Bir Balık-besleme Laboratuvar biyodeneyinde Deniz Organizmaların Dokular Sekonder Metabolitlerin Antipredatory Aktivite değerlendirmek için

Özet

Bu biyo-deney, bir besleyici olarak benzer gıda matris kullanılarak, doğal konsantrasyonlarda deniz organizmalarının dokuların Organik özütlerden besleme-caydırıcı metabolitlerinin varlığını değerlendirmek için bir model yırtıcı balık kullanmaktadır.

Özet

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

Giriş

Kimyasal ekoloji kimyagerler ve ekolojist işbirliği ile geliştirdi. Karasal kimyasal ekoloji subdiscipline bir süre için yaklaşık edilmiş olsa da, deniz kimyasal ekoloji sadece bir kaç yıl eski ama deniz organizmalarının ^1-8 evrimsel ekoloji ve toplum yapısına önemli bilgiler sağlamıştır. Aletli dalış ve NMR spektroskopisi acil teknolojileri yararlanan, organik kimyacılar hızla 1970'lerde ve 1980'lerde ⁹ bentik omurgasız deniz ve yosun gelen yeni metabolitleri anlatan yayınların çok sayıda üretti. Sekonder metabolitler ampirik kanıt olmadan yeni bileşikler ekolojik önemli özellikleri atfedilen bu yayınların çoğu bazı amaca hizmet etmelidir varsayarsak. Hakkında aynı zamanda, ekolojistler de dağılımları ve daha önce sağa sola bilinen bentik hayvanların ve bitkilerin zengindi SCUBA dalış gelişiyle yararlanarak ve açıklayan edildiBöyle tarama gibi nispeten etkisiz örnekleme yöntemleri m. Bu araştırmacıların varsayım sesil şey ve yumuşak gövdeli kimyasal avcılardan ¹⁰ tarafından tüketimini önlemek için savunulması gerektiğini oldu. Türler bolluk aksi açıklayıcı bir işti ne ampirizmi tanıtmak için bir çaba, bazı ekolojistler toksisite deneyleri ¹¹ kimyasal savunma extrapolating başladı. Çoğu toksisite deneyleri yarım tahlil organizmaları öldürmekten sorumlu özleri kuru kütle konsantrasyonlarının sonraki kararlılıkla, bütün balık veya omurgasız dokuların ham organik özler sulu süspansiyonlar diğer organizmaların poz çıkıyor. Ancak, toksisite deneyleri, potansiyel saldırganları doğal şartlar altında av algıladıkları hangi şekilde taklit değil, ve daha sonraki çalışmalar toksisite ve lezzet ^12-13 arasında hiçbir ilişki bulduk. Bu prestijli dergilerde yayınlar çok az ya da hiç Ecologica olan teknikleri kullanılan şaşırtıcıdırl alaka ^14-15 ve bu çalışmalar hala yaygın atıf bugün. Bu toksisite verilerine dayalı çalışmalar ^16-18 yayınlanmaya devam unutmayın daha da endişe verici olduğunu. Burada açıklanan biyodeney yöntemi antipredatory kimyasal savunma değerlendirmek için deniz kimyasal ekolojistler için bir ekolojik ilgili yaklaşım sağlamak için 1980'lerin sonlarında geliştirilmiştir. yöntem daha ekolojik anlamlı toksisite verilerine göre olan lezzet veri sağlayan, bir beslenme karşılaştırılabilir gıda matrisi içinde doğal bir konsantrasyonda hedef organizmadan bir ham organik özü örnek bir modeli yırtıcı gerektirir.

(1) uygun bir kültürlü yırtıcı besleme deneylerinde kullanılabilir olmalıdır, (2) her polarizasyona organik metabolitleri etraflıca dokusundan ekstre edilmelidir: deniz organizmalarının dokuların antipredatory aktivitesinin değerlendirilmesi için genel bir yaklaşım, dört önemli kriterler içerir organizmayı hedef, (3) metabolitleri b gerekirAynı hacimsel konsantrasyonda bir beslenme uygun deneysel gıda içine karışık bir e onlar çıkarıldı, ve (4) deneysel tasarım ve istatistiksel bir yaklaşım anlamlı bir metrik göreceli distastefulness göstermek için sağlaması gerekir hangi organizmada bulunduğu gibi.

Aşağıda belirtilen prosedür Karayip deniz omurgasız antipredatory kimyasal savunma değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bu tür Karayip mercan resifleri üzerinde yaygındır ve bentik omurgasızlar ¹⁹ geniş bir ürün yelpazesine örnek bilinmektedir çünkü bir örnek yırtıcı balık gibi bluehead akya, Thalassoma bifasciatum, istihdam. Hedef organizmadan alınan dokular, ilk önce, ekstre bir gıda karışımı ile bir araya getirilmiş ve son olarak T. gruplarına sunulmaktadır bifasciatum onlar özü ile tedavi edilen gıdalar reddetmek olmadığını gözlemlemek için. Bu yöntemi kullanarak tahlil verileri deniz organizmalarının ^12,20-21, l savunma kimya önemli bilgiler sağladıife geçmişi ticaret-off ^22-24, ve toplum ekolojisi ^25-26.

