i Caraibi. Il bluehead è un c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dichloromethane	Fisher Scientific	D37-20
Methanol	Fisher Scientific	A41220
Anhydrous Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid	Fisher Scientific	20-548-146	For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity	MP Biomedicals	154723
Squid mantle rings	N/A	N/A	Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate	Aldrich	D5765
50 ml graduated centrifuge tube	Fisher Scientific	14-432-22
20 ml scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-7
Disposable Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets	Fisher Scientific	03-448-24
Red bulbs for pellet delivery	Fisher Scientific	03-448-27
250 ml round-bottom flask	Fisher Scientific	10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap	Fisher Scientific	K747130-1324
Weightboats	Fisher Scientific	02-202B
Microspatula	Fisher Scientific	21-401-10
5 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-53
10 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-54
Razor blade	Fisher Scientific	S17302