Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Resumen

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Resumen

La identificación de la toxicidad para la reproducción de los miles de productos químicos presentes en el medio ambiente ha sido uno de los retos más tentadoras en el campo de la salud ambiental. Esto se debe en parte a la escasez de sistemas de modelos que pueden (1) recapitular precisión claves características de los procesos reproductivos y (2) lo hacen de una a medio y forma de alto rendimiento, sin la necesidad de un alto número de animales vertebrados.

Se describe aquí un ensayo en el nematodo C. elegans que permite la rápida identificación de sustancias tóxicas de la línea germinal mediante el control de la inducción de embriones aneuploides. Al hacer uso de una línea reportero GFP, los errores en la segregación cromosómica resultante de la interrupción de la línea germinal son fácilmente visualizaron y cuantificaron por microscopía de fluorescencia automatizado. Así, la proyección de un conjunto particular de compuestos para su toxicidad se puede realizar en un formato de placa de 96 a 384 pocillos en cuestión de días. El análisis secundario de h positivosu se puede realizar para determinar si las anomalías cromosómicas se originaron de interrupción meiótica o desde los primeros errores segregación cromosómica embrionarias. En total, este ensayo representa una estrategia de primer paso rápido para la evaluación rápida de la disfunción de la línea germinal después de la exposición química.

Introducción

Hay aproximadamente 87.000 productos químicos registrados para el comercio en los Estados Unidos, sin embargo, sólo un pequeño número de ellos han sido probados para potenciales efectos sobre la salud ^1. De los que han sido probados, sólo una parte se ha evaluado para los efectos de salud reproductiva debido en parte a la dificultad en la determinación de la alteración de los primeros eventos reproductivos en mamíferos, especialmente durante el desarrollo de células germinales femeninas y la diferenciación. De hecho, los primeros eventos meióticos tienen lugar durante las primeras etapas del desarrollo embrionario en mamíferos hembras y son, por tanto, de difícil acceso y recoger en números adecuados para fines de selección.

La línea germinal proporciona el vínculo crucial entre las generaciones, y su función apropiada depende de la precisa ejecución del programa intrincado de la división celular y cromosómica denomina meiosis. La disregulación del proceso de meiótica puede resultar en la reducción de la fertilidad y la producción degametos y embriones con un número anormal de cromosomas, una condición denominada aneuploidía. Errores de segregación de cromosomas en la meiosis son muy importantes para la salud humana. Las anomalías cromosómicas son comunes, con una frecuencia de 1 de cada 150 nacidos vivos, la trisomía 21, 18 y 13, así como X e Y los errores cromosómicos son los tipos más frecuentes ^2,3. Por otra parte, las malformaciones congénitas, incluidas las de origen cromosómico, son la principal causa de muerte infantil en los EE.UU. ⁴ La idea de que las influencias ambientales pueden afectar la segregación cromosómica y el comportamiento no es nuevo ^5, pero aún es poco conocido. Por tanto, es fundamental investigar cuál de los productos químicos introducidos en nuestro entorno están interfiriendo con la fertilidad humana, el desarrollo temprano y la salud reproductiva en general.

A la luz de estas limitaciones de los modelos de mamíferos, hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento pantalla para probar la toxicidad reproductiva en la lombriz C. elegans. Hemos movilizado a varias características importantes que ofrece este sistema modelo genético de uso común, como su pequeño tamaño, bajo coste, ciclo de reproducción corto, alta proporción de células germinales y la facilidad de manipulación ^6. Los gusanos pueden ser cultivadas en placas de 96 pocillos o en cultivos líquidos de alto volumen y por su transparencia se pueden visualizar directamente en placas para la detección de los reporteros fluorescentes. El ensayo descrito a continuación se aprovecha de estas características y se aprovecha de una cepa de gusano que contiene el indicador fluorescente Pxol-1 :: GFP para detectar la interrupción de la línea germinal y la inducción de aneuploidía embrionario.

El uso de esta cepa reportero se basa generalmente en la rara aparición de machos en una población de gusanos principalmente hermafrodita. Estos machos (<0,2%) se originan naturalmente de error en la segregación del cromosoma X ^7. Sin embargo, como la interrupción de la línea germinal conduce con frecuencia a errores en la segregación de los autosomasy de heterocromosomas, que se correlaciona tanto con una incidencia elevada de machos fenotipo (X missegregation), así como la letalidad embrionaria (missegregation autosoma). Para detectar fácilmente la inducción de hombres, mientras que eludir el problema de la letalidad embrionaria, un promotor específico masculino (Xol-1) se utiliza para conducir la expresión de GFP en embriones tempranos todavía contenidos dentro del útero de la gusano. Como tal, la aparición de embriones que expresan GFP se utiliza como un indicador de la presencia de embriones aneuploides. Este método ha sido utilizado anteriormente para identificar genes implicados en el mantenimiento de la línea germinal y ^8,9 meiosis. Adaptado a la detección química, esta cepa se emplea en un medio de pantalla de alto rendimiento. Es importante destacar que la cepa informa fielmente el aneugenicidad de productos químicos y es, por tanto, relevante para puntos finales reproductivos de mamíferos ^10. El ensayo descrito aquí será particularmente útil para toxicólogos en entornos de la industria farmacéutica y química que buscanpara evaluar rápidamente la toxicidad de los productos químicos hacia los puntos finales reproductivos. Por otra parte, este ensayo se alinea plenamente con las prioridades gubernamentales destacadas en la toxicidad en el 21 informe ^{11 del} siglo XXI.

Protocolo

1. Preparación de bacterias Alimentación

NOTA: En esta sección se describe la preparación de las bacterias se alimentan (E. coli cepa OP50).

1. Aislar una sola colonia de E. coli cepa OP50 de un caldo de lysogeny (LB) placa de agar y asépticamente inocular en 300 ml de caldo LB en autoclave.
2. Permitir que el cultivo inoculado para crecer durante la noche en un agitador a 200 rpm y 37 ° C, hasta que se alcanza la saturación.
3. Transferir el OP50 en 6 tubos de 50 ml estériles, previamente pesado cónicas. Sedimentar las bacterias por centrifugación durante 5 min a 6000 rpm (5000 xg).
4. Descartar el sobrenadante y lavar las bacterias con 50 ml de estéril M9. Repetir dos veces.
5. Después del segundo lavado quitar el restante M9, asegurando que no M9 se deja en el tubo.
6. Determinar el peso de la pastilla pesando el tubo que contiene el sedimento de bacterias y restar el peso del tubo cónico de 50 ml.
7. Resuspender el pellet in M9 a una concentración de 100 mg / ml.
8. Almacenar la solución OP50 a 4 ° C hasta que se utiliza para el cultivo gusano.

2. Preparación de crecimiento Nematodo Mediano Placas (NGM) Petri

NOTA: En esta sección se describe la preparación de placas NGM Petri, que son las placas donde el C. gusanos elegans se mantienen rutinariamente en el laboratorio.

1. Autoclave el medio de agar NGM.
2. Usando procedimientos estériles, dispensar 17 ml de solución de agar NGM en 6 cm placas de Petri utilizando una bomba peristáltica.
   NOTA: Una cantidad constante de agar en las placas reduce la necesidad de reorientar el microscopio cuando se pasa de una placa a otra.
3. Deje las placas a temperatura ambiente durante 2-3 días antes de su uso para que el agar se solidifique y permitir que el exceso de humedad se evapore.
4. Sembrar las placas NGM utilizando una técnica estéril. Aplicar 1-2 gotas de cultivo líquido OP50 y extender con una varilla de vidrio. Asegúrese de que nopara difundir el césped bacterias todo el camino hasta los bordes de las placas.
5. Permitir que el césped OP50 crecer durante 1-2 días a temperatura ambiente antes de usar las placas de crecer gusanos.

3. Preparación de un gusano síncrono Población

NOTA: El ciclo de vida de C. elegans se compone de la etapa embrionaria, cuatro estadios larvarios (L1-L4) y la edad adulta. En esta sección se describe la preparación de una población en edad sincrónica de gusanos. Todos los materiales que entran en contacto con C.elegans después del tratamiento blanqueador deben ser estériles.

1. Día 1 - Preparación de Gravid Gusano Población
   1. Utilice NGM placas en el que la mayoría de la población de larvas de gusano consiste L1 Starved.
   2. Recoge las larvas L1 con un gusano esterilizada recoger y transferirlos a 6 cm NGM placas frescas sembradas con OP50. Incubar durante aproximadamente 65 horas a 20 ° C hasta que la mayoría de los gusanos son adultos grávidas. Aevitar placa de hacinamiento y permitir que los gusanos crezcan sin agotar las bacterias, no transferir más de uno o dos grupos de larvas L1 a cada placa NGM fresco.
2. Día 4 - Establecimiento de un Sincronizado L1 larvas Población
   1. Recoger los gusanos grávidas de las placas NGM lavándolas con 1-2 ml de M9 y transferirlos a un tubo de 15 ml cónico.
   2. Deje que los gusanos grávidas de sedimentos para la parte inferior del tubo cónico de 15 ml durante aproximadamente 5-10 min. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento gusano.
   3. Transferir el pellet gusano para 2-4 tubos de microcentrífuga y añadir 1 ml de lejía / solución de NaOH. Incubar durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. Monitorear el progreso de la reacción bajo el microscopio estereoscópico para confirmar todos los gusanos están muertos. No blanquear más de 5 min como los embriones podrían morir.
   4. Recoger los gusanos por centrifugación durante 1 min a 3000 rpm (900 xg). Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de estéril M9neutralizar la reacción.
   5. Lavar los gusanos dos veces por centrifugación durante 1 min a 3000 rpm (900 xg).
   6. Eliminar el sobrenadante y añadir M9 a un máximo de 100 a 200 l.
   7. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio añadir una gota de gusano / M9 mezclar para despejar NGM placas e incubar durante al menos 24 horas a 20 ° C para permitir que los embriones eclosionan.
      NOTA: Sin comida crecimiento de las larvas se detendrá en la fase L1.
3. Día 5 - Establecimiento de un Sincronizado L4 larvas Población
   1. Recoger las larvas L1 de las placas de NGM claras por lavado de las placas con 1-2 ml de M9 y transferirlos a un tubo de 15 ml cónico.
   2. Deja que los muertos gusanos adultos sedimento al fondo del tubo cónico de 15 ml durante aproximadamente 5 min.
   3. Recoger el sobrenadante, donde los gusanos L1 son, en un nuevo tubo cónico de 15 ml, y precipitar los gusanos mediante centrifugación durante 2 min a 2600 rpm (1000 xg).
   4. Eliminar el sobrenadante leabiendo aproximadamente 500 l.
   5. Determinar la concentración de gusanos en la solución M9 contando el número de gusanos en 10 l gotas usando un estereomicroscopio. Contar al menos 5 gotas.
   6. Ajustar la concentración de los gusanos a 20-25 gusanos / l y añadir 50 l de gusano / mezcla M9 a NGM placas sembradas con OP50.
   7. Incubar durante 65 horas a 15 ° C (para la incubación a través del fin de semana) para permitir que la población sincronizada L1 a crecer hasta llegar a la etapa L4.

4. La exposición de los gusanos a los productos químicos en las placas de 96 pocillos

NOTA: En esta sección se describe el uso de Pxol1 :: transcripcional reportero gfp contiene C. elegans cepa para la detección de la inducción de aneuploidía.

1. Recoger las larvas L4 de las placas de NGM claras por lavado de las placas con 1-2 ml de M9 y transferirlos a un tubo de 15 ml cónico.
2. Deje que el L4 gusanos de sedimentos a la parte inferior de la15 ml tubo cónico de aproximadamente 5-10 min. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento gusano.
3. Añadir 3-5 ml de M9 y determinar la concentración de gusanos en la solución M9 contando el número de gusanos en 10 l gotas usando un estereomicroscopio. Contar al menos 5 gotas para cada muestra.
4. Resuspender los gusanos a una concentración de 1,000 gusanos / ml en M9.
5. Diluir las bacterias OP50 de la sección 1 de 10 veces con M9. Asegúrese de que las bacterias se resuspendieron alcancen la temperatura ambiente ya temperatura más baja afecta el desarrollo del gusano.
6. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 l de primero el gusano / mezcla M9 (del paso 4.4) y luego añadir 400 l de las bacterias OP50 diluidas (del paso 4.5) a cada pocillo de una 2 ml de profundidad ronda placa de 96 pocillos de fondo. Al final, cada pozo tendrá 100 gusanos en 500 l.
7. Añadir 0,5 l de cualquiera de la sustancia de ensayo o el control apropiado a los pocillos deseados, para lograr un concentr definitiva sugeridoación de 100 mM, una concentración comúnmente usado en pantallas químicos en C. elegans ^12. Exponer etanol o controles de disolvente DMSO a una concentración final de 0,1%.
   NOTA: Se recomienda el uso de nocodazole (100 M) como control positivo.
8. Sellar la placa con película adhesiva. Asegúrese de sellar la placa bien para prevenir la contaminación cruzada entre los pozos.
9. Envuelva el plato con papel de aluminio.
10. Transferencia de la placa a un agitador (170-180 rpm) de la temperatura apropiada para la longitud de tiempo adecuado (24 o 65 hr). La temperatura de la habitación afecta el crecimiento de los gusanos; mantener la temperatura alrededor de 20 ° C.

5. Adquisición de imágenes de grávidas gusanos en una placa de 384 pocillos

NOTA: Esta sección describe el uso de un microscopio de alta contenido a la imagen de la Pxol1 expuesta :: gfp gusanos, para visualizar la expresión de GFP en los embriones dentro del útero de adultos hermafroditas. Paracada placa de 384 pozos que se proyectarán, usar gusanos de placas de 4 x 96 pocillos.

1. Después de la exposición química en el agitador, dejar que el resto de 96 pocillos placa durante 10-15 minutos para permitir que los gusanos adultos se sedimenten en el fondo de la placa.
2. Con una pipeta multicanal, eliminar 350 l de la M9, ​​teniendo mucho cuidado de no molestar a los gusanos en la parte inferior de la placa.
3. Lave los gusanos con 1 ml de M9 y repita el paso 5.1.
4. Con una pipeta multicanal, quite 1 ml de la M9, ​​siendo vey cuidado de no molestar a los gusanos en la parte inferior de la placa.
5. Con una pipeta multicanal, volver a suspender las lombrices en el restante M9 y recoger 100 l de gusano / mezcla M9 de las placas de 96 pocillos y cargarlo en los pocillos de una paredes negras / placa de 384 pocillos con fondo claro. Repita el proceso utilizando gusanos de placas de 4 x 96 pozos, hasta que se hayan cargado todos los pocillos de la placa de 384 pocillos.
   NOTA: Es importante que todos los pozos que tienen el mismo volumen con el fin de aumentar lala eficiencia y la velocidad del enfoque automático durante el proceso de adquisición de la imagen. Cada pocillo debe contener entre 80 y 100 gusanos.
6. Añadir 1 l de levamisol (100 M) a cada pocillo y dejar que los gusanos se incuban durante aproximadamente 30 min.
   NOTA: El levamisol actúa como un agonista del receptor de acetilcolina e inmoviliza los gusanos.
7. Transferir la placa a un alto contenido microscopio de campo amplio capaz de proporcionar imágenes automatizado.
8. Para la adquisición de imágenes, usar un alto adquisición y análisis de imágenes de software de contenido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Seleccione el objetivo de 4X para adquirir 1 imagen por pocillo.
9. Antes de iniciar la adquisición de la imagen, ajustar los parámetros de imagen GFP a 45 ms de la exposición y resolución de imagen de 2160 x 2160.
10. Recoger los datos como el número de gusanos GFP positivos dividido por el número total de gusanos en el pozo, esta última medida es relativamente constante entre los pozos.

Resultados

La exposición de la Pxol-1 :: GFP reportero cepa a los agentes químicos tales como el veneno de microtúbulos Nocodazol (Figura 1) conduce a la inducción de una alta proporción de embriones que expresan GFP en el útero de hermafroditas adultos expuestos en comparación con el control de DMSO. Los embriones GFP-positivas son significativamente más brillante que el débil fluorescencia de fondo observado en otros embriones, así como la auto-fluorescencia observada en el intestino de los an...

Discusión

El método descrito aquí constituye la primera estrategia de gran escala para la identificación de sustancias tóxicas de la línea germinal. Se requiere el uso de un transgénico GFP Pxol-1 :: GFP que contiene la cepa que reporta fielmente la inducción de aneuploidía en embriones tempranos que se utiliza como proxy para la disfunción de la línea germinal. El método implica la sincronización cuidadosa de una C. población de gusanos elegans y la exposición a los productos químicos gu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Vented, sharp edge Petri dishes	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate	Corning	P-DW-20-C-S
Bactopeptone	Apex	20-261
Bacto-tryptone	Fisher Scientific	BP1421-2
Bleach	Clorox
Calcium chloride (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof	VWR	EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 well plates	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
Levamisole hydrochloride	Fluka	31742
Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software	Molecular Devices
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Rayon films for biological cultures	VWR	60941-086
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
Stereomicroscope	Nikon	SMZ 745	This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Yeast extract	Becton Dickinson	212750