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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Abstract

Sistemi a base vegetale sono considerati una valida piattaforma per la produzione di proteine ​​ricombinanti come risultato della loro potenziale ben documentata per la produzione flessibile, a basso costo di alta qualità, prodotti bioattivi.

In questo studio, abbiamo confrontato l'espressione di una proteina ricombinante umana bersaglio nelle culture tradizionali basati fermentatori cellule (batteriche e insetti) con sistemi di espressione a base vegetale, sia transitori e stabili.

Per ogni piattaforma, abbiamo descritto il set-up, ottimizzazione e durata del processo di produzione, la qualità del prodotto finale e le rese e abbiamo valutato i costi di produzione provvisori, specifici per la proteina ricombinante bersaglio selezionato.

Nel complesso, i nostri risultati indicano che i batteri non sono adatti per la produzione della proteina bersaglio a causa della sua accumulo all'interno corpi di inclusione insolubili. D'altro canto, i sistemi a base vegetale sono piattaforme versatili tcappello permettono la produzione della proteina selezionato a bassi costi di-Baculovirus / sistema cellulare di insetto. In particolare, le linee transgeniche stabili visualizzati il ​​massimo rendimento del prodotto finale e le piante che esprimono transitori sviluppo del processo più veloce. Tuttavia, non tutte le proteine ​​ricombinanti possono beneficiare di sistemi a base vegetale, ma la migliore piattaforma di produzione dovrebbero essere determinati empiricamente con un approccio caso per caso, come descritto qui.

Introduzione

Recombinant proteins are commercially mass-produced in heterologous expression systems with the aid of emerging biotechnology tools. Key factors that have to be considered when choosing the heterologous expression system include: protein quality, functionality, process speed, yield and cost.

In the recombinant protein field, the market for pharmaceuticals is expanding rapidly and, consequently, most biopharmaceuticals produced today are recombinant. Proteins can be expressed in cell cultures of bacteria, yeasts, molds, mammals, plants and insects, as well as in plant systems (either via stable- or transient-transformation) and transgenic animals; each expression system has its inherent advantages and limitations and for each target recombinant protein the optimal production system has to be carefully evaluated.

Plant-based platforms are arising as an important alternative to traditional fermenter-based systems for safe and cost-effective recombinant protein production. Although downstream processing costs are comparable to those of microbial and mammalian cells, the lower up-front investment required for commercial production in plants and the potential economy of scale, provided by cultivation over large areas, are key advantages.

We evaluated plants as bioreactors for the expression of the 65 kDa isoform of human glutamic acid decarboxylase (hGAD65), one of the major autoantigen in Type 1 autoimmune diabetes (T1D). hGAD65 is largely adopted as a marker, both for classifying and monitoring the progression of the disease and its role in T1D prevention is currently under investigation in clinical trials. If these trials are successful, the global demand for recombinant hGAD65 will increase dramatically.

Here, we focus on the expression of the enzymatically inactive counterpart of hGAD65, hGAD65mut, a mutant generated by substituting the lysine residue that binds the cofactor PLP (pyridoxal-5'-phosphate) with an arginine residue (K396R)1.

hGAD65mut retains its immunogenicity and, in plant and insect cells, accumulates up to ten-fold higher than hGAD65, its wild-type counterpart. It was hypothesized that the enzymatic activity of hGAD65 interferes with plant cell metabolism to such an extent that it suppresses its own synthesis, whereas hGAD65mut, the enzymatically-inactive form, can be accumulated in plant cells to higher levels.

For the expression of hGAD65mut, the use of different technologies, widely used in plant biotechnology, was explored here and compared to traditional expression platforms (Escherichia coli and Baculovirus/insect cell-based).

In this work, the recombinant platforms developed for the expression of hGAD65mut comprising traditional and plant-based systems were reviewed and compared on the basis of process speed and yield, and of final product quality and functionality.

Protocollo

1. Costruzione di vettori di espressione

  1. Commercial sistema clonazione ricombinazione:
    1. Amplificare la sequenza intera lunghezza del gene bersaglio (hGAD65mut) con primers appropriati consenta l'aggiunta di un morsetto CACC al 5'-end del gene come precedentemente descritto 2.
    2. Clone il prodotto di amplificazione gel purificato, secondo le specifiche del kit clonazione direzionale, nel vettore di ingresso (topoisomerasi vincolata) assemblando la reazione in un volume totale di 6 ml, con un 1,5: 1 molare di inserto rapporto: vettoriale e 1 ml di soluzione di sale (NaCl 0,2 M e 0,01 MgCl 2). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
    3. Trasformare l'intera reazione in chimica competente E. coli secondo le specifiche del kit clonazione direzionali e schermo colonie ottenute da colonia PCR 3, utilizzando M13 avanti e retromarcia primer inclusi nel kit clonazione direzionale. Isolare il plasmide da un pocolonia Privilegiate secondo plasmide preparazione DNA specifiche del kit e la sequenza del inserto con M13 in avanti e reverse primer per garantire l'assenza di mutazioni 3.
    4. Utilizzare il clone ottenuto ingresso per eseguire la reazione di ricombinazione del Lambda ricombinasi Clonase II Enzyme (LR) con vettori specifici di destinazione: per l'espressione della proteina ricombinante in cellule batteriche con pDEST17 (cedendo pDEST17.G65mut), in piante (transitorie o stabili) con pK7WG2 (cedendo pK7WG2.G65mut), in Baculovirus / sistema cellulare insetto con il DNA virale linearizzato (producendo Baculo.G65mut) 4. Assemblare la reazione, secondo le specifiche del kit clonase, con 100 ng di entrata vettoriale, 150 ng di destinazione vettoriale e 2 ml di miscela enzimatica in un volume finale di 10 pl. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora.
    5. Trasforma il prodotto ricombinazione in chimicamente competente E. coli secondo le specifiche del kit clonase. Schermo colonie ottenute mediante PCR 3 utilizzando per tutte le reazioni di trasformazione colonie derivate stesso fondo invertire GAD65mut-specifica 'le seguenti specifiche primer avanti vettori di destinazione e: per pDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3)'; per pK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; per Baculo linearizzato vettore: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 '.
    6. Isolare il DNA plasmidico utilizzando un kit commerciale minipreparation DNA e confermare la presenza della sequenza bersaglio di PCR 3, usando le stesse combinazioni di primer specifici descritti nel passaggio precedente.
    7. Utilizzare i plasmidi PCR-positivi ottenuti per trasformare diversi organismi bersaglio, a seconda della piattaforma scelta per l'espressione della proteina ricombinante, come descritto nelle seguenti procedure.
  2. Sistema MagnICON 5-7:
    1. Clone gene bersaglio nel pICH31070 3'-modulo, come precedentemente descritto in dettaglio 7, cedendo pICH31070.G65mut. Utilizzare ilseguente ciclo reazione specifica: 30 min di incubazione a 37 ° C, 5 min a 50 ° C e poi 5 min a 80 ° C.

2. Recombinant Protein Expression

  1. Sistema cellula batterica:
    1. Trasforma pDEST17.G65mut in E. coli BL21 (DE3) cellule electrocompetent utilizzando tecniche standard e lo schermo le colonie coltivate su-ampicillina contenente (100 mg / ml) LB-media, da colonia PCR utilizzando i primer seguito specifico transgene: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'e 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', con una temperatura di ricottura di 58 ° C e un tempo di allungamento di 20 sec. Effettuare la reazione PCR in un volume totale di 20 microlitri dopo dissoluzione cellule batteriche con una punta di plastica nel tubo.
    2. Seminare una singola colonia notte a 37 ° C in 3 ml di ampicillina-contenimento (100 mcg / ml) LB-media.
    3. Diluire la coltura batterica 1: 100 a 100 ml di fresco medio LB (compresi ampicillin) e incubare a 37 ° C per 1-6 ore fino a OD 600 finale di 0,8.
    4. Indurre l'espressione della proteina ricombinante mediante aggiunta di isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM e incubare coltura con vigorosa agitazione per 3 ore a 37 ° C.
    5. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 4.000 xg per 20 minuti e utilizzare pellet batterico per l'estrazione di proteine ​​(punto 3.1.1.1).
  2. Sistema / cell insetto Baculovirus:
    1. Seed Spodoptera frugiperda (Sf9) cellule in 6 pozzetti (8 x 10 5 cellule per pozzetto) e lavare due volte con 2 ml di non-integrato Insect medio di Grace.
    2. Rimuovere e sostituire il supporto goccia a goccia con la miscela di trasfezione (5 ml LR reazione ricombinante, soluzione Celfectin 6 ml e 200 ml non integrato Insect medio di Grace).
    3. Incubare le piastre a 27 ° C per 5 ore.
    4. Rimuovere e sostituire la miscela di trasfezione con 2 ml di fresco Sf-900 medie, supplementato con siero bovino fetale al 10%, 10 ug / ml di gentamicina e 100 mM ganciclovir per selezionare cloni ricombinanti Baculovirus.
    5. Dopo incubazione per 96 ore a 27 ° C, raccogliere medio (V1 magazzino virale), centrifugare a 4000 xg per rimuovere le cellule e detriti di grandi dimensioni e conservare al buio a 4 ° C.
    6. Seme 1 x 10 6 cellule Sf9 per pozzetto in 2.5 ml Sf-900 terreno contenente siero bovino fetale al 10%, 10 ug / ml di gentamicina e 100 pM ganciclovir ed infettare con 100 ml di V1 magazzino in ogni pozzetto.
    7. Incubare le cellule per 3 giorni a 27 ° C.
    8. Raccogliere e medie centrifugare a 4.000 x g.
    9. Conservare il surnatante (V2 high-titolo azionario) a 4 ° C.
    10. Seme 1 x 10 6 cellule Sf9 per pozzetto in 2.5 ml Sf-900 terreno contenente siero bovino fetale al 10%, 10 ug / ml di gentamicina e 100 pM ganciclovir ed infettare con 25 ml di V2 stock in ogni pozzetto.
    11. Incubare le cellule per 3 giorni a 27 ° C.
    12. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 4.000 xg e utilizzare pellet di cellule di insetto per l'estrazione di proteine ​​(punto 3.1.2. 1).
  3. Nicotiana benthamiana sistemi di espressione transitoria:
    1. Grow N. piante benthamiana in una serra, sotto la luce naturale all'interno del campo di temperatura 18-23 ° C. Per agroinfection utilizzare 4-5 settimane vecchi impianti.
    2. Mantenere piante agroinfected in una camera climatica a 22 ° C con 13 hr giorno / 11 hr notte fotoperiodo.
    3. Commercial sistema clonazione ricombinazione:
      1. Introdurre pK7WG2.G65mut in Agrobacterium tumefaciens ceppo EHA105 cellule electrocompetent come precedentemente descritto 8 e schermare le colonie, coltivate su terreno LB contenente rifampicina (50 mcg / ml), streptomicina (300 mcg / ml) e spectinomicina (100 mcg / ml) dopo 2 giorni di incubazione a 28 ° C, da colonia PCR 8 utilizzando i seguenti primer specifici transgene: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; e 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', con una temperatura di ricottura di 58 ° C e un tempo di allungamento di 50 sec. Effettuare la reazione PCR in un volume totale di 20 microlitri.
      2. Seminare batteri in 30 ml di terreno LB contenente rifampicina (50 mcg / ml), streptomicina (300 mcg / ml) e spectinomicina (100 ug / ml) per due giorni a 28 ° C.
      3. Raccogliere batteri per centrifugazione a 4.000 xg per 20 min e risospendere pellet in 10 ml di tampone di infiltrazione (10 mM MES, 10 mM MgCl 2, 100 mM acetosyringone, pH 5,6). Misurare il valore OD 600 e quindi regolare a 0,9 diluendo nello stesso tampone.
        NOTA: il volume totale necessario per infiltrazione tre N. piante benthamiana è di 30 ml.
      4. Utilizzare una siringa da 2,5 ml senza aghi per infiltrarsi sospensione Agrobacterium in N. benthamiana lascia. Cautela e iniettare lentamente pannelli foglia con la sospensione dalla siringa. Infiltrati tre ampliato lgronda per pianta e utilizzano tre piante triplica.
        NOTA: per motivi di salute e di sicurezza indossare protezioni per gli occhi durante il processo di infiltrazione.
      5. Raccogliere agroinfiltrated foglie due giorni dopo l'infezione (dpi) e congelare in azoto liquido. Conservare tessuto vegetale a -80 ° C.
    4. Sistema MagnICON:
      1. Introdurre i vettori MagnICON - il 'modulo (pICH20111), il 3' 5 moduli (pICH31070.G65mut), e il modulo integrasi (pICH14011) - in A. tumefaciens ceppo GV3101 utilizzando tecniche standard. Schermo le colonie, cresciute su terreno LB contenente 50 mg / ml rifampicina e appropriato di antibiotici specifici per vettore (50 mg / ml per carbenicillina pICH20111 e pICH14011, 50 mg / ml kanamicina per pICH31070), dalla colonia PCR utilizzando primer specifici per ogni vettore.
      2. Seminare separatamente le tre A. tumefaciens ceppi in 5 ml di terreno LB contenente 50 mg / ml rifampicina e appropriato di antibiotici specifici per vettoree agitare una notte a 28 ° C.
      3. Pellet durante la notte colture batteriche per centrifugazione a 4.000 xg per 20 minuti e li risospendere in due volumi della coltura batterica iniziale di 10 mm (MES pH 5.5) e 10 MgSO MM 4.
      4. Miscelare uguali volumi di sospensioni batteriche contenenti i tre vettori e utilizzare il mix sospensione per siringa infiltrazione di N. benthamiana lascia. Infiltrati tre foglie espanse per pianta.
      5. Raccogliere le foglie agroinfiltrated a 4 dpi e congelare in azoto liquido.
      6. Conservare tessuto vegetale a -80 ° C.
  4. Nicotiana tabacum sistema di espressione stabile:
    1. Crescere e mantenere piantine in vitro di N. tabacum (Var Sr1.) su un solido terreno di coltura delle piante (4,4 g / L Murashige e Skoog - MS - media tra cui le vitamine, 30 g / L di saccarosio, pH 5,8, 7 g / L impianto agar) in condizioni controllate, in camera climatica a 25 ° C con 16 ore al giorno / 8 ore / niregime ght.
    2. Avviare un pre-cultura di A. tumefaciens EHA105 ospitare il pK7WG2.G65mut vettore di espressione in 5 ml di terreno YEB liquido con antibiotici appropriati (rifampicina 50 mg / ml, streptomicina 300 mg / ml, spectinomicina 100 mg / ml) e crescere durante la notte a 28 ° C in un set agitatore orbitale a 200 rpm.
    3. Usare 1 ml di pre-cultura per inoculare una cultura di 50 ml Agrobacterium in mezzo YEB più antibiotici (rifampicina 50 mg / ml, streptomicina 300 mg / ml, spectinomicina 100 mg / ml) e crescere per 24 ore, fino a quando la coltura batterica è saturi (OD 600 valore di 0,5-1,0).
    4. Raccogliere batteri per centrifugazione a 4.000 xg per 20 min e risospendere pellet in 50 ml di terreno di coltura liquido pianta. Ripetere questo passaggio due volte per rimuovere completamente gli antibiotici.
    5. Prendere prime foglie completamente sviluppati sani da piante di tabacco in vitro e tagliarle a circa 1 cm quadrati.
    6. Pezzi di foglia Transferai piatti profondi Petri contenente sospensione batterica e lasciare al buio per 20 min.
    7. Togliere i pezzi di foglia di sospensione e asciugare su carta da filtro sterile.
    8. Mettere i pezzi di foglia con lato adaxial (superficie fogliare superiore) su pianta solido terreno di coltura contenente 1,0 mg / ml a 6 benzilaminopurina (BAP) e 0,1 mg / ml di acido acetico naftalene (NAA) e incubare le piastre per due giorni in una camera climatica a controllata condizioni (25 ° C, 16 ore al giorno / 8 ore a notte).
    9. Pezzi di foglia trasferimento su terreno di coltura solidi (tra cui 1,0 mg / ml BAP, 0.1 mg / ml NAA, 500 mg / ml cefotaxime, 100 mg / ml kanamicina) con la superficie abaxial (superficie inferiore della foglia) in contatto con il prodotto.
    10. Incubare le piastre per 2-3 settimane in camera climatica a 25 ° C con 16 ore / 8 ore regime giorno / notte per indurre la formazione di sparare. Subculture ogni 2 settimane per il trasferimento di espianti fogliari di fresco mezzo di coltura vegetale solida contenente 1,0 mg / ml BAP, 0.1 mg / ml NAA, 500ug / ml cefotaxime e 100 ug / ml kanamicina.
    11. Quando germogli sembrano trasferirli scatole Magenta contenenti terreno di coltura solido di cui 500 mg / ml cefotaxime e 100 mg / ml kanamicina per indurre la formazione delle radici. Incubare piantine con 16 ore al giorno / 8 ore a notte fotoperiodo a 25 ° C per 1-2 settimane.
    12. Quando forma radici, trasferire le piante per il suolo in serra.
    13. Raccogliere un pezzo del foglio per ogni impianto e isolare il DNA genomico con un kit commerciale.
    14. Rilevare la presenza del transgene per PCR specifica. Utilizzare 30 ng di DNA genomico come stampo per amplificazione PCR utilizzando i primers specifici transgene seguente: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'e 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', con una temperatura di ricottura di 58 ° C e un tempo di allungamento di 20 sec . Effettuare la reazione PCR in un volume totale di 50 microlitri.
    15. Analizzare il prodotto 220 bp mediante elettroforesi su 1% agarosio gel in Tris-acetato-EDTA (TAE) tampone (Tr 40 mmè, 20 mM di acido acetico, e 1 mM EDTA).
    16. Selezionare piante transgeniche contenenti il ​​gene bersaglio.
    17. Raccogliere un pezzo foglio da ciascuna pianta transgenica selezionato e congelare in azoto liquido immediatamente.
    18. Preparare estratti proteici totali di tessuto foglia di pianta (fase 3.1.3) e testare ogni campione mediante analisi western blot come descritto in precedenza 2 per selezionare la migliore proteina ricombinante che esprime pianta del tabacco.
    19. Fiori Bag del miglior impianto performante selezionato prima della fioritura per evitare l'impollinazione incrociata.
    20. Dopo la fioritura, la maturazione dei frutti e l'essiccazione di semi, raccogliere sacchi.
    21. Semi separato dalla pula e conservarle in un luogo asciutto a temperatura controllata (20-24 ° C).
    22. Seminare i semi essiccati di produrre piante transgeniche di seconda generazione e successivamente selezionare il miglior impianto di prestazioni di essere auto-impollinazione.
    23. Ripetete la stessa procedura descritta nei passaggi 2.4.19-2.4.21 per le successive generazioni.

