Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Özet

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Özet

Çevremizde bulunan kimyasalların binlerce üreme toksisitesinin belirlenmesi, çevre sağlığı alanında en kabartan zorluklardan biri olmuştur. Bu omurgalı hayvanların yüksek sayıda ihtiyaç duymadan, (1) doğru (2) yüksek verimli moda bir orta bunu yapmak üreme süreçlerinin tuşları özelliklerini özetlemek ve edebilirsiniz model sistemler azlığı kısmen kaynaklanmaktadır.

Biz nematod C. burada bir tahlil açıklamak Anöploid embriyoların indüksiyon izleyerek germlıne Toksik maddelerin hızla belirlenmesini sağlar elegans. GFP muhabiri hattının kullanımı yaparak, germ bozulma kaynaklanan kromozom ayrımı hataları kolayca görülebilir ve otomatik floresan mikroskobu ile ölçülebilir. Böylece toksisitesi bileşiklerin özel bir dizi tarama birkaç gün içinde bir 96- 384-kuyucuklu bir plaka biçiminde gerçekleştirilebilir. Pozitif h ikincil analizionun kromozom anomalileri mayoz bozulma veya erken embriyonik kromozom ayrımı hataları kaynaklanan olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. Tamamen, bu deney, kimyasal maruziyet aşağıdaki germlıne disfonksiyonu hızlı değerlendirilmesi için hızlı ilk geçiş stratejisini temsil eder.

Giriş

Amerika Birleşik Devletleri ticaret için kayıtlı yaklaşık 87,000 kimyasallar, bu potansiyel sağlık etkileri ¹ için test edilmiştir henüz sadece az sayıda bulunmaktadır. Test edilmiş olanların, sadece bir kısmı özellikle kadın germ hücre gelişimi ve farklılaşması sırasında memelilerde erken üreme olayların değişiklik belirlenmesinde zorluk nedeniyle kısmen üreme sağlığı etkileri için değerlendirilmiştir. Gerçekten de, birinci öz değişmesine ait olaylar dişi memelilerde embriyonik gelişiminin erken evrelerinde yer alan ve dolayısıyla erişim ve tarama amaçları için uygun sayıda toplama zordur.

germ kuşaklar arasındaki önemli bağlantıyı sağlar, ve uygun fonksiyon hücresel ve kromozomal bölünme karmaşık programın kesin yürütme mayoz olarak adlandırılan bağlıdır. Öz değişmesine ait işlemin bozulması fertilite düşüklüğü ve üretimi ile sonuçlanabilirkromozom anormal sayıda gamet ve embriyo, bir durum anöploidi olarak adlandırılan. Mayoz kromozom ayrımı hataları insan sağlığı için son derece önemlidir. Kromozom anomalileri 1 150 canlı doğumda sıklığı, Trizomi 21, 18 ve 13 gibi en yaygın türleri ^2,3 olan X ve Y kromozomu hataları ile, yaygındır. Ayrıca, kromozomal kökenli olanlar dahil olmak üzere, konjenital malformasyonlar, ABD ⁴ çevresel etkiler kromozomal ayrımı ve davranışlarını etkileyebilir fikri bebek ölüm önde gelen nedenidir ⁵ yeni değil, ama yine de tam olarak anlaşılamamıştır. İnsan doğurganlık, erken gelişim ve genel üreme sağlığı engellemesini çevremiz içine kimyasalların hangi araştırmak için bu nedenle çok önemlidir.

Memeli modelleri, bu sınırlamaları sebebi olarak, C. elegans. Biz küçük boyutu, düşük maliyet, kısa üreme döngüsü, germ hücrelerinin yüksek oranda ve manipülasyon ⁶ kolaylığı olarak bu yaygın olarak kullanılan genetik model sistem tarafından sunulan birçok önemli özelliği seferber ettik. Solucanlar 96-oluklu plaka ya da yüksek hacimli sıvı kültürlerde yetiştirilebilir ve bu nedenle şeffaflığının doğrudan fluoresan muhabir saptanması için plakalar üzerinde görüntülenebilir. Aşağıda tarif edilen deney, bu özelliklerin avantajının ortaya germline bozulması ve embriyonik anöploidisi uyarılmasını tespit etmek için flüoresan raportör Pxol-1 :: GFP ihtiva eden bir sonsuz soyunun yararlanır.

