تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Summary

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Abstract

لقد كان تحديد سمية الإنجابية من آلاف المواد الكيميائية الموجودة في بيئتنا واحدة من أكثر التحديات محيرة في مجال الصحة البيئية. ويرجع ذلك جزئيا إلى ندرة نظم النموذج الذي يمكن (1) تلخيص بدقة ملامح مفاتيح العمليات الإنجابية و(2) القيام بذلك في المتوسط ​​إلى الإنتاجية العالية الموضة، من دون الحاجة إلى وجود عدد كبير من الحيوانات الفقارية.

وصفنا هنا مقايسة في C. الخيطية ايليجانس التي تسمح للالتعرف السريع على المواد السامة الجرثومية من خلال رصد تحريض الأجنة مختل الصيغة الصبغية. من خلال الاستفادة من خط مراسل GFP، وأخطاء في العزل الصبغي الناجمة عن انقطاع سلالة الجرثومية وتصور بسهولة وكميا بواسطة المجهر الآلي مضان. وهكذا فإن فحص مجموعة معينة من المركبات لسميتها يمكن أن يؤديها في شكل لوحة 96- إلى 384 جيدا في غضون أيام. تحليل ثانوي للح إيجابيةلها يمكن القيام بها لتحديد ما إذا كان الشذوذ الصبغي نشأت من اختلال الانتصافي أو من أوائل الجنينية أخطاء كروموسوم الفصل. وإجمالا، يمثل هذا الاختبار استراتيجية مرور الأول-سريعة للتقييم السريع من اختلال وظيفي الجرثومية التالية التعرض للمواد الكيميائية.

Introduction

هناك ما يقرب من 87،000 من المواد الكيميائية المسجلة للتجارة في الولايات المتحدة، ولكن فقط عدد قليل من هذه قد تم اختبارها للآثار الصحية المحتملة ^1. من تلك التي تم اختبارها، تم تقييم سوى جزء للآثار الصحية الإنجابية ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة في تحديد تحوير الأحداث الإنجابية المبكرة في الثدييات، وخصوصا خلال الإناث تطوير الخلية الجرثومية والتمايز. في الواقع، أول الأحداث الانتصافي تجري خلال المراحل الأولى من التطور الجنيني في الثدييات الإناث، وبالتالي فهي صعبة للوصول إلى وجمع بأعداد مناسبة لأغراض الفحص.

يوفر الجرثومية على الرابط الحاسم بين الأجيال، وظيفتها المناسبة تعتمد على التنفيذ الدقيق للبرنامج معقد من الانقسام الخلوي والكروموسومات يسمى الانقسام الاختزالي. ديسريغولاتيون عملية الانتصافي قد يؤدي إلى انخفاض الخصوبة وإنتاجالأمشاج والأجنة مع عدد غير طبيعي من الكروموسومات، وصفته حالة عدم توازن الصبغيات. أخطاء العزل الصبغي في الانقسام الاختزالي هي ذات أهمية كبيرة لصحة الإنسان. شذوذ صبغي شائعة، مع تردد من 1 في 150 ولادة حية، تثلث الصبغي 21 و 18 و 13 وكذلك X و Y أخطاء كروموسوم يجري أنواع الأكثر انتشارا ^2،3. وعلاوة على ذلك، والتشوهات الخلقية، بما في ذلك أصول الكروموسومات، هي السبب الرئيسي للوفاة الرضع في الولايات المتحدة ⁴ إن فكرة أن التأثيرات البيئية يمكن أن تؤثر على الفصل الكروموسومات والسلوك ليس جديدا ^5، ولكن لا تزال غير مفهومة. ولذا فمن الأهمية بمكان لتحقيق أي من المواد الكيميائية التي أدخلت بيئتنا تتداخل مع خصوبة الإنسان والتنمية في وقت مبكر والصحة الإنجابية الشاملة.