Protokol

NOT: Bu protokolün 3. Adım omurgalı hayvan denekleri içerir. Prosedür hayvanlar mümkün olan en insancıl tedavi böylece dizayn edilmiştir ve Kuzey Carolina Wilmington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1) Doku Ekstraksiyon

1. Bu ikincil metabolitlerin hacimsel konsantrasyonunu değiştirecek gibi hidrasyon ve sıkılmış, kurutulmuş-out veya aşırı ıslak doğal haliyle olduğu doku kullanın. Kesilmiş veya 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine sokulabilir parçaları veya dilimleri için doku kıyılır. Not: Taze doku bazı durumlarda kullanılabilir, ancak, cut sıkma tabi değildir dondurulmuş doku, kesme veya kesmek için, genellikle daha iyidir.
2. Bir 1 30 ml doku parçaları ekleyin: 40 ml'lik bir son hacme kadar dereceli bir santrifüj tüpüne 1 diklorometan (DKM) ve metanol (MeOH) ulaşılır. Transfer ile ilgili tüm adımları doğru yaptığınızdan emin olunYeterli havalandırma ile bir davlumbaz içinde solvent.
3. Tüp kap ve bunu birkaç kez ters, sonra 4 saat çıkarma döneminde art arda çalkalayın. Not: Bu süre içinde, su, MeOH ile birleştirilir ve elde edilen MeOH: su fazı DCM fazı ayrılır. doku alternatif olarak DCM ile MeOH maruz: su bir emülsiyon halinde tüpleri çalkalanır gibidir.
4. Yuvarlak tabanlı bir şişeye DCM özü aktarın ve düşük bir ısı kullanılarak bir döner buharlaştırıcı üzerinde kuruluğa kadar buharlaşmasına (<40 ° C). En az bir çözücü kullanılarak, bir 20 mL sintilasyon şişesine kurutularak özü aktarın. Bir döner buharlaştırıcı adaptörü ile şişe yerleştirin ve daha düşük bir ısı kullanılarak bir döner buharlaştırıcı üzerinde kuruluğa kadar buharlaşmasına (<40 ° C).
   Not: (1) somun (2) yıkayıcı ve (3) palamut somun: Bir sonraki adım, bir dişli çubuğun ucuna sırayla aşağıdaki öğeleri vidalanarak monte edilebilir bir ev yapımı sıkıştırma aracının kullanılmasını gerektirmektedir. yıkayıcı ya delikli olmalı veyabir 50 ml santrifüj tüpüne iç çapından daha küçük olacak şekilde donatılmış olabilir.
5. Doku ve MeOH içeren mezun santrifüj tüpüne dönersek: Su özü, sıkıştırma yoluyla doku dışarı çıkarma orta sıkmak. MeOH transfer: Aynı yuvarlak dipli bir şişeye su ekstraktı ve soğutulmuş depolamak (<10 ° C).
6. Su ekstraktı: daha sonra, yeni MeOH MeOH ihtiva eden soğutulmuş yuvarlak dipli bir şişeye özü transferi, hemen susuz doku 2-6 saat bir süre için bir ikinci çıkarma için batık kadar dereceli santrifüj tüpüne MeOH ekleyin. Doku tam ekstre edilmediğini herhangi bir endişe varsa, 2 saat 6 MeOH çıkarma tekrarlayın.
7. Düşük bir ısı kullanılarak bir döner buharlaştırıcı üzerinde MeOH kurutun (<40 ° C). Yuvarlak tabanlı bir şişeye yıkamak için MeOH, minimal hacim ile yıkandı, kurutuldu polar olmayan özü ihtiva eden sintilasyon şişesine yuvarlak dipli bir şişede kalan Sulu ekstraktı aktarın.
8. Ebir vakum yoğunlaştırıcısı düşük ısı (<40 ° C) kullanılarak kuruyana dek Sulu ekstraktı Vaporate. sintilasyon şişesi hemen doku içinde 10 ml toplam kuru ham organik özü içerir. , Oksidasyonunu önlemek için _N2 gazı ile şişenin üst boşluğunu tahliye sıkı bir şekilde yapışması ve depolamak dondurulmuş (-20 ° C).