Bu muhabir gerginlik kullanımı esas hermafroditik solucan nüfus erkeklerin genellikle nadir görülmesi dayanmaktadır. Bu erkek (<% 0.2) doğal X kromozomu ⁷ ayrılığı içinde hatasından kaynaklanmaktadır. Ancak, germ bozulma sık otozomal ayrılığı hatalara yol açarve heterochromosomes nedeniyle, erkek fenotip (X missegregation) yanı sıra, embriyonik öldürücülüğü (autosome missegregation) olarak yükseltilmiş bir oranı ile, her iki ilişkilidir. Embriyonik öldürücülük sorunu engellemeyi kolay kolay erkeklerde uyarılmasını tespit etmek için, bir erkek-özgü promoteri (xol-1), yine de, solucanların rahim içinde bulunan erken embriyolar GFP ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. Bu nedenle, GFP ifade embriyo görünümü anöploid embriyoların varlığı için bir vekil olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem, daha önce germlin bakım ve mayoz ^8,9 karışmış genleri tanımlamak için kullanılır olmuştur. Kimyasal tarama Uyarlanmış, bu suş yüksek verimli ekranına bir ortamda kullanılır. Önemlisi, gerilme sadakatle kimyasalların aneugenicity raporları ve memeli üreme uç noktalara ¹⁰ nedenle alakalı. Burada anlatılan tahlil seyir ilaç ve kimya sanayi ayarlarında toksikoloji özellikle yararlı olacaktırhızla üreme uç noktaları yönelik kimyasalların toksisite değerlendirmek için. Ayrıca, bu deney tamamen ^21. yüzyıl raporunda ¹¹ Toksik vurgulanan devlet öncelikleri ile aynı hizaya.

Protokol

Besleme Bakterilerin 1. Hazırlık

NOT: Bu kısım besleme bakteri (E. coli OP50) hazırlanmasını anlatır.

1. E. tek bir koloni yalıtmak aseptik olarak lizojeni suyu (LB) agar plakadan coli soy OP50 otoklave LB suyu 300 ml içine inoküle.
2. Doygunluğa ulaşıncaya kadar inoküle kültür, 200 rpm'de ve 37 ° C'de bir çalkalayıcı içinde gece boyunca büyümeye izin verin.
3. 6, steril, önceden tartılmış 50 ml konik tüp içine OP50 aktarın. 6000 rpm'de (5000 x g) 5 dakika boyunca santrifüj ile bakteriler Pelet.
4. Süpernatantı atın ve steril M9 50 ml bakteri yıkayın. Iki kez tekrarlayın.
5. İkinci yıkamadan sonra hiçbir M9 tüp bırakılırsa sağlamak, kalan M9 kaldırın.
6. Bakteriler pellet içeren tüp tartılarak pelet ağırlığı belirlemek ve 50 ml konik tüp ağırlığı çıkarılır.
7. Pelet i yeniden süspansen, M9, 100 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda ilave edilebilir.
8. Solucan kültürü için kullanılana kadar 4 ° C 'de OP50 çözeltisi saklayın.

Nematod Büyüme Orta (NGM) Petri Tabaklar 2. Hazırlık

NOT: Bu kısım plakaları C olan NGM Petri kapları hazırlanmasını tarif etmektedir elegans solucanlar rutin laboratuvarda muhafaza edilir.

