Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Abstract

وتعتبر أنظمة المستندة إلى النباتات منصة قيمة لإنتاج البروتينات المؤتلف نتيجة لإمكاناتهم موثقة جيدا لإنتاج مرنة ومنخفضة التكلفة ذات جودة عالية، والمنتجات الحيوية النشطة.

في هذه الدراسة، قارنا التعبير عن هدف البروتين المؤتلف البشري في الثقافات التقليدية القائمة على تخمير الخلية (بكتيريا والحشرات) مع أنظمة التعبير المستندة إلى النباتات، سواء عابرة ومستقرة.

لكل منصة، وصفنا مجموعة المتابعة، والتحسين وطول عملية الإنتاج، وجودة المنتج النهائي والغلة وقمنا بتقييم تكاليف الإنتاج مؤقتة ومحددة لالمؤتلف البروتين الهدف المحدد.

وعموما، نتائجنا تشير إلى أن البكتيريا غير مناسبة لإنتاج البروتين المستهدف بسبب تراكمه داخل هيئات إدراج غير قابلة للذوبان. من ناحية أخرى، وأنظمة المستندة إلى النباتات هي منصات متعددة رقبعة تسمح للإنتاج البروتين المختارة في تكاليف أقل من الفيروسة العصوية / نظام خلية الحشرات. على وجه الخصوص، خطوط المعدلة وراثيا مستقرة عرض أعلى محصول للمنتج النهائي والنباتات التعبير عابرة أسرع عملية التنمية. ومع ذلك، قد يستفيد ليست كل البروتينات المؤتلف من أنظمة المستندة إلى النباتات ولكن ينبغي تحديد أفضل منصة إنتاج تجريبيا مع نهج كل حالة على حدة، كما هو موضح هنا.

Introduction

Recombinant proteins are commercially mass-produced in heterologous expression systems with the aid of emerging biotechnology tools. Key factors that have to be considered when choosing the heterologous expression system include: protein quality, functionality, process speed, yield and cost.

In the recombinant protein field, the market for pharmaceuticals is expanding rapidly and, consequently, most biopharmaceuticals produced today are recombinant. Proteins can be expressed in cell cultures of bacteria, yeasts, molds, mammals, plants and insects, as well as in plant systems (either via stable- or transient-transformation) and transgenic animals; each expression system has its inherent advantages and limitations and for each target recombinant protein the optimal production system has to be carefully evaluated.

Plant-based platforms are arising as an important alternative to traditional fermenter-based systems for safe and cost-effective recombinant protein production. Although downstream processing costs are comparable to those of microbial and mammalian cells, the lower up-front investment required for commercial production in plants and the potential economy of scale, provided by cultivation over large areas, are key advantages.

We evaluated plants as bioreactors for the expression of the 65 kDa isoform of human glutamic acid decarboxylase (hGAD65), one of the major autoantigen in Type 1 autoimmune diabetes (T1D). hGAD65 is largely adopted as a marker, both for classifying and monitoring the progression of the disease and its role in T1D prevention is currently under investigation in clinical trials. If these trials are successful, the global demand for recombinant hGAD65 will increase dramatically.

Here, we focus on the expression of the enzymatically inactive counterpart of hGAD65, hGAD65mut, a mutant generated by substituting the lysine residue that binds the cofactor PLP (pyridoxal-5'-phosphate) with an arginine residue (K396R)1.

hGAD65mut retains its immunogenicity and, in plant and insect cells, accumulates up to ten-fold higher than hGAD65, its wild-type counterpart. It was hypothesized that the enzymatic activity of hGAD65 interferes with plant cell metabolism to such an extent that it suppresses its own synthesis, whereas hGAD65mut, the enzymatically-inactive form, can be accumulated in plant cells to higher levels.

For the expression of hGAD65mut, the use of different technologies, widely used in plant biotechnology, was explored here and compared to traditional expression platforms (Escherichia coli and Baculovirus/insect cell-based).

In this work, the recombinant platforms developed for the expression of hGAD65mut comprising traditional and plant-based systems were reviewed and compared on the basis of process speed and yield, and of final product quality and functionality.

