Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Riepilogo

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Abstract

Identificare la tossicità riproduttiva delle migliaia di sostanze chimiche presenti nel nostro ambiente è stata una delle sfide più allettanti nel campo della salute ambientale. Ciò è dovuto in parte alla scarsità di sistemi modello che può (1) ricapitolare accuratamente chiavi caratteristiche dei processi riproduttivi e (2) lo fanno in un medio di moda high-throughput, senza la necessità di un elevato numero di animali vertebrati.

Descriviamo qui un test nel nematode C. elegans che permette la rapida identificazione delle sostanze tossiche linea germinale monitorando l'induzione di embrioni aneuploidi. Facendo uso di una linea di GFP giornalista, errori nella segregazione dei cromosomi derivanti da interruzioni germinale sono facilmente visualizzati e quantificati al microscopio a fluorescenza automatizzata. Così la proiezione di un particolare insieme di composti per la sua tossicità può essere eseguita in un formato di piastra da 96 a 384 pozzetti in pochi giorni. Analisi secondaria di h positivola sua può essere eseguita per stabilire se le anomalie cromosomiche originati da interruzioni meiotic o dai primi errori segregazione dei cromosomi embrionali. Complessivamente, questo test rappresenta una veloce strategia di primo passaggio per la rapida valutazione della disfunzione linea germinale dopo l'esposizione chimica.

Introduzione

Ci sono circa 87.000 sostanze chimiche registrate per il commercio negli Stati Uniti, ma solo un piccolo numero di questi sono stati testati per i potenziali effetti sulla salute ^1. Di quelli che sono stati testati, solo una parte è stata esaminata per effetti sulla salute riproduttiva dovuti in parte alla difficoltà di determinare alterazioni degli eventi riproduttivi primi nei mammiferi, in particolare durante lo sviluppo delle cellule germinali femminile e differenziazione. In effetti, i primi eventi meiotici hanno luogo durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei mammiferi di sesso femminile e sono quindi di difficile accesso e raccogliere in numero adeguato a fini di screening.

La linea germinale fornisce il collegamento cruciale tra le generazioni, e la sua funzione appropriata dipende dalla precisa esecuzione del programma intricata di divisione cellulare e cromosomico chiamato meiosi. Disregolazione del processo meiotica può causare ridotta fertilità e la produzione digameti ed embrioni con un numero anormale di cromosomi, una condizione nota come aneuploidie. Errori segregazione cromosomiche in meiosi sono molto importanti per la salute umana. Anomalie cromosomiche sono comuni, con una frequenza di 1 a 150 nati vivi, Trisomia 21, 18 e 13, nonché X e Y errori cromosomiche che sono i tipi più diffusi ^2,3. Inoltre, malformazioni congenite, incluse quelle di origini cromosomiche, sono la principale causa di morte infantile negli Stati Uniti ⁴ L'idea che le influenze ambientali possono influenzare la segregazione e il comportamento cromosomico non è nuovo ^5, ma è ancora poco conosciuta. E 'quindi fondamentale indagare quali delle sostanze chimiche introdotte nel nostro ambiente stanno interferendo con la fertilità umana, lo sviluppo della prima e della salute riproduttiva generale.

Alla luce di queste limitazioni dei modelli mammiferi, abbiamo sviluppato un saggio schermo high-throughput per testare la tossicità riproduttiva nel verme C. elegans. Abbiamo mobilitato diverse importanti caratteristiche offerte da questo sistema modello genetico di uso comune come le sue piccole dimensioni, a basso costo, ciclo di riproduzione breve, alta percentuale di cellule germinali e la facilità di manipolazione ^6. Worms possono essere coltivate in piastre da 96 pozzetti o in volume di culture alte e liquidi a causa della loro trasparenza possono essere esposte direttamente su piastre per la rilevazione di giornalisti fluorescenti. Il test descritto di seguito sfrutta queste caratteristiche e si avvale di un ceppo verme contenente il reporter fluorescente Pxol-1 :: GFP per rilevare interruzioni germinale e induzione di aneuploidie embrionale.

L'uso di questo ceppo giornalista si basa sul generalmente scarsa incidenza maschi in una popolazione verme principalmente ermafrodita. Questi maschi (<0,2%) naturalmente provengono da errore nella segregazione del cromosoma X ^7. Tuttavia, come interruzione linea germinale porta spesso ad errori in segregazione di autosomie di eterocromosomi, si correla sia con una elevata incidenza di maschi fenotipo (X missegregation) e letalità embrionale (autosoma missegregation). Per rilevare facilmente l'induzione dei maschi, mentre eludere la questione della letalità embrionale, un promotore maschio-specifica (Xol-1) è usato per guidare l'espressione di GFP in embrioni precoci ancora contenuti all'interno dell'utero del worm. Come tale, la comparsa di embrioni-GFP esprimere viene utilizzato come proxy per la presenza di embrioni aneuploidi. Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per identificare i geni implicati nella linea germinale manutenzione e meiosi ^8,9. Adattato per lo screening chimico, questo ceppo è impiegato in un mezzo di schermo ad alta produttività. È importante sottolineare che il ceppo riporta fedelmente la aneugenicity di sostanze chimiche ed è quindi rilevante per endpoint riproduttivi dei mammiferi ^10. Il test qui descritto sarà particolarmente utile per i tossicologi in ambienti dell'industria chimica farmaceutica e ricercadi valutare rapidamente la tossicità delle sostanze chimiche verso endpoint riproduttivi. Inoltre, questo test allinea pienamente con le priorità governative evidenziati nella tossicità nel ^{21 °} rapporto secolo ^11.

Protocollo

1. Preparazione di batteri alimentazione

NOTA: Questa sezione descrive la preparazione di batteri alimentazione (ceppo di E. coli OP50).

1. Isolare una singola colonia di E. coli ceppo OP50 da un brodo lisogenia (LB) piastra di agar e asetticamente inoculare in 300 ml di brodo LB autoclavato.
2. Lasciare la coltura inoculata a crescere durante la notte in un agitatore a 200 rpm e 37 ° C, fino a saturazione.
3. Trasferire il OP50 in 6 50 ml provette coniche sterili, pre-pesati. Pellet i batteri per centrifugazione per 5 min a 6.000 giri (5.000 xg).
4. Eliminare il surnatante e lavare i batteri con 50 ml di sterile M9. Ripetere due volte.
5. Dopo il secondo lavaggio rimuovere il rimanente M9, assicurando che nessun M9 è lasciato nel tubo.
6. Determinare il peso del pellet pesando il tubo contenente il pellet batteri e sottrarre il peso del tubo conico 50 ml.
7. Risospendere il pellet in M9 ad una concentrazione di 100 mg / ml.
8. Conservare la soluzione OP50 a 4 ° C fino al suo utilizzo per la cultura verme.

2. Preparazione del nematode crescita a medio Piastre (NGM) Petri

NOTA: Questa sezione descrive la preparazione di piatti NGM Petri, che sono i piatti in cui il C. vermi elegans sono normalmente mantenute in laboratorio.

1. Sterilizzare l'agar NGM.
2. Utilizzando procedure sterili, erogare 17 ml di soluzione di agar NGM in sei centimetri piastre Petri utilizzando una pompa peristaltica.
   NOTA: una quantità costante di agar-agar in piastre riduce la necessità di rifocalizzare il microscopio quando si passa da un piatto all'altro.
3. Lasciare le piastre a temperatura ambiente per 2-3 giorni prima dell'uso per consentire l'agar solidificare e permettere l'umidità in eccesso di evaporare.
4. Seed le piastre NGM utilizzando una tecnica sterile. Applicare 1-2 gocce di liquido OP50 cultura e diffondere con una bacchetta di vetro. Assicurarsi di nonper diffondere il prato batteri fino ai bordi delle piastre.
5. Lasciare che il prato OP50 a crescere per 1-2 giorni a temperatura ambiente prima di usare le piastre per crescere vermi.

3. Preparazione di un sincrono Worm Popolazione

NOTA: Il ciclo di vita di C. elegans comprende la fase embrionale, quattro stadi larvali (L1-L4) e l'età adulta. Questa sezione descrive la preparazione di una popolazione in età-sincrona di vermi. Tutti i materiali che entrano in contatto con C.elegans dopo il trattamento candeggiante devono essere sterili.

1. 1 ° giorno - Preparazione di Gravid Worm Popolazione
   1. Utilizzare piastre NGM in cui la maggioranza della popolazione è costituito da verme affamato L1 larve.
   2. Raccogliere le larve L1 con un verme sterilizzato raccogliere e trasferirli freschi 6 piatti cm NGM seminato con OP50. Incubare per circa 65 ore a 20 ° C fino a quando la maggior parte dei vermi sono adulti gravide. Aevitare la piastra di sovraffollamento e permettere ai vermi di crescere senza esaurire i batteri, non trasferire più di uno o due gruppi di L1 larve di ogni piatto NGM fresco.
2. Giorno 4 - Istituzione di un Synchronized L1 Larve Popolazione
   1. Raccogliere i vermi gravide dalle piastre NGM lavandoli con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml.
   2. Che i vermi gravide sedimentare sul fondo della provetta conica da 15 ml per circa 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet verme.
   3. Trasferire il pellet verme di 2-4 tubi microcentrifuga e aggiungere 1 ml di candeggina / NaOH. Incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Monitorare l'avanzamento della reazione allo stereomicroscopio per confermare tutti i vermi sono morti. Non candeggiare più di 5 minuti come gli embrioni potrebbero morire.
   4. Raccogliere i vermi per centrifugazione per 1 min a 3000 rpm (900 xg). Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di sterile M9 aneutralizzare la reazione.
   5. Lavare i vermi due volte mediante centrifugazione per 1 min a 3000 rpm (900 xg).
   6. Rimuovere il surnatante e aggiungere M9 fino a 100-200 ml.
   7. Usando una pipetta Pasteur di vetro aggiungere una goccia del verme / M9 miscela per cancellare piastre NGM e incubate per almeno 24 ore a 20 ° C per consentire gli embrioni alla schiusa.
      NOTA: Senza cibo crescita del larve sarà interrotta nella fase L1.
3. Giorno 5 - Istituzione di un Synchronized L4 Popolazione
   1. Raccogliere le larve L1 dalle piastre NGM chiare lavando i piatti con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml.
   2. Lasciare morti vermi adulti sedimenti sul fondo del tubo da 15 ml per circa 5 min.
   3. Raccogliere il surnatante, in cui i vermi sono L1, in un nuovo tubo da 15 ml, e precipitare i vermi per centrifugazione per 2 min a 2600 rpm (1000 xg).
   4. Rimuovere il surnatante leaving circa 500 ml.
   5. Determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M9 contando il numero di vermi in 10 microlitri gocce utilizzando uno stereomicroscopio. Contare almeno 5 gocce.
   6. Regolare la concentrazione dei vermi per 20-25 vermi / ml e aggiungere 50 ml di worm / mix M9 a piastre NGM seminato con OP50.
   7. Incubare per 65 ore a 15 ° C (per l'incubazione con il week-end), per consentire alla popolazione sincronizzato L1 a crescere fino a raggiungere lo stadio L4.

4. L'esposizione di Worms per sostanze chimiche in piastre con 96 pozzetti

NOTA: Questa sezione descrive l'uso di Pxol1 :: giornalista trascrizionale GFP contenenti C. ceppo elegans allo schermo per l'induzione di aneuploidie.

1. Raccogliere le larve L4 dalle piastre NGM chiare lavando i piatti con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml.
2. Lasciare L4 vermi sedimenti sul fondo dellaTubo da 15 ml per circa 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet verme.
3. Aggiungere 3-5 ml di M9 e determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M9 contando il numero di vermi in 10 microlitri gocce utilizzando uno stereomicroscopio. Contare almeno 5 gocce per ogni campione.
4. Risospendere i vermi ad una concentrazione di 1.000 vermi / ml in M9.
5. Diluire i batteri OP50 dalla sezione 1 10 volte con M9. Assicurarsi che i batteri risospeso temperatura ambiente a causa della temperatura più bassa influisce sviluppo verme.
6. Utilizzando una pipetta multicanale, prima aggiungere 100 ml di worm mix / M9 (dal punto 4.4) e poi aggiungere 400 ml di batteri OP50 diluito (dal punto 4.5) in ciascun pozzetto di una profonda rotonda 2 ml bottom piastra da 96 pozzetti. Alla fine, ogni pozzetto avrà 100 vermi in 500 microlitri.
7. Aggiungere 0,5 ml di ciascuna sostanza chimica di prova o il controllo appropriato ai pozzetti desiderati, per ottenere un Conc finale suggeritozione di 100 micron, una concentrazione comunemente usato in schermi chimici in C. elegans ^12. Esporre etanolo o DMSO controlli con solvente ad una concentrazione finale di 0,1%.
   NOTA: Si consiglia l'uso di nocodazole (100 micron) come controllo positivo.
8. Sigillare la piastra con pellicola adesiva. Accertarsi di sigillare la piastra bene per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti.
9. Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio.
10. Trasferire la piastra ad un agitatore (170-180 rpm) della temperatura appropriata per la lunghezza adeguata di tempo (24 o 65 ore). La temperatura della camera colpisce la crescita dei vermi; mantenere la temperatura intorno ai 20 ° C.

5. Acquisizione di immagini di gravide Worms in un piatto da 384 pozzetti

NOTA: Questa sezione descrive l'uso di un microscopio ad alto contenuto di all'immagine Pxol1 esposta :: vermi GFP, di visualizzare l'espressione di GFP in embrioni all'interno dell'utero di ermafroditi adulti. Perogni piatto 384-bene proiettato, utilizzare i vermi da lastre 4 x 96 pozzetti.

1. Dopo esposizione chimica nello shaker, lasciare che la piastra a 96 pozzetti riposo per 10-15 minuti per consentire i vermi adulti per sedimentare sul fondo della piastra.
2. Usando una pipetta multicanale, rimuovere 350 microlitri della M9, ​​facendo molta attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra.
3. Lavare i vermi con 1 ml di M9 e ripetere il punto 5.1.
4. Usando una pipetta multicanale, rimuovere 1 ml di M9, essendo vey attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra.
5. Utilizzando una pipetta multicanale, risospendere i vermi nel restante M9 e raccogliere 100 ml di worm / mix M9 dalle piastre a 96 pozzetti e caricarlo nei pozzetti di una parete nera / chiara fondo piatto 384-bene. Ripetere il processo con i vermi da lastre 4 x 96 pozzetti, finché non sono stati caricati tutti i pozzetti della piastra a 384 pozzetti.
   NOTA: È importante per tutti i pozzetti di avere lo stesso volume per aumentare laefficienza e velocità del autofocus durante il processo di acquisizione dell'immagine. Ogni pozzetto dovrebbe contenere da 80 a 100 vermi.
6. Aggiungere 1 ml di levamisolo (100 micron) in ogni pozzetto e lasciare che i vermi incubare per circa 30 min.
   NOTA: Levamisole agisce come un agonista del recettore dell'acetilcolina e immobilizza i vermi.
7. Trasferire la piastra per un widefield elevato contenuto di microscopio in grado di fornire immagini automatizzata.
8. Per l'acquisizione delle immagini, utilizzare un alto contenuto di software di acquisizione e analisi delle immagini secondo le linee guida del produttore. Selezionare l'obiettivo 4X per acquisire 1 immagine al bene.
9. Prima di avviare l'acquisizione delle immagini, regolare i parametri di imaging GFP a 45 msec di esposizione e risoluzione di 2.160 x 2.160.
10. Raccogliere i dati come il numero di GFP vermi positivi divisa per il numero totale di vermi nel pozzo, quest'ultima misura essendo relativamente costante tra i pozzetti.

Risultati

L'esposizione della Pxol-1 :: GFP giornalista ceppo ad agenti chimici quali microtubulo veleno nocodazole (Figura 1) porta alla induzione di una elevata percentuale di embrioni-GFP esprimere nell'utero di ermafroditi adulti esposti rispetto al controllo DMSO. Gli embrioni GFP-positive sono significativamente più luminoso sfondo debole fluorescenza osservato in altri embrioni nonché l'auto-fluorescenza osservato nell'intestino degli animali. Vermi sono direttamente esposte ripr...

Discussione

Il metodo qui descritto costituisce la prima strategia larga scala per l'identificazione di sostanze tossiche germinali. Si richiede l'uso di un transgenico GFP Pxol-1 :: GFP contenente ceppo che riporta fedelmente l'induzione di aneuploidie in embrioni precoci che viene utilizzato come proxy per la disfunzione linea germinale. Il metodo prevede l'accurata sincronizzazione di un C. popolazione verme elegans e l'esposizione a sostanze chimiche worm 'in formato a 96 pozze...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Vented, sharp edge Petri dishes	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate	Corning	P-DW-20-C-S
Bactopeptone	Apex	20-261
Bacto-tryptone	Fisher Scientific	BP1421-2
Bleach	Clorox
Calcium chloride (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof	VWR	EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 well plates	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
Levamisole hydrochloride	Fluka	31742
Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software	Molecular Devices
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Rayon films for biological cultures	VWR	60941-086
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
Stereomicroscope	Nikon	SMZ 745	This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Yeast extract	Becton Dickinson	212750