2) Gıda Hazırlama

1. Dondurularak kurutulmuş kalamar manto tozu hazırlayın.
   Not: Squid manto diğer bentik omurgasız ile karşılaştırılabilir, ve 2.2 aşağıdaki alt-etapları bir terkip maddesi olarak kullanılacak olan bir beslenme kaynağı içerir.
   1. Sıcak deiyonize (DI) su kalamar mantonun çözülme dondurulmuş halkaları, daha sonra yüksek hızlı karıştırıcı onları püresi.
   2. Sığ çerez levha ve dondurularak (-20 ° C) üzerine püre kalamar manto ince bir tabaka dökün, daha sonra küçük parçalar halinde liyofilize edilecek dondurulmuş kalamar püresi sayfasını kırmak.
   3. Fr işletim prosedürleri takip dondurulmuş kalamar manto püresi lyophilizeeeze-kurutucu.
   4. Bir toz oluşturmak üzere yüksek hızlı bir karıştırıcı içinde kalamar manto püresi liyofilize parçaları toz haline.
   5. Bir çeker ocak içinde, bir döner un elek toz halinde kalamar manto dökün ve ince ebatlı tozun bir doku büyük boyutta ayrı eleyin.
   6. Bir yapışmalı kaba ince toz kalamar manto aktarın. Oksitlenmesini önlemek ve dondurulmuş depolama _N2 gazı ile kap üst boşluğunu tahliye (-20 ° C).
2. Gıda karışımı hazırlayın.
   Not: Gerekirse birden fazla ardışık deneyleri çalıştırırken, o ~ gıda karışımı 100 ml hazırlamak için pratik, ancak bu tarifi daha küçük birimlere ölçekli olabilir.
   1. 150 ml'lik bir cam kap içinde, 3 g alginik asit ve Dİ su, 100 ml 5 g dondurulup kurutulmuş kalamar manto bir toz karışımını bir araya getirin. Toz tamamen hidratlanmış ve karışım homojen olana kadar bir kaç dakika için bir microspatula ile kuvvetli bir şekilde karıştırın.
      Arzu edildiği takdirde, gıda boyası bu st ilave edilebilir: Notep: daha ziyade ekleyerek özü ile tedavi edilen karışımın rengi maç çalışırken daha (özü ile tedavi edilen karışımda özü doğal pigment maskeleme) hem tedavi ve kontrol karışımları üretecek gıda karışıma boya eklemek için kolay Kontrol karışımına boya. Yeşilimtırak veya kahverengimsi gıda boyası ham ekstre herhangi bir pigment maskelemek için genellikle arzu edilir.
   2. Bir dereceli enjektöre gıda karışımı tam 10 ml yükleyin. Bu işlem sırasında hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için dikkat edin.
   3. Dondurucu kuru ham organik ekstre 20 ml sintilasyon flakonu çıkarın. Bir damla ekleme veya MeOH iki, daha sonra bir microspatula homojen bir karışım halinde özü karıştırın.
   4. 20 mi sintilasyon şişesine içine gıda matris yüklenen 10 ml şırınga çıkarma ve ekstre ile muamele edilmiş gıda karışımı homojenleştirmek için bir microspatula ile karıştırın.
      R, sonra bu küçük artışlarla (yani şırıngayı çıkarmak için yardımcı olabilir 2 ml çıkarmak ve homojenize:. Not10 ml kadar EPEAT) homojenize edilmiştir.
3. Tahlil pelet hazırlayın.
   1. Bir şırınga içine ekstre karışımı (~ 1 mi) içindeki bir çok küçük bir hacim yük ve 0.25 M _CaCI2 çözeltisi içinde bir şırınga ucunu daldırın. Uzun, spagetti benzeri lifi oluşturmak üzere şırınga içeriğini çıkarın.
   2. Birkaç dakika sonra, daha sonra, bir jilet ile bir cam kesme tahtası üzerinde 4 mm uzunluğunda pelet içine doğrayın, sertleştirilmiş iplikçik kaldırmak deniz suyu ile durulayın.
   3. Tekrar kontrol pelet yapma doku özü dahil edilmeden 2.3.1 ve 2.3.2 adımları. Çözücü, eşdeğer hacimde kontrol pelet tedavisi için emin olun çözücü ilave kontrol etmek için (adım 2.2.3 tedavi karışımına MeOH ilave bakınız). Negatif kontrol, bu deney, balık besleme vazgeçirtecek teyid 2 mg ml bir konsantrasyonda denatonyum benzoat ilave ^-1 işlenmemiş gıda karışımına ²⁷ isteniyorsa.