Protocol

1. بناء ناقلات التعبير

  1. التجاري نظام إعادة التركيب الاستنساخ:
    1. تضخيم تسلسل كامل طول الجين الهدف (hGAD65mut) مع الاشعال مناسبة تسمح إضافة المشبك CACC في نهاية 5'من الجين كما هو موضح سابقا (2).
    2. استنساخ المنتج التضخيم هلام تنقية، وفقا للمواصفات عدة الاستنساخ الاتجاه، في ناقلات الدخول (topoisomerase ملزمة) من خلال تجميع التفاعل في الحجم الكلي لل6 ميكرولتر، وذلك باستخدام 1.5: 1 المولي نسبة إدراج: النواقل و1 ميكرولتر من محلول الملح (كلوريد الصوديوم 0.2 M و 0.01 MgCl 2). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. تحويل رد فعل بأكمله إلى المختص كيميائيا E. خلايا القولونية وفقا لمواصفات الاتجاه عدة الاستنساخ والشاشة المستعمرات التي حصلت عليها مستعمرة PCR 3، وذلك باستخدام M13 إلى الأمام وعكس الاشعال المدرجة في هذه المجموعة الاستنساخ الاتجاه. عزل البلازميد من بومستعمرة sitive وفقا لالبلازميد إعداد DNA مواصفات عدة وتسلسل إدراج باستخدام M13 إلى الأمام وعكس الاشعال لضمان عدم وجود الطفرات 3.
    4. استخدام استنساخ دخول الحصول عليها لأداء رد فعل إعادة التركيب من قبل لامدا Recombinase Clonase II أنزيم (LR) مع ناقلات جهة معينة: لالمؤتلف التعبير البروتين في الخلايا البكتيرية مع pDEST17 (العائد pDEST17.G65mut)، في محطات (عابرة أو مستقرة) مع pK7WG2 (العائد pK7WG2.G65mut)، في باكولوفيروس / نظام خلية الحشرات مع الحمض النووي الفيروسي خطي (العائد Baculo.G65mut) 4. تجميع رد فعل، وفقا لمواصفات عدة clonase، مع 100 نانوغرام من ناقلات الدخول، 150 نانوغرام من ناقلات جهة و2 ميكرولتر من مزيج انزيم في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر. احتضان هذا المزيج في RT لمدة 1 ساعة.
    5. تحويل المنتج إلى إعادة التركيب المختص كيميائيا E. خلايا القولونية وفقا لمواصفات عدة clonase. الشاشة المستعمرات التي حصلت عليها PCR 3 باستخدام لجميع رد فعل التحول المستعمرات المستمدة نفس التمهيدي عكس GAD65mut محددة (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ') وناقلات جهة الاشعال إلى الأمام المحددة التالية: لpDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'؛ لpK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '؛ لBaculo ناقلات خطي: ​​5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 ".
    6. عزل DNA البلازميد باستخدام طقم DNA minipreparation التجارية وتأكد من وجود تسلسل الهدف بواسطة PCR 3، وذلك باستخدام نفس مجموعات محددة التمهيدي هو موضح في الخطوة السابقة.
    7. استخدام البلازميدات PCR-الإيجابية التي تم الحصول عليها لتحويل الكائنات المستهدفة المختلفة، اعتمادا على النظام الأساسي الذي تم اختياره لالمؤتلف التعبير البروتين كما هو موضح في الخطوات التالية.
  2. نظام MagnICON 5-7:
    1. استنساخ الجين المستهدف في 3'وحدة pICH31070، كما هو موضح سابقا بالتفصيل 7، مما أسفر عن pICH31070.G65mut. استخدامدورة التالية رد فعل محددة: 30 دقيقة الحضانة عند 37 درجة مئوية، و 5 دقائق عند 50 ° C ثم 5 دقائق عند 80 ° C.