في ضوء هذه القيود المفروضة على نماذج الثدييات، وقد وضعنا شاشة الفحص الإنتاجية العالية لاختبار سمية الإنجابية في الدودة <م> C. ايليجانس. لقد حشدت العديد من الميزات الهامة التي يوفرها هذا النظام النموذجي الوراثية التي يشيع استخدامها مثل صغر حجمها، وانخفاض التكلفة، ودورة التكاثر قصيرة، نسبة عالية من الخلايا الجرثومية وسهولة التلاعب ^6. يمكن زراعتها الديدان في لوحات 96-جيدا أو في الثقافات السائل حجم عالية وذلك بسبب شفافيتها يمكن تصوير مباشرة على لوحات للكشف عن صحفيين الفلورسنت. الفحص هو موضح أدناه يستفيد من هذه الخصائص ويستفيد من سلالة دودة تحتوي على مراسل الفلورسنت Pxol-1 :: GFP للكشف عن انقطاع سلالة الجرثومية وتحريض عدم توازن الصبغيات الجنينية.

ويستند استخدام هذه السلالة المراسل على البروز نادر عموما من الذكور في السكان دودة خنثوي في المقام الأول. هذه الذكور (<0.2٪) تنشأ بشكل طبيعي من خطأ في الفصل بين كروموسوم X ^7. لكن، وكما تعطل الجرثومية يؤدي في كثير من الأحيان إلى أخطاء في فصل الجسميةوheterochromosomes، فإنه يرتبط على حد سواء مع ارتفاع معدل انتشار الإصابة الذكور النمط الظاهري (X missegregation)، وكذلك الفتك الجنينية (صبغي جسدي missegregation). للكشف بسهولة تحريض من الذكور في حين الالتفاف على قضية الفتك الجنينية، ويستخدم مروج المحدد لذكر (XOL-1) لدفع التعبير عن GFP في الأجنة المبكرة لا يزال الواردة في الرحم الدودة. على هذا النحو، ويستخدم ظهور الأجنة، معربا عن GFP كبديل لوجود الأجنة مختل الصيغة الصبغية. تم عرض هذه الطريقة تستخدم في السابق لتحديد الجينات المتورطة في صيانة سلالة الجرثومية والانقسام الاختزالي ^8،9. تكييفها لفحص الكيميائي، وتوظيف هذه السلالة في المتوسط ​​إلى شاشة عالية الإنتاجية. الأهم من ذلك أن سلالة تقارير بأمانة aneugenicity من المواد الكيميائية وبالتالي فهي ذات الصلة لنقاط النهاية الإنجابية الثدييات ^10. سوف مقايسة الموصوفة هنا تكون مفيدة بشكل خاص لعلماء السموم في إعدادات صناعة الكيماويات الدوائية وتبحثلتقييم بسرعة سمية المواد الكيميائية نحو النهاية الإنجابية. وعلاوة على ذلك، هذا الاختبار محاذاة تماما مع الأولويات الحكومية سلط عليها الضوء في سمية في 21 تقرير القرن ^{الحادي و11.}

Protocol

1. إعداد البكتيريا تغذية

ملاحظة: يصف هذا القسم إعداد البكتيريا تغذية (E. القولونية سلالة OP50).

1. عزل مستعمرة واحدة من E. القولونية سلالة OP50 من مرق استذابة (LB) لوحة أجار وجو معقم و مطهر تطعيم في 300 مل من مرق LB تعقيمها.
2. السماح للثقافة تلقيح لتنمو بين عشية وضحاها في شاكر في 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية، حتى يتم التوصل التشبع.
3. نقل OP50 إلى 6 العقيمة، 50 مل أنابيب مخروطية وزنه مسبقا. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 6،000 دورة في الدقيقة (5،000 x ج).
4. تجاهل طاف ويغسل البكتيريا مع 50 مل من العقيمة M9. كرر مرتين.
5. بعد غسل الثاني إزالة M9 المتبقية، وضمان أن لا M9 المتبقي في الأنبوب.
6. تحديد وزن بيليه عن طريق وزن الأنبوب الذي يحتوي على بيليه البكتيريا وطرح وزن 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
7. Resuspend وأنا بيليهن M9 بتركيز 100 ملغ / مل.
8. تخزين حل OP50 في 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامه للثقافة دودة.