1. NGM agar ortamı otoklava.
2. Steril prosedürler kullanılarak, bir peristaltik pompa kullanılarak 6 cm Petri kapları içine NGM agar çözeltisi 17 ml dağıtmak.
   NOT: plakalarda agar sabit bir miktarının bir plaka geçerken mikroskop refocusing ihtiyacını azaltır.
3. Ağarı katılaştırmak izin ve fazla nemin buharlaşmasını sağlamak için kullanımdan önce, 2-3 gün süre ile, oda sıcaklığında plakalar bırakın.
4. Steril tekniği kullanarak NGM plakaları Tohum. OP50 sıvı kültürü 1-2 damla uygulayın ve bir cam çubuk kullanarak yayılır. Emin olun değilplakaların kenarlarına bakteri çim tüm yol yaymak için.
5. OP50 çim solucanlar büyümeye plakaları kullanılarak önce oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca büyümeye izin verin.

Bir Senkron Worm Nüfus 3. Hazırlık

NOT: C. yaşam döngüsü elegans embriyonik aşamada, dört larva evreleri (L1-L4) ve yetişkinlik oluşur. Bu bölüm, solucanlar yaşa senkron nüfusun hazırlanmasını tarif etmektedir. Ağartma işleminin ardından C.elegans ile temas eden bütün maddeler steril olması gerekmektedir.

1. Gün 1 - Hamile Worm Nüfus hazırlanması
   1. Solucan nüfusunun çoğunluğu starved L1 larva oluşur hangi NGM tabak kullanın.
   2. Steril bir solucan L1 larva almak toplayın ve taze 6 cm NGM plakalar aktarabilirsiniz OP50 ile ekildi. Solucanların çoğunluğu gebe yetişkin kadar 20 ° C'de yaklaşık 65 saat süre ile inkübe edilir. Içinplaka aşırı kalabalık önlemek ve her yeni NGM plaka L1 larvaların fazla bir veya iki küme aktarmak değil, solucanlar bakteri tüketmeden büyümeye izin.
2. 4. Gün - Bir Senkronize L1 Larva Nüfus kurulması
   1. M9 1-2 ml ile yıkayarak NGM plakaları gebe solucanları toplayın ve bir konik 15 ml tüp aktarabilirsiniz.
   2. Gebe solucanlar yaklaşık 5-10 dakika için 15 ml konik tüp altına sediment edelim. Solucan pelet bozmadan süpernatantı.
   3. 2-4 mikrosantrifüj tüplerine solucan pelet aktarın ve ağartma maddesi / NaOH çözeltisi 1 ml. Oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Tüm solucanlar öldü onaylamak için stereomicroscope altında reaksiyonun ilerlemesini izleyin. Embriyolar ölebilir gibi daha uzun 5 dakika çamaşır suyu yok.
   4. 3000 rpm'de (900 x g), 1 dakika süreyle santrifüjlenerek solucanları toplayın. Süpernatantı ve steril M9 1 ml ekleyinTepkimeyi nötrleştirmek.
   5. 3000 rpm'de (900 x g), 1 dakika için santrifüjleme ile iki kere solucanlar yıkayın.
   6. Süpernatantı ve en fazla 100-200 ul M9 ekleyin.
   7. Bir cam Pasteur pipeti solucanın bir damla ekleyin kullanma / M9 embriyolar yumurtadan izin 20 ° C'de en az 24 saat süreyle bunları NGM plakaları temizlemek ve inkübe karıştırın.
      NOT: Gıda olmadan larvaları büyüme L1 aşamada durdurulur.
3. Gün 5 - Senkronize L4 larvaları Nüfus kurulması
   1. M9 1-2 ml plakaları yıkayarak açık NGM plakaları L1 larvaları toplayın ve bir konik 15 ml tüp aktarabilirsiniz.
   2. Yaklaşık olarak 5 dakika boyunca 15 ml konik tüp alt ölü büyütülmüştür tortu olsun.
   3. Yeni bir konik 15 ml tüp içinde L1 solucanlar süpernatant, toplamak ve 2600 rpm'de (1000 x g), 2 dakika süreyle santrifüjlenerek solucanlar çökeltilmesi.
   4. Süpernatant le kaldıryaklaşık 500 ul aving.
   5. Bir stereomikroskop kullanılarak damla 10 ml içinde solucanlar sayısının sayılmasıyla M9 çözeltisi solucan konsantrasyonunun belirlenmesi. En az 5 damla sayın.
   6. 20-25 solucanlar / ul solucanlar konsantrasyonu ayarlayın ve OP50 ile seribaşı NGM plakalar solucan / M9 karışımı 50 ul ekleyin.
   7. Onlar L4 sahne ulaşana kadar L1 senkronize nüfus büyümeye izin (hafta sonuna kadar inkübasyon için) 15 ° C'de 65 saat inkübe.