2. المؤتلف التعبير البروتين

  1. نظام الخلية البكتيرية:
    1. تحويل pDEST17.G65mut إلى E. القولونية BL21 (DE3) خلايا electrocompetent باستخدام تقنيات القياسية وفحص المستعمرات نمت على التي تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) LB المتوسطة، عن طريق مستعمرة PCR باستخدام بادئات التحوير محددة التالية: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'و 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 "، مع درجة الحرارة الصلب من 58 درجة مئوية، ووقت استطالة من 20 ثانية. تنفيذ رد فعل PCR في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر بعد حل الخلايا البكتيرية مع طرف البلاستيك في الأنبوب.
    2. تطعيم مستعمرة واحدة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 3 مل من التي تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) LB المتوسطة.
    3. تمييع ثقافة البكتيرية 1: 100 في 100 مل من الطازجة المتوسطة LB (بما في ذلك ampicillفي)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-6 ساعة حتى OD النهائي 600 من 0.8.
    4. حمل المؤتلف التعبير البروتين عن طريق إضافة isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) بتركيز نهائي من 1 ملم واحتضان الثقافة مع قوية تهز لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
    5. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 4،000 x ج لمدة 20 دقيقة واستخدام بيليه البكتيرية لاستخراج البروتين (الخطوة 3.1.1.1).
  2. الفيروسة العصوية نظام خلية / الحشرات:
    1. البذور ورق القطن frugiperda (Sf9) الخلايا في 6 لوحات جيدا (8 × 10 5 خلايا لكل بئر) ويغسل مرتين مع 2 مل من غير أن تستكمل-غريس الحشرات متوسط.
    2. إزالة واستبدال المتوسطة قطرة من الحكمة مع خليط ترنسفكأيشن (5 ميكرولتر LR رد فعل المؤتلف، 6 ميكرولتر حل Celfectin و 200 ميكرولتر غير تستكمل-غريس الحشرات متوسطة).
    3. احتضان لوحات في 27 درجة مئوية لمدة 5 ساعة.
    4. إزالة واستبدال خليط ترنسفكأيشن مع 2 مل من الطازجة SF-900 المتوسطة، على أن تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين و 100 ميكرومتر قانسيكلوفير لتحديد الحيوانات المستنسخة المؤتلف الفيروسة العصوية.
    5. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 96 ساعة على 27 ° C، وجمع المتوسطة (الأسهم الفيروسي V1)، الطرد المركزي في 4،000 x ج لإزالة الخلايا والحطام كبيرة وتخزينها في الظلام في 4 درجات مئوية.
    6. البذور 1 × 10 6 خلايا Sf9 لكل بئر في 2.5 مل SF-900 متوسطة تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين و 100 ميكرومتر قانسيكلوفير وتصيب مع 100 ميكرولتر من الأسهم V1 في كل جيدا.
    7. احتضان خلايا لمدة 3 أيام في 27 ° C.
    8. جمع وأجهزة الطرد المركزي المتوسطة في 4،000 ز س.
    9. تخزين طاف (V2 الأسهم عالية عيار) في 4 درجات مئوية.
    10. البذور 1 × 10 6 خلايا Sf9 لكل بئر في 2.5 مل SF-900 متوسطة تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين و 100 ميكرومتر قانسيكلوفير وتصيب 25 ميكرولتر من الأسهم V2 في كل جيدا.
    11. احتضان خلايا لمدة 3 أيام في 27 ° C.
    12. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4،000 x ج واستخدام بيليه خلية الحشرات لاستخراج البروتين (الخطوة 3.1.2 1).
  3. نيكوتيانا benthamiana أنظمة التعبير عابرة:
    1. تنمو N. النباتات benthamiana في دفيئة، تحت الضوء الطبيعي داخل نطاق درجات الحرارة 18-23 درجة مئوية. لagroinfection استخدام النباتات 4-5 الاسبوع القديمة.
    2. إبقاء النباتات agroinfected في غرفة المناخ في 22 ° C مع 13 ساعة يوم / 11 ليلة في الساعة الضوئية.
    3. التجاري نظام إعادة التركيب الاستنساخ:
      1. إدخال pK7WG2.G65mut في الأجرعية المورمة سلالة EHA105 خلايا electrocompetent كما هو موضح سابقا 8 وفحص المستعمرات، ونمت على LB المتوسطة التي تحتوي على ريفامبيسين (50 ميكروغرام / مل)، الستربتومايسين (300 ميكروغرام / مل)، وسبكتينوميسين (100 ميكروغرام / مل) بعد 2 أيام من الحضانة عند 28 درجة مئوية، من قبل مستعمرة PCR 8 باستخدام بادئات التحوير محددة التالية: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217؛ و5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 "، مع درجة الحرارة الصلب من 58 درجة مئوية، ووقت استطالة من 50 ثانية. تنفيذ رد فعل PCR في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر.
      2. تطعيم البكتيريا في 30 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على ريفامبيسين (50 ميكروغرام / مل)، الستربتومايسين (300 ميكروغرام / مل)، وسبكتينوميسين (100 ميكروغرام / مل) لمدة يومين في 28 ° C.
      3. جمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 4،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend بيليه في 10 مل من العازلة تسلل (10 ملي MES، 10 ملي MgCl 2، 100 ميكرومتر acetosyringone، ودرجة الحموضة 5.6). قياس قيمة OD 600 ثم تعديله إلى 0.9 عن طريق تمييع في نفس العازلة.
        ملاحظة: الحجم الكلي اللازمة للتسلل ثلاثة N. النباتات benthamiana هو 30 مل.
      4. استخدام حقنة 2.5 مل needleless التسلل إلى تعليق الأجرعية في N. benthamiana يترك. بعناية وببطء حقن وحات ورقة مع تعليق من الحقنة. التسلل توسيع ثلاثة لترالطنف للنبات وتستخدم ثلاثة مصانع كما يثلث.
        ملاحظة: لأسباب الصحة والسلامة ارتداء حماية العين خلال عملية تسلل.
      5. جمع الأوراق agroinfiltrated 2 أيام من العدوى آخر (نقطة في البوصة) وتجميد في النيتروجين السائل. متجر الأنسجة النباتية في -80 ° C.
    4. نظام MagnICON:
      1. إدخال ناقلات MagnICON - في "وحدة (pICH20111)، 3 '5 وحدة (pICH31070.G65mut)، وحدة إنزيم مدمج (pICH14011) - في A. المورمة سلالة GV3101 باستخدام تقنيات القياسية. شاشة المستعمرات، ونمت على LB المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين والمضادات الحيوية المناسبة ناقلات محددة (50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين لpICH20111 وpICH14011، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين لpICH31070)، عن طريق مستعمرة PCR باستخدام بادئات محددة لكل النواقل.
      2. تطعيم بشكل منفصل A. ثلاثة المورمة سلالات في 5 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين والمضادات الحيوية ناقلات محددة المناسبةويهز بين عشية وضحاها في 28 ° C.
      3. بيليه الثقافات بين عشية وضحاها البكتيرية بواسطة الطرد المركزي عند 4،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend لهم في مجلدين من ثقافة البكتيرية الأولية من 10 ملي MES (الرقم الهيدروجيني 5.5) و 10 ملي MgSO 4.
      4. خلط كميات متساوية من تعليق البكتيرية التي تحتوي على ناقلات ثلاث واستخدام مزيج تعليق لحقنة تسلل N. benthamiana يترك. تسلل ثلاثة أوراق موسعة للنبات.
      5. جمع الأوراق agroinfiltrated في 4 نقطة في البوصة وتجميد في النيتروجين السائل.
      6. متجر الأنسجة النباتية في -80 ° C.
  4. نيكوتيانا تبغ نظام مستقر التعبير:
    1. النمو والحفاظ في المختبر شتلات من N. تبغ (فار SR1.) على الصلب مستنبت النبات (4.4 غرام / L Murashige وسكوغ - MS - المتوسطة بما في ذلك الفيتامينات، 30 ز / L السكروز، ودرجة الحموضة 5.8، 7 غ / L أجار النبات) تحت ظروف خاضعة للرقابة في غرفة المناخ في 25 ° C مع 16 ساعة يوميا / 8 ساعة / نيالنظام GHT.
    2. بدء قبل ثقافة A. المورمة EHA105 إيواء pK7WG2.G65mut ناقلات التعبير في 5 مل من السائل المتوسطة YEB بالمضادات الحيوية المناسبة (ريفامبيسين 50 ميكروغرام / مل، الستربتومايسين 300 ميكروغرام / مل، سبكتينوميسين 100 ميكروغرام / مل)، وتنمو بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في مجموعة شاكر المداري في 200 دورة في الدقيقة.