2. إعداد نيماتودا النمو المتوسطة لوحات (NGM) بيتري

ملاحظة: يصف هذا القسم إعداد لوحات NGM بيتري، والتي هي لوحات حيث C. تتم المحافظة على الديدان ايليجانس بشكل روتيني في المختبر.

1. الأوتوكلاف آغار المتوسطة NGM.
2. باستخدام الإجراءات العقيمة، والاستغناء 17 مل من NGM حل أجار إلى 6 سم لوحات بيتري باستخدام مضخة تمعجية.
   ملاحظة: هناك كمية ثابتة من أجار في لوحات يقلل من الحاجة إلى إعادة تركيز المجهر عند التبديل من لوحة إلى أخرى.
3. ترك لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أيام قبل الاستخدام للسماح للأجار يصلب والسماح للرطوبة الزائدة لتتبخر.
4. البذور لوحات NGM باستخدام تقنية معقمة. تطبيق 1-2 قطرات من الثقافة السائلة OP50 وتنتشر باستخدام قضيب الزجاج. تأكد من عدملنشر العشب البكتيريا على طول الطريق إلى حواف الصفائح.
5. اسمحوا العشب OP50 لتنمو لمدة 1-2 أيام في درجة حرارة الغرفة قبل استخدام لوحات لتنمو الديدان.

3. إعداد السكان دودة متزامن

ملاحظة: دورة حياة C. وتتألف ايليجانس من المرحلة الجنينية، وأربع مراحل اليرقات (L1-L4) والبلوغ. يصف هذا القسم إعداد السكان في سن متزامن من الديدان. جميع المواد القادمة في اتصال مع C.elegans بعد العلاج التبييض يجب أن تكون معقمة.

1. يوم 1 - إعداد حامل دودة السكان
   1. استخدام لوحات NGM فيها غالبية السكان دودة تتكون من تجويع اليرقات L1.
   2. جمع اليرقات L1 مع دودة تعقيمها انتقاء ونقلها إلى الطازج 6 لوحات سم NGM المصنف مع OP50. احتضان لمدة ما يقرب من 65 ساعة على 20 درجة مئوية حتى غالبية الديدان هم من البالغين حامل. إلىتجنب لوحة الاكتظاظ والسماح للديدان أن ينمو دون استنفاد البكتيريا، لا نقل أكثر من واحد أو اثنين مجموعات من L1 اليرقات إلى كل لوحة NGM الطازجة.
2. يوم 4 - إنشاء المتزامنة L1 اليرقات السكان
   1. جمع الديدان الحاملة للبيض من لوحات NGM من قبل غسلها مع 1-2 مل من M9 ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
   2. السماح للديدان الحاملة للبيض الرواسب في قاع 15 مل أنبوب مخروطي لحوالي 5-10 دقيقة. إزالة طاف دون الإخلال بيليه دودة.
   3. نقل بيليه الدودة إلى 2-4 أنابيب microcentrifuge وإضافة 1 مل من التبييض / هيدروكسيد الصوديوم الحل. احتضان لمدة 2-3 دقيقة في RT. رصد التقدم المحرز في رد الفعل تحت stereomicroscope لتأكيد كل الديدان قد لقوا حتفهم. لا التبييض أطول من 5 دقائق كما الأجنة يمكن أن يموت.
   4. جمع الديدان بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 3،000 دورة في الدقيقة (900 x ج). إزالة طاف وإضافة 1 مل من العقيمة M9 لتحييد رد فعل.
   5. غسل الديدان مرتين من قبل الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 3،000 دورة في الدقيقة (900 x ج).
   6. إزالة طاف وإضافة M9 ليصل الى 100-200 ميكرولتر.
   7. باستخدام الزجاج ماصة باستير إضافة قطرة من دودة / M9 مزيج لمسح لوحات NGM واحتضان لهم لمدة 24 ساعة على الأقل عند 20 درجة مئوية للسماح للأجنة ليفقس.
      ملاحظة: بدون الغذاء سيتم توقف نمو اليرقات في المرحلة L1.
3. اليوم 5 - إنشاء المتزامنة L4 اليرقات السكان
   1. جمع اليرقات L1 من لوحات NGM واضحة من قبل غسل لوحات مع 1-2 مل من M9 ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
   2. السماح للالديدان البالغة ميت الرواسب إلى أسفل أنبوب 15 مل المخروطية لمدة 5 دقائق تقريبا.
   3. جمع طاف، حيث الديدان L1 هي، في الجديد مخروطي 15 مل أنبوب، ويعجل الديدان بواسطة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،600 دورة في الدقيقة (1،000 x ج).
   4. إزالة طاف جنيهأفينغ ما يقرب من 500 ميكرولتر.
   5. تحديد تركيز الديدان في حل M9 عن طريق حساب عدد من الديدان في 10 ميكرولتر قطرات باستخدام stereomicroscope. عدد لا يقل عن 5 قطرات.
   6. ضبط تركيز الديدان إلى 20-25 الديدان / ميكرولتر وإضافة 50 ميكرولتر من دودة / M9 مزيج لوحات NGM المصنف مع OP50.
   7. احتضان لمدة 65 ساعة على 15 درجة مئوية (للحضانة من خلال نهاية الأسبوع) السماح للسكان متزامنة L1 لتنمو حتى تصل إلى مرحلة L4.

4. التعرض للديدان للمواد الكيميائية في لوحات 96-جيدا

ملاحظة: يصف هذا القسم استخدام Pxol1 :: مراسل النسخي GFP تحتوي على C. سلالة ايليجانس للكشف عن تحريض عدم توازن الصبغيات.

1. جمع اليرقات L4 من لوحات NGM واضحة من قبل غسل لوحات مع 1-2 مل من M9 ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
2. السماح للL4 الديدان الرواسب إلى أسفل15 مل أنبوب مخروطي لحوالي 5-10 دقيقة. إزالة طاف دون الإخلال بيليه دودة.
3. إضافة 3-5 مل من M9 وتحديد تركيز الديدان في حل M9 عن طريق حساب عدد من الديدان في 10 ميكرولتر قطرات باستخدام stereomicroscope. عدد لا يقل عن 5 قطرات لكل عينة.
4. Resuspend والديدان بتركيز 1،000 الديدان / مل في M9.
5. تمييع البكتيريا OP50 من الباب 1 10 أضعاف مع M9. تأكد من أن البكتيريا معلق تصل درجة حرارة الغرفة لانخفاض درجة الحرارة تؤثر تطوير دودة.
6. باستخدام ماصة الأقنية، أولا إضافة 100 ميكرولتر من دودة / M9 مزيج (من الخطوة 4.4) ثم قم بإضافة 400 ميكرولتر من البكتيريا OP50 المخفف (من الخطوة 4.5) إلى كل بئر من 2 مل جولة عميقة أسفل لوحة 96-جيدا. في النهاية، سوف يكون كل بئر 100 الديدان في 500 ميكرولتر.
7. إضافة 0.5 ميكرولتر من إما الكيميائية الاختبار أو عنصر التحكم المناسب إلى آبار المطلوب، لتحقيق concentr النهائي المقترحأوجه من 100 ميكرومتر، وتركيز تستخدم عادة في شاشات الكيميائية في C. ايليجانس ^12. كشف الإيثانول أو DMSO الضوابط المذيبات في تركيز النهائي من 0.1٪.
   ملاحظة: نوصي استخدام نوكودازول (100 ميكرومتر)، ومراقبة إيجابية.
8. ختم لوحة باستخدام فيلم لاصقة. تأكد من ختم لوحة جيدا لمنع التلوث المتبادل بين الآبار.
9. التفاف لوحة مع رقائق الألومنيوم.
10. نقل لوحة لشاكر (170-180 دورة في الدقيقة) من درجة حرارة مناسبة لطول مناسب من الزمن (24 أو 65 ساعة). درجة حرارة الغرفة يؤثر على نمو الديدان. الحفاظ على درجة الحرارة نحو 20 درجة مئوية.