96 oyuklu plakalar içerisinde Chemicals Worms 4. maruz

NOT: Bu bölümde Pxol1 kullanımını açıklar :: C içeren GFP transkripsiyonel muhabiri C. elegans suşu anöploidinin uyarılması için taranmaktadır.

1. M9 1-2 ml plakaları yıkayarak açık NGM plakaları L4 larvaları toplayın ve bir konik 15 ml tüp aktarabilirsiniz.
2. Altına L4 solucanlar tortu Let15 mi, yaklaşık 5-10 dakika boyunca konik boru. Solucan pelet bozmadan süpernatantı.
3. M9 3-5 mi ekleyin ve bir stereo mikroskop kullanarak damla 10 ml içinde solucanlar sayısının sayılmasıyla M9 çözeltisi solucan konsantrasyonunu belirler. Her bir numune için en az 5 damla sayın.
4. M9 1000 solucanlar / ml'lik bir konsantrasyonda yeniden süspanse solucanlar.
5. Bölüm 1 OP50 bakteri sulandırmak M9 ile 10 kat. Alt sıcaklık solucan gelişimini etkiler, çünkü yeniden süspanse bakteriler oda sıcaklığına ulaşmasını emin olun.
6. İlk (aşama 4,4) sonsuz / M9 karışımı, 100 ul ve ardından 2 ml derin, yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakanın her oyuğuna (adım 4.5 den) ile seyreltildi OP50 bakteri 400 ul, bir çok kanallı pipet kullanarak. Sonunda, her bir çukura 500 ul, 100 solucanlar olacaktır.
7. Önerilen son Concentr ulaşmak için, istenen kuyulara test kimyasal veya uygun denetim ya 0.5 ul ekle100 mcM tirme, bir konsantrasyon yaygın C kimyasal ekranlarında kullanılan elegans ^12. % 0.1 bir son konsantrasyonda etanol ya da DMSO çözücü kontrol Açığa.
   NOT: Pozitif kontrol olarak nokodazolun (100 mcM) kullanılmasını tavsiye ederiz.
8. Yapışkan film kullanarak plaka Seal. Kuyular arasındaki çapraz bulaşmayı önlemek için plaka mühür emin olun.
9. Alüminyum folyo ile plaka sarın.
10. Zaman uygun uzunlukta (24 veya 65 saat) için uygun sıcaklıkta bir çalkalayıcı (170-180 rpm) plaka aktarın. oda sıcaklığı solucan büyümesini etkiler; yaklaşık 20 ° C sıcaklığı muhafaza.

Bir 384-oyuklu bir plaka içerisinde Hamile Worms 5. Görüntü Alma

NOT: Bu bölüm, ergin hermafrodit bireyler rahim içinde embriyo GFP tanımının görüntülenmesi için, görüntü maruz Pxol1 :: GFP solucanlar içeriği yüksek mikroskop kullanımını tarif eder. IçinHer 384 oyuklu plaka elenecek, 4 x 96-delikli plakadan solucanlar kullanır.

1. Çalkalayıcı kimyasal maruz bırakıldıktan sonra, 10-15 dakika boyunca 96 gözlü plaka kalan büyütülmüştür plakasının tabanına kadar tortu izin sağlar.
2. Bir çok kanallı pipet kullanarak, plakanın alt solucanlar rahatsız etmemek için çok dikkatli olmak, M9 350 ul kaldırın.
3. M9 1 ml ve tekrar adım 5.1 ile solucanlar yıkayın.
4. Bir çok kanallı pipet kullanarak, plakanın alt solucanlar rahatsız etmemek için vey dikkat ederek, M9 1 ml çıkarın.
5. Bir çok kanallı pipet kullanarak, geri kalan M9 solucanlar tekrar süspansiyon ve 96 oyuklu plakalar solucan / M9 karışımı 100 ul toplamak ve siyah bir duvar / şeffaf tabanlı 384-kuyucuklu plak kuyu içine yükleyin. 384-kuyulu plakanın tüm kaynaklar yüklü kadar, 4 x 96-delikli plakadan solucanlar kullanarak tekrarlayın.
   NOT: Bu önemlidir arttırmak için bütün bölümler aynı hacmi içingörüntü elde etme sürecinde verimlilik ve otofokus hızı. Her iyi 80 ila 100 solucanlar arasında içermelidir.
6. Her bir oyuğa, levamizol (100 uM), 1 ul ekle ve solucanlar yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe edin.
   Not: Levamisole bir asetilkolin reseptörü agonisti olarak görev yapar ve solucan hareketsiz.
7. Otomatik görüntüleme sağlayabilen bir widefield içeriği yüksek mikroskop plaka aktarın.
8. Görüntü elde etmek için, üreticinin talimatlarına göre bir içeriği yüksek görüntü elde etme ve analiz yazılımı kullanmak. Kuyu başına 1 görüntü elde etmek 4X hedefi seçin.
9. Görüntü elde etme başlamadan önce, 2160 x 2,160 maruz ve görüntü çözünürlüğü 45 msn GFP görüntüleme parametrelerini ayarlamak.
10. Kuyudaki solucanlar toplam sayısına bölünmesiyle GFP pozitif solucanlar sayısı gibi verileri toplayın, ikinci ölçü kuyuları arasında nispeten tutarlı olmak.

Sonuçlar

Gibi mikrotübül zehir nokodazol gibi kimyasal ajanlara Pxol-1 :: GFP raportör soyunun maruz (Şekil 1) DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında açık ergin hermafrodit bireyler rahmine GFP ifade oğulcukların yüksek bir oranda, indüklenmesine yol açacaktır. GFP pozitif embriyolar diğer embriyolar hem de hayvan bağırsağında görülen bir oto-floresan gözlenen zayıf eşiğe göre belirgin parlaktır. Maruz solucanlar doğrudan 384 çukurlu tabaklarda görüntülenmiş ve en...

Tartışmalar

Burada anlatılan yöntem germlıne Toksik maddelerin belirlenmesi için ilk büyük ölçekli stratejisini oluşturmaktadır. Bu sadakatle germ disfonksiyon için bir vekil olarak kullanılan erken embriyolar anöploidi indüksiyon raporları GFP transgenik Pxol-1 :: GFP içeren suşu kullanımını gerektirir. yöntem, bir C dikkat senkronizasyon gerektirir elegans solucan nüfus ve otomatik yüksek içerik mikroskobu ile GFP pozitif solucanlar görüntüleme ardından 96 kuyulu formatta kim...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Vented, sharp edge Petri dishes	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate	Corning	P-DW-20-C-S
Bactopeptone	Apex	20-261
Bacto-tryptone	Fisher Scientific	BP1421-2
Bleach	Clorox
Calcium chloride (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof	VWR	EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 well plates	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
Levamisole hydrochloride	Fluka	31742
Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software	Molecular Devices
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Rayon films for biological cultures	VWR	60941-086
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
Stereomicroscope	Nikon	SMZ 745	This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Yeast extract	Becton Dickinson	212750