    3. استخدام 1 مل من قبل الثقافة لتطعيم ثقافة 50 مل الأجرعية في YEB المتوسطة بالإضافة إلى المضادات الحيوية (ريفامبيسين 50 ميكروغرام / مل، الستربتومايسين 300 ميكروغرام / مل، سبكتينوميسين 100 ميكروغرام / مل)، وتنمو لمدة 24 ساعة، وحتى الثقافة البكتيرية هي المشبعة (OD 600 قيمة 0.5-1.0).
    4. جمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 4،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend بيليه في 50 مل من السائل مستنبت النبات. كرر هذه الخطوة مرتين لإزالة المضادات الحيوية تماما.
    5. خذ أول صحية أوراق توسعت بشكل كامل في المختبر من نباتات التبغ وقطع منها إلى حوالي 1 سم الساحات.
    6. قطع نقل ورقةإلى أطباق بتري العميقة التي تحتوي على تعليق البكتيرية وترك في الظلام لمدة 20 دقيقة.
    7. إزالة قطع ورقة من الايقاف وصمة عار الجافة على الورق مرشح العقيمة.
    8. ضع قطع ورقة مع الجانب متجه نحو المحور (العلوي سطح الورقة) في مصنع صلب الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 1.0 ميكروغرام / مل 6-benzylaminopurine (BAP) و 0.1 ميكروغرام / مل حامض الخليك النفتالين (NAA)، واحتضان لوحات لمدة يومين في غرفة المناخ في ذو شاهد الشروط (25 ° C، 16 ساعة يوم / ليلة 8 ساعة).
    9. قطع ورقة نقل على صلب مستنبت (بما في ذلك 1.0 ميكروغرام / مل BAP، 0.1 ميكروغرام / مل NAA، 500 ميكروغرام / مل سيفوتاكسيم، 100 ميكروغرام / مل الكاناميسين) مع سطح مجافي المحور (السطح السفلي للأوراق) في اتصال مع وسيط.
    10. احتضان لوحات لمدة 2-3 أسابيع في غرفة المناخ عند 25 درجة مئوية مع 16 ساعة / 8 ساعة النظام اليوم / ليلة للحث على تشكيل تبادل لاطلاق النار. ثقافة فرعية كل 2 أسابيع بواسطة نقل إإكسبلنتس ورقة لالطازجة مستنبت النباتات الصلبة التي تحتوي على 1.0 ميكروغرام / مل BAP، 0.1 ميكروغرام / مل NAA، 500ميكروغرام / مل سيفوتاكسيم و 100 ميكروغرام / مل الكانامايسين.
    11. عندما تظهر يطلق النار على نقلها إلى مربعات أرجواني تحتوي الصلبة مستنبت بما في ذلك 500 ميكروغرام / مل سيفوتاكسيم و 100 ميكروغرام / مل الكاناميسين للحث على تشكيل الجذر. احتضان شتلات مع 16 ساعة يوميا / 8 ساعة يلة الضوئية عند 25 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
    12. عندما شكل الجذور، ونقل النباتات إلى التربة في الاحتباس الحراري.
    13. جمع قطعة ورقة لكل مصنع وعزل الحمض النووي الجيني مع مجموعة تجارية.
    14. كشف عن وجود التحوير بواسطة PCR محددة. استخدام 30 نانوغرام من الحمض النووي الجيني كقالب لPCR التضخيم باستخدام بادئات التحوير محددة التالية: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 "و5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3"، مع درجة الحرارة الصلب من 58 درجة مئوية، ووقت استطالة من 20 ثانية . تنفيذ رد فعل PCR في الحجم الكلي لل50 ميكرولتر.
    15. تحليل المنتج 220 نقطة أساس قبل الكهربائي على هلام 1٪ الاغاروز في تريس، خلات-EDTA (تاي) عازلة (40 ملي آرهو، 20 ملم حمض الخليك، و1 ملم EDTA).
    16. اختيار النباتات المعدلة وراثيا تحتوي على الجين المستهدف.
    17. جمع قطعة ورقة من كل من محطة المعدلة وراثيا المختارة وتجميد في النيتروجين السائل على الفور.
    18. إعداد إجمالي مقتطفات من البروتين من أنسجة أوراق النبات (الخطوة 3.1.3) واختبار كل عينة عن طريق تحليل لطخة الغربي كما هو موضح سابقا 2 لاختيار أفضل البروتين المؤتلف نبات التبغ التعبير.
    19. الزهور كيس من النبات اختيار أفضل أداء أمام تزهر لمنع تلاقح.
    20. بعد تزهر، نضج الثمار والبذور والتجفيف، وجمع الحقائب.
    21. بذور منفصلة عن القشر وتخزينها في غرفة جافة في درجة حرارة رقابة (20-24 درجة مئوية).
    22. زرع بذور مجففة لإنتاج النباتات المعدلة وراثيا الجيل الثاني وبعد ذلك حدد مصنع أفضل أداء ليكون التلقيح الذاتي.
    23. كرر نفس الإجراء هو موضح في الخطوات 2.4.19-2.4.21 للأجيال اللاحقة.