5. اكتساب صورة حامل الديدان في لوحة 384 جيدا

ملاحظة: يصف هذا القسم استخدام المجهر نسبة عالية لصورة Pxol1 يتعرض :: الديدان GFP، لتصور التعبير عن GFP في الأجنة داخل الرحم من المنحرفين الكبار. إلىكل لوحة 384 جيدا ليتم عرضه، واستخدام الديدان من لوحات 4 × 96-جيدا.

1. بعد التعرض للمواد الكيميائية في شاكر، والسماح للوحة 96-جيدا بقية لمدة 10-15 دقيقة للسماح للالديدان البالغة من رسوبيات إلى الجزء السفلي من لوحة.
2. باستخدام ماصة متعدد القنوات، وإزالة 350 ميكرولتر من M9، والحرص جدا على عدم تعكير صفو الديدان في الجزء السفلي من لوحة.
3. غسل الديدان مع 1 مل من M9 وكرر الخطوة 5.1.
4. باستخدام ماصة متعدد القنوات، وإزالة 1 مل من M9، والحرص على VEY عدم تعكير صفو الديدان في الجزء السفلي من لوحة.
5. باستخدام ماصة الأقنية، resuspend والديدان في M9 المتبقية وجمع 100 ميكرولتر من دودة / M9 مزيج من لوحات 96-جيدا وتحميله في الآبار من الجدران السوداء / واضحة أسفل لوحة 384 جيدا. كرر العملية باستخدام الديدان من لوحات 4 × 96-جيدا، حتى يتم تحميل جميع الآبار من لوحة 384 جيدا.
   ملاحظة: من المهم لجميع الآبار لديهم نفس حجم من أجل زيادةكفاءة وسرعة ضبط تلقائي للصورة أثناء عملية الحصول على الصور. وينبغي أن تتضمن كل بئر بين 80 و 100 الديدان.
6. إضافة 1 ميكرولتر من الليفاميزول (100 ميكرومتر) إلى كل بئر والسماح للديدان احتضان لحوالي 30 دقيقة.
   ملاحظة: الليفاميزول بمثابة مستقبلات ناهض أستيل ويشل الديدان.
7. نقل لوحة إلى أعلى مستوى المجهر المحتوى widefield قادرة على توفير التصوير الآلي.
8. لاقتناء الصور، واستخدام عالية المحتوى الحصول على الصور وتحليل البرامج وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة. حدد الهدف 4X لاكتساب 1 صورة لكل بئر.
9. قبل البدء في الحصول على الصور، وضبط المعلمات التصوير GFP إلى 45 ميللي ثانية من التعرض ودقة وضوح الصورة إلى 2،160 X 2،160.
10. جمع البيانات مثل عدد الديدان إيجابية GFP مقسوما على إجمالي عدد الديدان في البئر، هذا الاجراء الأخير هو ثابت نسبيا بين الآبار.

النتائج

التعرض للPxol-1 :: GFP مراسل سلالة لعوامل كيميائية مثل أنيبيب السم نوكودازول (الشكل 1) يؤدي إلى تحريض على نسبة عالية من الأجنة، معربا عن GFP في الرحم من المنحرفين الكبار يتعرض مقارنة السيطرة DMSO. الأجنة GFP إيجابية هي أكثر إشراقا بكثير من ضعف مضان الخلفية التي لوح...

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يشكل أول استراتيجية واسعة النطاق لتحديد المواد السامة الجرثومية. ويتطلب ذلك استخدام المعدلة وراثيا GFP Pxol-1 :: GFP تحتوي على السلالة التي تقارير بأمانة تحريض عدم توازن الصبغيات في الأجنة المبكرة والذي يستخدم كبديل لضعف الجرثومية. ينطوي على طري?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Vented, sharp edge Petri dishes	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate	Corning	P-DW-20-C-S
Bactopeptone	Apex	20-261
Bacto-tryptone	Fisher Scientific	BP1421-2
Bleach	Clorox
Calcium chloride (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof	VWR	EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 well plates	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
Levamisole hydrochloride	Fluka	31742
Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software	Molecular Devices
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Rayon films for biological cultures	VWR	60941-086
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
Stereomicroscope	Nikon	SMZ 745	This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Yeast extract	Becton Dickinson	212750