3. Analisi Recombinant Protein Expression

  1. Estrazione di proteine ​​totali:
    1. Le cellule batteriche:
      1. Risospendere il pellet di cellule batteriche, raccolti come descritto al punto 2.1.5, nella metà del volume cultura di soluzione salina tamponata con Tris (TBS - 2 mM Tris / HCl, NaCl 500 mm) pH 7.4 integrato con 1 phenylmethanesulfonylfluoride mm (PMSF).
      2. Sonicare risospeso pellet tre volte per 40 sec a metà potenza, mantenendo campione sul ghiaccio.
      3. Chiarire lisato mediante centrifugazione a 14.000 xg per 20 min a 4 ° C.
      4. Trasferire il surnatante in una provetta pulita e conservare sia il surnatante e pellet separatamente a -80 ° C.
      5. Solubilizzare i corpi di inclusione, raccolti nel pellet, a metà volume del lisato cellulare di TBS pH 8,0 addizionato con 6 M urea ad una forte agitazione per una notte a temperatura ambiente.
      6. Centrifugare a 10.000 xg per 25 min a temperatura ambiente e raccogliere supernatante in un ambiente pulitotube.
      7. Conservare sia surnatante e pellet a -80 ° C.
    2. Cellule di insetto:
      1. Lavare infettato pellet insetto, raccolti come descritto al punto 2.2.12, con 1 ml di tampone fosfato (PBS - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4) pH 7.4.
      2. Risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone di lisi (20 mM Tris / HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 3 mM β-mercaptoetanolo e 1% Tween-20) e incubare su ghiaccio per 30 min.
      3. Centrifugare cellule solubilizzato a 14000 xg per 20 min a 4 ° C.
      4. Raccogliere frazioni solubili e conservare a -80 ° C e scartare il pellet.
    3. Foglia Impianto tessuto:
      1. N. Grind benthamiana o N. tabacum tessuto polvere fine in azoto liquido usando mortaio e pestello.
      2. Omogeneizzare 100 mg di tessuto a terra in 300 ml di tampone di estrazione (40 mM Hepes pH 7,9, 5 mM DTT, 1,5% CHAPS), supplemented con 3 ml di inibitore della proteasi cocktail e scongelare su ghiaccio.
        NOTA: il rapporto selezionato tra peso tessuto vegetale (g) al buffer volume (ml) è 1: 3.
      3. Estratto Centrifugare a 30.000 xg per 30 min a 4 ° C.
      4. Raccogliere il surnatante in una provetta pulita e conservare a -80 ° C.
  2. Coomassie gel colorazione:
    1. Preparare una diluizione appropriata di estratti proteici totali (ad esempio, 2 ml di estratto vegetale, 5 ml di estratti batterici e insetti) ad un volume finale di 10 ml di tampone di estrazione e si aggiungono 5 ml di tampone campione 3x (1,5 M Tris / HCl pH 6,8, 3% SDS, 15% glicerolo, 4% β-mercaptoetanolo) ad una concentrazione finale 1x.
    2. Campioni bollire per 10 min.
    3. Proteine ​​separate del 10% SDS-PAGE.
    4. Dopo l'elettroforesi, il gel di calore in presenza della soluzione di Coomassie A (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% di isopropanolo, 10% di acido acetico) in un forno a microonde per circa due minutis fino al punto di ebollizione.
    5. Raffreddare gel a temperatura ambiente con un leggero scuotimento.
    6. Eliminare Coomassie soluzione colorante A.
    7. Gel Decolorare mediante riscaldamento in presenza di Coomassie soluzione B (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanolo), C (10% acido acetico) (0,002% Brilliant Blue R-250, 10% di acido acetico) e D ogni volta seguendo lo stesso protocollo per la colorazione.
    8. Dopo l'ultimo passaggio di riscaldamento con la soluzione D, lasciare gel decolorante sino sfondo è chiaro 9.
  3. Occidentale blot:
    1. Dopo l'elettroforesi, le proteine ​​di trasferimento su una membrana di nitrocellulosa utilizzando tecniche standard e blocco con 4% di latte separato in PBS pH 7,4 a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. Incubare la blot notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente in soluzione di saturazione contenente coniglio anticorpo primario sollevata contro la proteina bersaglio a 1: 10.000 e integrato con 0,1% di Tween-20.
    3. Dopo etichetta anticorpo primarioING, lavare la membrana 3 volte per 5 minuti ciascuno con soluzione bloccante contenente 0,1% Tween-20.
    4. Incubare con perossidasi di rafano (HRP) anticorpi anti-coniglio -conjugate a 1: 10.000 per 1,5 ore.
    5. Lavare membrana 5 volte per 5 minuti ciascuno con PBS-T (PBS integrato con 0,1% Tween-20).
    6. Processo Western Blot utilizzando il substrato perossidasi chemiluminescente.
  4. Radioimmuno assay (RIA):
    1. Portare i reagenti (antisiero, tracciante e proteine ​​A Sepharose) a temperatura ambiente e pipetta 20 ml di campioni di estratti di proteine ​​e degli standard in diverse concentrazioni (da 300-2,400 ng / ml di commerciale ricombinante hGAD65) in provette di polistirene 12 x 75 millimetri.
    2. Aggiungere 20 ml di antisiero, preparata diluendo 1:30 il siero di plasmaferesi di un paziente T1D.
    3. Aggiungere 50 ml di tracciante (125-I-GAD65) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Impostare un tubo con tracciante solo per valutare l'attività totale.
    4. Aggiungere 50 mldi proteina A Sepharose e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    5. Erogare 1 ml di tampone PBS freddo in ciascuna provetta e centrifugare a 1500 xga 4 ° C per 30 min.
    6. Decantare le provette per rimuovere il surnatante e assorbire il liquido residuo su carta assorbente picchiettando delicatamente tubo.
    7. Misura immunoprecipitata radioattività in tutte le provette contando per 1 min in un contatore gamma.
    8. Terreno in scala logaritmica le tariffe vincolanti (B / T%) dei calibratori connessi all'attività totale, per stabilire la curva standard e leggere la concentrazione GAD dei campioni dalla curva di calibrazione 10.
      NOTA: Aree riservate dovrebbero essere progettati per l'archiviazione, la gestione e lo smaltimento di materiale radioattivo.

Risultati

Un disegno sperimentale per l'espressione eterologa di una proteina ricombinante bersaglio in diversi sistemi di produzione è descritto qui. Il primo obiettivo è stato il set-up di diverse piattaforme stabilendo le condizioni ottimali per l'espressione della proteina bersaglio in ciascun sistema.

L'espressione della proteina bersaglio, hGAD65mut, è stata indotta in triplicato E. culture coli. Dopo 3 ore di espressione a 37 ° C, le cellule batteriche sono sta...

Discussione

In questo studio sono stati confrontati tre piattaforme diverse per l'espressione di una proteina ricombinante umana: cellule batteriche, cellule Baculovirus / insetti e piante. La piattaforma a base vegetale è stato esaminato ulteriormente sfruttando le tre tecnologie di espressione ampiamente utilizzati (cioè transitoria - MagnICON e pK7WG2 basati - e stabili). La proteina bersaglio scelto per questo esperimento, hGAD65mut, è stata precedentemente espresso in diversi sistemi 13, e la sua pro...

Divulgazioni

The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this paper.

Riconoscimenti

This work was supported by the COST action ‘Molecular pharming: Plants as a production platform for high-value proteins’ FA0804. The Authors thank Dr Anatoli Giritch and Prof. Yuri Gleba for providing the MagnICON vectors for research purposes.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Yeast extractSigmaY1333
TryptoneFormediumTRP03
Agar Bacteriological GradeApplichemA0949
Sf-900 II SFM mediumGibco10902-088
Grace’s Insect Medium, unsupplementedGibco11595-030
Cellfectin II ReagentInvitrogen10362-100
MS medium including vitaminsDuchefa BiochemieM0222
SucroseDuchefa BiochemieS0809
Plant agarDuchefa BiochemieP1001
Ampicillin sodiumDuchefa BiochemieA0104Toxic
Gentamycin sulphateDuchefa BiochemieG0124Toxic
GanciclovirInvitrogenI2562-023
Carbenicillin disodiumDuchefa BiochemieC0109Toxic
Kanamycin sulfateSigmaK4000Toxic
RifampicinDuchefa BiochemieR0146Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin sulfateDuchefa BiochemieS0148Toxic
Spectinomycin dihydrochlorideDuchefa BiochemieS0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside)SigmaI5502Toxic
MES hydrateSigmaM8250
MgCl2Biochemical436994U
AcetosyringoneSigmaD134406Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Syringe (1 ml)Terumo
MgSO4Fluka63136
BAP (6-Benzylaminopurine)SigmaB3408Toxic
NAA (Naphtalene acetic acid)Duchefa BiochemieN0903Irritant
CefotaximeMylan Generics
Trizma baseSigmaT1503Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer
HClSigmaH1758Corrosive
NaClSigmaS30141 M stock
KClSigmaP9541
Na2HPO4SigmaS7907
KH2PO4SigmaP9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride)SigmaP7626Corrosive, toxic
UreaSigmaU5378
β-mercaptoethanolSigmaM3148Toxic
Tween-20SigmaP5927
HepesSigmaH3375
DTT (Dithiothreitol)SigmaD0632Toxic – 1 M stock, store at -20 °C
CHAPSDuchefa BiochemieC1374Toxic
Plant protease inhibitor cocktailSigmaP9599Do not freeze/thaw too many times
SDS (Sodium dodecyl sulphate)SigmaL3771Flammable, toxic, corrosive – 10% stock
GlycerolSigmaG5516
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
IsopropanolSigma24137Flammable
Acetic acidSigma27221Corrosive
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67SigmaG5163Do not freeze/thaw too many times
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibodySigmaA6154Do not freeze/thaw too many times
Sf9 CellsLife Technologies11496
BL21 Competent E. coliNew England BiolabsC2530H
Protein A SepharoseSigmaP2545
Cell culture platesSigmaCLS3516
Radio Immuno Assay kitTechno Genetics12650805Radioactive material

Riferimenti

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