    3. المؤتلف تحليلات التعبير البروتين

    1. استخراج البروتين الكلي:
      1. الخلايا البكتيرية:
        1. resuspend الكرية الخلية البكتيرية، التي تم جمعها كما هو موضح في الخطوة 2.1.5، في نصف حجم ثقافة المالحة تريس مخزنة (TBS - 2 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، و 500 ملي مول كلوريد الصوديوم) ودرجة الحموضة 7.4 تستكمل مع 1 ملم phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF).
        2. يصوتن معلق بيليه الخلية ثلاث مرات لمدة 40 ثانية في نصف السلطة، مع الحفاظ على عينة على الجليد.
        3. توضيح المحللة بواسطة الطرد المركزي عند 14،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
        4. نقل طاف لأنبوب نظيفة وتخزين كل من طاف وبيليه على حدة في -80 ° C.
        5. ذوبان الهيئات إدراج، التي تم جمعها في بيليه، في نصف حجم المحللة الخلوي للTBS درجة الحموضة 8.0 تستكمل مع 6 M اليوريا التي كتبها قوية تهز بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
        6. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وجمع طاف في نظيفةأنبوب.
        7. تخزين كل طاف وبيليه في -80 ° C.
      2. خلايا الحشرات:
        1. غسل بيليه الخلية المصابة الحشرات، التي تم جمعها كما هو موضح في الخطوة 2.2.12، مع 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS - 137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 مم KH 2 PO 4) الرقم الهيدروجيني 7.4.
        2. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من تحلل العازلة (20 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم، 3 ملم β المركابتويثانول و 1٪ توين-20)، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
        3. الطرد المركزي يذوب الخلايا في 14،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
        4. جمع الكسور القابلة للذوبان وتخزينها في -80 ° C وتجاهل بيليه.
      3. أوراق النبات الأنسجة:
        1. N. طحن benthamiana أو N. تبغ الأنسجة إلى مسحوق ناعم في النيتروجين السائل باستخدام هاون ومدقة.
        2. التجانس 100 ملغ من الأنسجة أرض الواقع في 300 ميكرولتر من استخراج العازلة (40 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 5 ملي DTT، 1.5٪ CHAPS)، ملحقemented مع 3 ميكرولتر من مثبط البروتياز الكوكتيل وذوبان الجليد على الجليد.
          ملاحظة: نسبة اختيار بين وزن الأنسجة النباتية (ز) لالعازلة (مل) حجم هو 1: 3.
        3. استخراج الطرد المركزي في 30،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
        4. جمع طاف في أنبوب نظيفة وتخزينها في -80 ° C.
    2. Coomassie هلام تلطيخ:
      1. إعداد التخفيف المناسب من إجمالي مقتطفات البروتين (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر من مستخلصات نباتية، 5 ميكرولتر من مقتطفات البكتيرية والحشرات) إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر من العازلة استخراج وإضافة 5 ميكرولتر من 3X عينة عازلة (1.5 M تريس / حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 و 3٪ SDS، الجلسرين 15٪، 4٪ β المركابتويثانول) إلى تركيز 1X النهائي.