3) LezzetBiyoanalizler

1. Vahşi yakalanmış sarı-fazlı bluehead wrasse, Thalassoma bifasciatum ile beslenme deneyleri gerçekleştirmek, laboratuvar akvaryumlarda opak taraflı bölümlerinde üçlü gruplar halinde tutulur.
2. Bir lastik ampul ile bir cam pipet kullanarak deniz suyu bir bardağa gıda pelet sunun. Not: Bu şekilde yiyecek almak için balık yetiştirmek için birkaç gün sürebilir. Gıda teslim önündeki bir klima uyaran (akvaryum camına pipet gibi birkaç musluklar) gıda pelet eklenmesini beklemek balık yetiştirmek için yararlı olabilir.
3. Pelet Puanlama. Kolayca balık tarafından tüketilen eğer bir pelet kabul düşünün. Onların ağız boşluğuna almak için bir veya daha fazla balık üç girişimleri en az sonra yenen değilse bir pelet reddetti düşünün, pelet yaklaştı ve böyle bir denemeden sonra göz ardı edilir ya da eğer.
4. Skor örnekleri. Not: Tahlil prosedürü Şekil 1'de bir akış şeması olarak tasvir edilir yemek reddediyorum balık Grupları.protokolünde herhangi bir aşamada kontrol pelet daha kabul edilmez. Tahlil tek bir vadede iki potansiyel sonuçları vardır: Örnek kabul veya red edilir ya.
   1. Balık grubu kooperatif olduğunu doğrulamak için bir kontrol pelet ile başlayın. Tedavi edilen bir pelet teklif. Balık tedavi pelet kabul ederseniz kabul edilen, örnek puan. Balık tedavi pelet reddederseniz, balık besleme durdurdu olup olmadığını belirlemek için bir sonraki kontrol pelet sunuyoruz. Balık sonraki kontrol pelet kabul ederseniz reddedilmiş gibi, örnek puan.
5. Çoğaltma. Her ekstresi için balık on bağımsız gruplar ile tahlil işlemi tekrarlayın.

4) değerlendirilmesi Önemi

1. Fisher testi ²⁶ değiştirilmiş bir versiyonu ile tedavi pelet vs kontrol tüketimi farklılıkların önemini değerlendirir. Kontrolü için marjinal toplamları ve tedavi pelet sabit böylece testi değiştirinOnlara hem de rastgele örnekler tedavi. Not: Bu p = 0.057 sağlar 7 pelet yemiş zaman; 7 veya daha fazla pelet yenir eğer dolayısıyla, herhangi bir özü 6 veya daha az pelet yenir eğer caydırıcı kabul ve lezzetli olduğunu.
2. Ekstrelerinin gruplar arasında nispi lezzetini karşılaştırmak için, her grup içinde yenen pelet ortalama sayısını hesaplamak. Pelet ortalama sayısı + yenirse o kadar çoğaltmak özler bir grup caydırıcı olarak kabul edilir 6 pelet eşiği tutun standart hata (SE) ≤6. Not: temsilcisi sonuçları, grup atama türdür, yani çoğaltmak özler farklı bireylerden gelen ve göreli lezzet türler arasında karşılaştırılabilir.

Sonuçlar

Burada ortak Karayip sünger altı türün (Şekil 2) Bu biyoassay sonuçlarını rapor. Bu veriler başlangıçta Pawlik ark. ¹² tarafından 1995 yılında yayınlanan ve ortak meydana takson arasında kimyasal savunma stratejileri farklılıkları araştırmak için bu yaklaşımın gücünü göstermek edildi. Sonuçlar standart hata (SE) her tür için + yemiş gıda pelet ortalama sayısı olarak rapor edilmiştir. Hemen hemen hiç peletler Agelas clathrodes, Amphimedon comp...

Tartışmalar

Burada tarif edilen prosedür, deniz organizmalarında antipredatory kimyasal savunma değerlendirmek için nispeten basit ve ekolojik olarak uygun laboratuar protokolü sağlar. Burada yöntemler bu set ile memnun olan önemli kriterleri gözden:

(1) Uygun yırtıcı. Bu beslenme deneyi bluehead akya, Thalassoma bifasciatum, Karayipler genelinde mercan resifleri üzerinde en bol balıklar birini kullanır. bluehead bentik omurgasızlar ¹⁹ geniş bir ürün yelpa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dichloromethane	Fisher Scientific	D37-20
Methanol	Fisher Scientific	A41220
Anhydrous Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid	Fisher Scientific	20-548-146	For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity	MP Biomedicals	154723
Squid mantle rings	N/A	N/A	Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate	Aldrich	D5765
50 ml graduated centrifuge tube	Fisher Scientific	14-432-22
20 ml scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-7
Disposable Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets	Fisher Scientific	03-448-24
Red bulbs for pellet delivery	Fisher Scientific	03-448-27
250 ml round-bottom flask	Fisher Scientific	10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap	Fisher Scientific	K747130-1324
Weightboats	Fisher Scientific	02-202B
Microspatula	Fisher Scientific	21-401-10
5 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-53
10 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-54
Razor blade	Fisher Scientific	S17302