      2. عينات يغلي لمدة 10 دقيقة.
      3. البروتينات منفصلة بنسبة 10٪ SDS-PAGE.
      4. بعد الكهربائي، هلام الحرارة في وجود حل Coomassie ألف (0.05٪ بريليانت الأزرق R-250، و 25٪ الأيزوبروبانول، 10٪ حامض الخليك) في فرن الميكروويف لمدة دقيقتينالصورة حتى درجة الغليان.
      5. يبرد هلام إلى درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
      6. تجاهل Coomassie حل تلطيخ A.
      7. هلام يزيل اللون عن طريق التسخين في وجود Coomassie الحل B (0.05٪ بريليانت الأزرق R-250، و 25٪ الأيزوبروبانول)، C (0.002٪ بريليانت الأزرق R-250، وحامض الخليك 10٪) وD (10٪ حامض الخليك) في كل مرة باتباع نفس بروتوكول لتلطيخ.
      8. بعد الخطوة التدفئة الماضية مع الحل D، وترك هلام destaining حتى خلفية واضحة 9.
    3. تحليل لطخة غربية:
      1. بعد الكهربائي، ونقل فصل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز باستخدام تقنيات القياسية وكتلة مع الحليب بنسبة 4٪ في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      2. احتضان صمة عار بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة في عرقلة الحل تحتوي على الأجسام المضادة الأولية الأرنب التي أثيرت ضد البروتين المستهدف في 1: 10،000 وتستكمل مع 0.1٪ توين-20.
      3. بعد تسمية الأجسام المضادة الأوليةجي، وغسل غشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها عرقلة الحل تحتوي على 0.1٪ توين-20.
      4. احتضان مع الفجل البيروكسيديز (HRP) -conjugate الأضداد المضادة للأرنب في 1: 10،000 مقابل 1.5 ساعة.
      5. غسل غشاء 5 مرات لمدة 5 دقائق مع كل PBS-T (PBS تستكمل مع 0.1٪ توين-20).
      6. معالجة طخة غربية باستخدام الغلوثانيون الركيزة chemiluminescent.
    4. فحص Radioimmuno (RIA):
      1. السماح الكواشف (مصل، التتبع والبروتين وسيفاروز) لتصل إلى درجة حرارة الغرفة والماصة 20 ميكرولتر من البروتين استخراج العينات والمعايير بتركيزات مختلفة (من 300-2،400 نانوغرام / مل من hGAD65 التجارية المؤتلف) في أنابيب البوليسترين 12 × 75 مم.
      2. إضافة 20 ميكرولتر من مصل، أعدت تمييع 01:30 المصل من البلازما للمريض T1D.
      3. إضافة 50 ميكرولتر من التتبع (125-I-GAD65)، واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وضع أنبوب مع التتبع فقط لتقدير النشاط الكلي.
      4. إضافة 50 ميكرولترمن البروتين وسيفاروز واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      5. الاستغناء 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة العازلة في كل أنبوب والطرد المركزي في 1،500 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      6. صب الأنابيب لإزالة طاف وامتصاص السائل المتبقي على الورق النشاف من خلال استغلال بلطف الأنبوب.
      7. قياس النشاط الإشعاعي immunoprecipitated في جميع الأنابيب عن طريق عد لمدة 1 دقيقة في لأشعة غاما ومكافحة.
      8. مؤامرة في نطاق سجل معدلات ملزمة (B / T٪) من معايرة المتعلقة بالنشاط الكلي، لإنشاء منحنى القياسية، وقراءة تركيز GAD عينات من منحنى المعايرة 10.
        وينبغي تصميم المقيدة مناطق للتخزين والمناولة والتخلص من المواد المشعة: ملاحظة.

النتائج

يوصف على التصميم التجريبي للتعبير مغاير لالمؤتلف البروتين المستهدف في أنظمة الإنتاج المختلفة هنا. وكان التركيز الأول على انشاء لمنصات مختلفة من خلال إنشاء الظروف المثلى للتعبير عن البروتين المستهدف في كل نظام.

التعبير عن بروتي?...

Discussion

في هذه الدراسة تم مقارنة ثلاث منصات مختلفة للتعبير عن البروتين البشري المؤتلف: الخلايا البكتيرية، وخلايا الفيروسة العصوية / الحشرات والنباتات. وكانت منصة المستندة إلى النباتات مواصلة استكشاف من خلال استغلال ثلاث تقنيات التعبير المستخدمة على نطاق واسع (أي عابر ...

Disclosures

The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this paper.

Acknowledgements

This work was supported by the COST action ‘Molecular pharming: Plants as a production platform for high-value proteins’ FA0804. The Authors thank Dr Anatoli Giritch and Prof. Yuri Gleba for providing the MagnICON vectors for research purposes.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Yeast extractSigma Y1333 
Tryptone Formedium TRP03 
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949 
Sf-900 II SFM mediumGibco 10902-088
Grace’s Insect Medium, unsupplemented Gibco 11595-030 
Cellfectin II ReagentInvitrogen10362-100
MS medium including vitaminsDuchefa Biochemie M0222
SucroseDuchefa Biochemie S0809
Plant agarDuchefa Biochemie P1001
Ampicillin sodiumDuchefa Biochemie A0104Toxic
Gentamycin sulphateDuchefa Biochemie G0124Toxic
GanciclovirInvitrogenI2562-023
Carbenicillin disodiumDuchefa Biochemie C0109Toxic 
Kanamycin sulfateSigmaK4000Toxic 
RifampicinDuchefa Biochemie R0146Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin  sulfateDuchefa Biochemie S0148Toxic 
Spectinomycin  dihydrochloride Duchefa Biochemie S0188
IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) Sigma I5502 Toxic 
MES hydrateSigmaM8250
MgCl2 Biochemical436994U
Acetosyringone SigmaD134406Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Syringe (1 ml)Terumo
MgSO4 Fluka 63136
BAP                                                       (6-Benzylaminopurine) Sigma B3408 Toxic 
NAA (Naphtalene acetic acid) Duchefa Biochemie N0903 Irritant 
Cefotaxime Mylan generics 
Trizma baseSigmaT1503Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer
HCl SigmaH1758Corrosive 
NaClSigmaS30141 M stock
KClSigmaP9541
Na2HPO4SigmaS7907
KH2PO4SigmaP9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride)SigmaP7626Corrosive,  toxic
UreaSigmaU5378
β-mercaptoethanol SigmaM3148Toxic 
Tween-20SigmaP5927
HepesSigmaH3375
DTT (Dithiothreitol) SigmaD0632Toxic – 1 M stock, store at -20 °C
CHAPSDuchefa Biochemie C1374Toxic 
Plant protease inhibitor cocktailSigmaP9599Do not freeze/thaw too many times
SDS (Sodium dodecyl sulphate)SigmaL3771Flammable, toxic, corrosive – 10% stock
GlycerolSigmaG5516
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
IsopropanolSigma24137Flammable
Acetic acidSigma27221Corrosive
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67SigmaG5163Do not freeze/thaw too many times
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibodySigmaA6154Do not freeze/thaw too many times
Sf9 CellsLife Technologies11496
BL21 Competent E.coliNew England BiolabsC2530H
Protein A SepharoseSigmaP2545
Cell culture plates SigmaCLS3516
Radio Immuno Assay kitTechno Genetics12650805Radioactive material 

References

  1. Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
  2. Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).
  3. Sambrook, J., et al. . Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. , (1989).
  4. Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
  5. Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).
  6. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
  7. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), (2008).
  8. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).
  9. Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
  10. Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
  11. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
  12. Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).
  13. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419 (2014).
  14. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).
  15. Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97 benthamiana

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved