Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Özet

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Özet

Bitki esaslı sistemler, yüksek kaliteli, biyolojik olarak aktif ürünler, esnek ve düşük maliyetli bir üretim için bunların iyi belgelenmiş potansiyel bir sonucu olarak, rekombinant proteinlerin üretimi için değerli bir platform olarak kabul edilir.

Bu çalışmada, geçici ve stabil olarak bitki bazlı ekspresyon sistemleri, geleneksel fermentasyon cihazı dayalı hücre kültürlerinde (bakteriyel ve böcek) ve hedef insan yeniden birleştirici proteinin ifadesini karşılaştırıldı.

Her platformda için, biz set-up, optimizasyon ve üretim sürecinin uzunluğu, nihai ürün kalitesi ve verimi açıklanan ve bizim seçtiğimiz hedef rekombinant protein için özel geçici üretim maliyetlerini, değerlendirildi.

Genel olarak, sonuçlar bakteri bağlı erimez içerik korları dahilinde birikmesi, hedef proteinin üretimi için uygun olduğunu göstermektedir. Öte yandan, bitki bazlı sistemler, çok yönlü platformlar t'ninşapka Bakulovirüs / böcek hücre sistemine daha düşük maliyetlerle seçilen proteinin üretimine izin verir. Özellikle, istikrarlı transgenik hatları nihai ürünün en yüksek verim ve geçici ifade bitkiler hızlı süreç geliştirme görüntülenen. Ancak, tüm rekombinant proteinleri bitki-temelli sistemlerde yararlanabilirler, ancak burada anlatıldığı gibi iyi üretim platformu, bir vaka-by-case yaklaşımı ile ampirik olarak tespit edilmelidir.

Giriş

Recombinant proteins are commercially mass-produced in heterologous expression systems with the aid of emerging biotechnology tools. Key factors that have to be considered when choosing the heterologous expression system include: protein quality, functionality, process speed, yield and cost.

In the recombinant protein field, the market for pharmaceuticals is expanding rapidly and, consequently, most biopharmaceuticals produced today are recombinant. Proteins can be expressed in cell cultures of bacteria, yeasts, molds, mammals, plants and insects, as well as in plant systems (either via stable- or transient-transformation) and transgenic animals; each expression system has its inherent advantages and limitations and for each target recombinant protein the optimal production system has to be carefully evaluated.

Plant-based platforms are arising as an important alternative to traditional fermenter-based systems for safe and cost-effective recombinant protein production. Although downstream processing costs are comparable to those of microbial and mammalian cells, the lower up-front investment required for commercial production in plants and the potential economy of scale, provided by cultivation over large areas, are key advantages.

We evaluated plants as bioreactors for the expression of the 65 kDa isoform of human glutamic acid decarboxylase (hGAD65), one of the major autoantigen in Type 1 autoimmune diabetes (T1D). hGAD65 is largely adopted as a marker, both for classifying and monitoring the progression of the disease and its role in T1D prevention is currently under investigation in clinical trials. If these trials are successful, the global demand for recombinant hGAD65 will increase dramatically.

Here, we focus on the expression of the enzymatically inactive counterpart of hGAD65, hGAD65mut, a mutant generated by substituting the lysine residue that binds the cofactor PLP (pyridoxal-5'-phosphate) with an arginine residue (K396R)¹.

hGAD65mut retains its immunogenicity and, in plant and insect cells, accumulates up to ten-fold higher than hGAD65, its wild-type counterpart. It was hypothesized that the enzymatic activity of hGAD65 interferes with plant cell metabolism to such an extent that it suppresses its own synthesis, whereas hGAD65mut, the enzymatically-inactive form, can be accumulated in plant cells to higher levels.

For the expression of hGAD65mut, the use of different technologies, widely used in plant biotechnology, was explored here and compared to traditional expression platforms (Escherichia coli and Baculovirus/insect cell-based).

In this work, the recombinant platforms developed for the expression of hGAD65mut comprising traditional and plant-based systems were reviewed and compared on the basis of process speed and yield, and of final product quality and functionality.

Protokol

İfade Vektörler 1. İnşaatı

1. Ticari rekombinasyon klonlama sistemi:
   1. Daha önce tarif edildiği gibi ² uygun primerler genin 5 'ucunda bir OAKK kelepçe eklenmesini sağlayan hedef gen (hGAD65mut) tam uzunlukta dizisi yükseltin.
   2. 1 mol oranı ekleme: vektör ve 1 ul bir 1.5 kullanarak, 6 ul bir toplam hacim içinde reaksiyonu monte edilerek giriş vektörü (topoizomeraz bağlı) 'de, yönlü klonlama kiti özelliklerine göre, jelle saflaştırıldı amplifikasyon ürünü Clone tuz çözeltisi (0.01 _MgCl2 0.2 M NaCI ve benzeri). Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) inkübe edilir.
   3. Kimyasal yetkili E. içine tüm reaksiyonu Dönüşümü koloni PCR ³ ile yön klonlama kiti özelliklerine ve ekran elde koloniler, ileri M13 kullanarak ve geri primerler göre coli hücreleri yönlü klonlama kitine dahil. Bir Porselen plazmid izolemutasyonlar ³ yokluğunu sağlamak için primerler ileri M13 kullanarak ve ters plazmid DNA hazırlık seti özellikleri ve sırayla uç göre sas koloni.
   4. Belirli bir hedef vektörleri ile Lambda Recombinase Clonase II, enzim (LR) ile rekombinasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için elde edilen giriş klonu kullanın: pDEST17 (pDEST17.G65mut veren) ile bakteri hücrelerinde rekombinan protein ekspresyonu için, pK7WG2 ile (geçici ya da kararlı) bitkilerde ⁴ (Baculo.G65mut sonuçta) doğrusallaştırılmış, viral DNA ile Bakulovirüs / böcek hücre sistemine (pK7WG2.G65mut elde edilir). Giriş 100 ng vektör, vektör, hedeflenen 150 ng ve 10 ul'lik bir nihai hacim içinde enzim karışımı 2 ul, Clonase kiti özelliklerine göre, reaksiyon bir araya getirin. 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım inkübe edin.
   5. Kimyasal olarak, yetkili E. içine yeniden birleştirme ürünü Dönüşümü Clonase kiti özelliklerine göre coli hücreleri. PCR ³ ile ekran elde koloniler her bir transformasyon reaksiyonu edilen koloniler, aynı ters GAD65mut özgü primer kullanılarak (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ') ve aşağıdaki özel hedef vektörleri ileri primerler: pDEST17 için: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; pK7WG2 için: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; Bakülo doğrusallaştırılmış vektörü için: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 '.
   6. Ticari minipreparat DNA takımı kullanılarak plazmit DNA izole etmek ve önceki aşamada tarif edilenle aynı spesifik primer kombinasyonları kullanılarak, PCR ³ ile hedef sekansın varlığını doğrulamaktadır.
   7. Aşağıdaki adımlarda tarif edildiği gibi yeniden birleştirici protein ekspresyonu için seçilen platform bağlı olarak, farklı hedef organizmaların dönüştürülmesi için elde edilen PCR pozitif plazmidler kullanın.
2. MagnICON sistemi ^5-7:
   1. Daha önce pICH31070.G65mut, sonuçta ayrıntılı ^7'de tarif edildiği gibi, 3'-modülü pICH31070 hedef genin klonlanması. KullanBelirli bir reaksiyon döngüsü aşağıdaki gibidir: 80 ° C'de 37 ° C, 50 ° C de 5 dakika ile 30 dakika inkübasyon ve daha sonra 5 dakika.

2. Rekombinant Protein

1. Bakteriyel hücre sistemi:
   1. E. içine pDEST17.G65mut Dönüşümü E. coli BL21 (DE3), aşağıdaki transgen spesifik primerler kullanılarak koloni PCR ile amfisilin içeren (100 ug / ml) üzerinde büyümüş standart teknikler ve ekran koloniler LB-ortamı kullanılarak elektro-hücre: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 've 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', 58 ° C'lik bir tavlama sıcaklığında ve 20 saniyelik bir uzama süresi ile. Tüp plastik bir ucu ile bakteriyel hücreler çözüldükten sonra 20 ul bir toplam hacim içinde PCR reaksiyonunu yürütmek.
   2. Ampisilin ihtiva eden (100 ug / ml), 3 ml LB ortamı içinde 37 ° C'de gece boyunca tek bir koloni inoküle.
   3. Bakteri kültürü 1 sulandırmak: Taze LB ortamı 100 100 ml (dahil ampicillve benzeri) bir son OD 0.8 ₆₀₀ kadar 1-6 saat süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
   4. 1 mM'lik bir son konsantrasyonda isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) eklenmesi ile yeniden birleştirici proteinin ifadesini teşvik eder ve kuvvetli, 37 ° C'de 3 saat boyunca çalkalanarak kültüre kuluçkalayın.
   5. 20 dakika boyunca 4.000 xg'de santrifüj hücreleri toplayın ve protein ekstraksiyonu (adım 3.1.1.1) için bakteriyel pelet kullanın.
2. Bakulovirüs / böcek hücresi sistemi:
   1. Tohum Spodoptera frugiperda (Sf9) 6 çukurlu plakalara hücreleri (oyuk başına 8 x 10 ⁵ hücre) ve non-desteklenmiş Grace Böcek Ortama 2 ml iki kez yıkayın.
   2. Orta damla damla transfeksiyon karışımı (5 ul LR rekombinant reaksiyonu, 6 ul Celfectin solüsyonu ve 200 ul olmayan takviye Grace'in Böcek Orta) ile çıkarın ve değiştirin.
   3. 5 saat boyunca 27 ° C'de inkübe edin.
   4. Çıkarın ve taze Sf-9 2 ml transfeksiyon karışımı yerine% 10 fetal sığır serumu, 10 ug / ml gentamisin ve 100 uM gansiklovir ile takviye edilmiş 00 orta, rekombinant bakulovirüs klonları seçmek için kullanılır.
   5. 27 ° C 'de 96 saat süre ile inkübasyondan sonra, 4 ° C'de karanlıkta hücreleri ve büyük parçaları ve mağaza çıkarmak için 4000 x g'de ortamı (V1, viral stok), santrifüj toplar.
   6. Tohum başına 1 x 10 ⁶ Sf9 hücreleri de 2.5 mi Sf-900,% 10 foetal bovin serumu, 10 ug / ml gentamisin ve 100 uM gansiklovir ihtiva eden ve de her V1 stok 100 ul ile enfekte etmektedir.
   7. 27 ° C 'de 3 gün boyunca kuluçkaya bırakılır.
   8. Toplayın ve santrifüj ortamı 4,000 x g.
   9. 4 ° C'de yüzer (V2 yüksek titre stok) saklayın.
   10. Tohum başına 1 x 10 ⁶ Sf9 hücreleri de 2.5 mi Sf-900,% 10 foetal bovin serumu, 10 ug / ml gentamisin ve 100 uM gansiklovir ihtiva eden ve de her V2 stokunun 25 ul ile enfekte etmektedir.
   11. 27 ° C 'de 3 gün boyunca kuluçkaya bırakılır.
   12. 4.000 xg'de santrifüj hücreleri toplayın ve protein ekstraksiyonu (adım 3.1.2. 1) için böcek hücre pelet kullanın.
3. Nicotiana benthamiana geçici ifade sistemleri:
   1. N. büyütün sıcaklık aralığı 18-23 ° C arasında doğal ışık altında bir serada, içinde benthamina bitkiler. Agro için 4-5 haftalık bitkiler kullanın.
   2. Bir 13 saat gündüz / 11 saat gece ışık süresi ile 22 ° C'de bir iklim odasına agroinfected bitkiler tutun.
   3. Ticari rekombinasyon klonlama sistemi:
      1. Agrobacterium suşu EHA105 yer alır elektro-hücre tumefaciens daha önce tarif edildiği gibi ⁸ pK7WG2.G65mut tanıtmak ve sonra 2 LB ortamı içeren rifampisin (50 ug / ml), streptomisin (300 ug / ml) ve spektinomisin (100 ug / ml) üzerinde büyüyen kolonilerin, ekran Aşağıdaki transgen spesifik primerler kullanılarak koloni PCR ⁸ ile 28 ° C'de inkübasyondan gün: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 #8217; ve 58 ° C'lik bir tavlama sıcaklığında ve 50 saniyelik bir uzama kez 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ',. 20 ul bir toplam hacim içinde PCR reaksiyonunu yürütmek.
      2. 28 ° C'de iki gün boyunca LB ortamı içeren rifampisin (50 ug / ml), streptomisin (300 ug / ml) ve spektinomisin (100 ug / ml), 30 ml bakteri ile inoküle.
      3. Infiltrasyon tamponu, 10 ml 20 dakika ve tekrar süspansiyon pelet (10 mM MES, 10 mM _MgCl2, 100 uM asetosiringon, pH 5.6) için 4000 x g'de santrifüj ile bakteriler toplanır. OD ₆₀₀ değeri ölçmek ve daha sonra aynı tamponda seyreltilmesi ile 0.9 ayarlayabilirsiniz.
         NOT: Üç N. infiltre için gerekli toplam hacim benthamiana bitkileri 30 ml'dir.
      4. N. Agrobacterium süspansiyonu sızmak için 2.5 ml iğnesiz bir şırınga kullanın benthamiana bırakır. Dikkatlice ve yavaşça şırınga süspansiyon yaprak panelleri enjekte. Üç genişletilmiş l Infiltratebitkide saçak ve üçlü olarak üç bitki kullanabilirsiniz.
         NOT: Sağlık ve güvenlik nedenleri sızma işlemi sırasında koruyucu gözlük takın için.
      5. Sıvı azot içinde agroinfiltrated yaprakları 2 gün sonrası enfeksiyon (dpi) ve dondurma toplayın. -80 ° C'de saklayın bitki dokusu.
   4. MagnICON sistemi:
      1. 5 'modülünü (pICH20111), 3' modülü (pICH31070.G65mut) ve integraz modülünü (pICH14011) - - A'da MagnICON vektörleri tanıtmak standart teknikler kullanılarak GV3101 tumefaciens ırkı. Ihtiva eden LB ortamı üzerinde büyüyen kolonilerin, ekran 50 ug / ml rifampicin ve her bir vektör için spesifik primerler kullanılarak koloni PCR ile uygun vektör spesifik antibiyotik (pICH20111 ve pICH14011, 50 ug / ml kanamisin pICH31070 için 50 ug / ml karbenisilin).
      2. Ayrı ayrı üç A. aşılamak tumefaciens içeren LB ortamında 5 ml suşları 50 ug / ml rifampicin ve uygun vektör spesifik antibiyotikve 28 ° C 'de bir gece boyunca çalkalanır.
      3. Pelet, gece boyunca, bakteriyel 20 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüjleme ile kültür ve 10 mM MES (pH 5.5) ve 10 mM MgSO ₄ ilk bakteri kültürü iki hacim bunları yeniden süspanse edin.
      4. Üç vektörleri içeren bakteri süspansiyonları eşit hacimlerde karıştırın ve N. şırınga infiltrasyonu için süspansiyon karışımı kullanın benthamiana bırakır. Bitki başına üç genişletilmiş yaprakları sızmak.
      5. 4 dpi agroinfiltrated yaprakları toplayın ve sıvı azot içinde dondurma.
      6. -80 ° C'de saklayın bitki dokusu.
4. Nicotiana tabacum stabil ekspresyon sistemi:
   1. Büyümek ve N. in vitro fidanları korumak Katı bitki kültür ortamı üzerinde tabacum (var SR1.) (4.4 g / L Murashige ve Skoog - MS - orta vitaminler, 30 g / L sükroz, pH 5.8, 7 g / L ağar, bitki dahil) 25 ° C'de klima kabini içinde kontrollü koşullar altında 16 saat / 8 saat gündüz / ni ile ° Cght rejim.
   2. A bir ön kültür Başlangıç tumefaciens EHA105 yer alır (100 ug / ml spektinomisin, 300 ug / ml streptomisin, rifampisin 50 mg / ml), uygun antibiyotik ile birlikte sıvı YEB 5 ml ortam içinde ifade vektörü pK7WG2.G65mut barındıran ve bir orbital çalkalayıcı grubu 28 ° C sıcaklıkta gece boyunca büyümeye 200 rpm'de çalkalayarak yapılır.
   3. Bakteri kültürü kadar (100 ug / ml spektinomisin, 300 ug / ml streptomisin, rifampisin 50 mg / ml) YEB ortamı artı antibiyotikler 50 ml'lik bir Agrobacterium kültürü aşılamak ve 24 saat için büyümeye ön kültür, 1 ml kullanın doymuş (OD 0,5-1,0 ₆₀₀ değeri).
   4. Bir sıvı bitki yetiştirme ortamında 50 ml 20 dakika ve tekrar süspansiyon pelet için 4000 x g'de santrifüj ile bakteriler toplanır. Tamamen antibiyotik kaldırmak için iki kez bu adımı tekrarlayın.
   5. In vitro tütün bitkilerinden ilk sağlıklı tam genişletilmiş yaprakları atın ve yaklaşık 1 cm kareler halinde doğrayın.
   6. Aktarım Yaprak parçalarıDerin Petri tabaklarına bakteri süspansiyonu içeren ve 20 dakika boyunca karanlıkta bırakın.
   7. Süspansiyon yaprak parçalarını çıkarın ve steril filtre kağıdı üzerinde kuru kurulayın.
   8. 1.0 ug / ml 6-benzilaminopurin (BAP) ve 0.1 ug / ml naftalin asetik asit (NAA) ihtiva eden bir katı madde bitki kültür ortamı üzerinde bir eksene doğru yaprak parçaları (üst yaprak yüzeyi) koyun ve kontrollü bir klima kabini içinde iki gün plakalar inkübe koşulları (25 ° C, 16 saat gün / 8 saat gece).
   9. Sıvıya temas eden alt yüzeyi (yaprağın alt yüzeyi) (1.0 ug / ml BAP, 0.1 ug / ml NAA, 500 mg / ml sefotaksim, 100 ug / ml kanamisin içeren) bir katı kültür aracı maddesi üzerine Aktarım yaprak adettir.
   10. Filiz oluşumunu başlatmak için 16 saat / 8 saat gündüz / gece rejimi ile 25 ° C 'de klima kabini içinde 2-3 hafta süreyle inkübe edin. Alt kültür 1.0 ug / ml BAP, 0.1 ug / ml NAA, 500 ihtiva eden taze bir katı bitki kültür ortamına yaprak eksplantları aktararak 2 haftadaug / ml sefotaksim ve 100 ug / ml kanamisin.
   11. Sürgünler 500 mg / ml sefotaksim ve kök oluşumunun uyarılması için 100 ug / ml kanamisin içeren katı bir kültür ortamı içeren Magenta kutularına transfer da görünür. 1-2 hafta boyunca 25 ° C 'de 16 saat gün ışığı / 8 saat gece foto süresiyle fidanları inkübe edin.
   12. Ne zaman köklerinin, sera içinde toprağa bitkiler aktarın.
   13. Her bitki için bir yaprak parçası toplayın ve bir ticari kit ile genomik DNA izole.
   14. Spesifik PCR ile transgenin varlığı algılar. Aşağıdaki transgen spesifik primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu için bir şablon olarak genomik DNA, 30 ng kullanın: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 've 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', 58 ° C'lik bir tavlama sıcaklığında ve 20 saniyelik bir uzama kez . 50 ul bir toplam hacim içinde PCR reaksiyonunu yürütmek.
   15. Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu içinde% 1 agaroz jeli (40 mM Tr üzerinde elektroforez ile 220 baz çiftlik bir ürün Analiz), 20 mM asetik asit, ve 1 mM EDTA ihtiva eder.
   16. Hedef geni ihtiva eden transgenik bitkilerin seçilmesi.
   17. Seçilen transgenik bitkinin her birinden bir yaprak parçası toplayın ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurularak.
   18. Bitki, yaprak dokusu (aşama 3.1.3) toplam protein ekstreleri hazırlayın ve daha önce en rekombinant proteini ifade eden tütün bitkisi seçmek için ² anlatıldığı gibi western blot analizi ile her bir örnek test edin.
   19. Çapraz-tozlaşma önlemek için çiçeklenme önce seçilen en iyi performans gösteren bitkinin Çanta çiçekleri.
   20. , Çiçeklenme, meyve olgunlaşma ve tohum kurutmadan sonra, torbaları toplamak.
   21. Saman ayırın tohumlar ve kontrollü sıcaklık (20-24 ° C) kuru bir odada saklayın.
   22. İkinci nesil transgenik bitkiler üretmek ve daha sonra kendi kendine tozlaşma olmak için en iyi performans gösteren bitki seçmek için kurutulmuş tohumları ekmek.
   23. Sonraki nesiller için 2.4.19-2.4.21 adımda açıklanan aynı işlemi tekrarlayın.

3. Rekombinant Protein Analizi

1. Toplam protein çıkarma:
   1. Bakteri hücreleri:
      1. Tris-tamponlu tuzlu su kültür hacminin yarısı içinde, aşama 2.1.5 tarif edildiği gibi toplanan bakteriyel hücre pelleti, yeniden süspanse edin (TBS - 2 mM Tris / HCl, 500 mM NaCI), 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) ile desteklenmiş, pH 7.4 ile yıkanır.
      2. Buz üzerinde örnek tutarken sonikasyon, yarı güçte 40 saniye süreyle hücre topağı üç kez yeniden süspanse edildi.
      3. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 14,000 x g'de santrifüj ile lizat açıklık getirmektedir.
      4. Aktarım temiz bir tüpe süpernatan ve -80 ° C 'de ayrı olarak süpernatan ve topak, hem de muhafaza edin.
      5. Kuvvetlice gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayarak 6 M üre ile desteklenmiş TBS pH 8.0 yarım hücre lizatı hacminde, pellet toplanmıştır inklüzyon cisimcikleri, çözünürleştirilir.
      6. Oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ve temiz bir supernatant toplamaktüp.
      7. -80 ° C de, her iki süpernatan ve topak saklayın.
   2. Böcek hücreleri:
      1. (- 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM _Na-2 HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, PBS), pH 7.4 fosfat tamponlu tuzlu su ile 1 ml 'si ile, aşama 2.2.12 tarif edildiği gibi toplanan enfekte edilmiş böcek hücre topağı, yıkayın.
      2. Liziz tamponu içinde 200 ul içinde süspanse hücreleri (20 mM Tris / HCl, pH 8.0, 0.5 M NaCI, 3 mM β-merkaptoetanol ve% 1 Tween-20), ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
      3. Santrifüj, 4 ° C'de 20 dakika 14,000 xg'de hücreleri çözünebilir.
      4. -80 ° C'de eriyen kesirler ve mağaza toplayın ve pelet atın.
   3. Bitki yaprağı dokusu:
      1. Öğütmek N. benthamiana veya N havan ve dibek kullanılarak sıvı azot içinde ince bir toz haline tabacum dokusudur.
      2. Ekstraksiyon tamponu 300 ul zemin dokusu, 100 mg homojenize (40 mM Hepes pH 7.9, 5 mM DTT,% 1.5 CHAPS), Özel Sayıproteaz inhibitör kokteyli 3 ul emented ve buz üzerinde eritin.
         Not: Bitki doku ağırlığı (g) ile seçilmiş oranlı hacmi (mi), 1 tampon: 3 arasındadır.
      3. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 30,000 x g'de santrifüjleyin özü.
      4. -80 ° C de bir temiz tüpe ve mağaza supernatant toplamak.
2. Coomassie jel boyama:
   1. Ekstraksiyon tamponu 10 ul son hacim olması için toplam protein ekstreleri (örneğin, bitki ekstresi 2 ul, bakteriyel ve böcek özler 5 ul), uygun bir seyreltme hazırlayın ve 3x örnek tamponu 5 ul (1.5 M Tris / HCl, pH 6.8, nihai 1x konsantrasyona kadar% 3 SDS,% 15 gliserol,% 4 β-merkaptoetanol).
   2. 10 dakika boyunca kaynatılır örnekleri.
   3. % 10 SDS-PAGE ile ayrı proteinler.
   4. Elektroforezisten sonra, yaklaşık iki dakika boyunca bir mikrodalga fırın içinde, Coomassie çözelti A (% 0.05, Brilliant Blue R-250,% 25 izopropanol,% 10 asetik asit) varlığında, ısı jelikaynama noktası kadar s.
   5. Hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığına jel soğutun.
   6. Sil Coomassie boyaması, çözelti A
   7. Coomassie B çözeltisi mevcudiyetinde ısıtma ile destain jel (% 0.05, Brilliant Blue R-250,% 25 izopropanol), C (0.002%, Brilliant Blue R-250,% 10 asetik asit), ve D (% 10 asetik asit), her zaman boyama için aynı protokol izlenerek.
   8. Arka plan ⁹ açıktır kadar çözüm D son ısıtma aşamasından sonra, jel destaining bırakın.
3. Western blot analizi:
   1. Elektroforezisten sonra, Transfer 1 saat süre ile, oda sıcaklığında PBS pH 7.4 içinde, standart teknikler ve% 4 süt bloğu kullanılarak bir nitroselüloz zar üzerine proteinleri ayrıldı.
   2. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe leke veya 1 'de, hedef proteine ​​karşı tavşan birincil antikor ihtiva eden bloklama çözeltisi oda sıcaklığında 4 saat: 10,000 ve% 0.1 Tween-20 ile takviye edilmiştir.
   3. Primer antikor etiket sonraing,% 0.1 Tween-20 ihtiva eden bloklama çözeltisi ile 5 dakika her biri için, membran 3 kez yıkayın.
   4. 1 ile turp peroksidaz (HRP) konjuge anti-tavşan antikoru ile inkübe: 10,000 saat 1.5.
   5. Yıkama membran 5 dakika PBS-T ile her biri için 5 kez farklı (PBS,% 0.1 Tween-20 ile takviye edilmiştir).
   6. Kemilüminesan peroksidaz substrat kullanılarak batı leke işleyin.
4. Radyoimüno deneyi (RIA):
   1. Reaktifler (antiserumu, izleyici ve protein A Sefaroz), oda sıcaklığı ve pipet 12 x 75 mm polistiren tüpler içine (yeniden birleştirici ticari hGAD65 bölgesinin 300-2,400 ng / ml) farklı konsantrasyonlarda protein ekstresi numuneler ve standartlar 20 ul ulaştığından emin olunuz.
   2. Antiserum 20 ul ekleyin, 01:30 Bir T1D'nin hastanın plazmaferez serum seyreltilmesi hazırladı.
   3. Izleyici (125-l-GAD65) 50 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin. Sadece toplam aktiviteyi tahmin etmek izleyici ile bir tüp ayarlayın.
   4. 50 ul ekleve protein A Sefaroz, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
   5. Soğuk PBS 1 mi, 30 dakika boyunca 4 ° C'de 1500 x g'de, her bir tüp ve santrifüj içine tampon dağıtın.
   6. Süpernatant kaldırmak ve tüp hafifçe dokunarak kurutma kağıdı üzerinde kalan sıvıyı emmek için tüpler Durusu.
   7. Ölçü bir gamma sayacında 1 dakika için sayarak tüplere radyoaktivite imüno.
   8. Günlük ölçekte arsa toplam faaliyetle ilgili kalibratörlerin bağlama oranları (B / T%), standart eğri oluşturmak ve kalibrasyon eğrisi ¹⁰ kapalı örneklerin YAB konsantrasyonunu okumak için.
      NOT: Kısıtlı alanlar, depolama, elleçleme ve radyoaktif malzemenin imhası için tasarlanmış olmalıdır.

Sonuçlar

Farklı üretim sistemlerinde bir yeniden birleştirici hedef proteinin heterolog ekspresyonu için bir deney tasarımı burada tarif edilmektedir. ilk odak Her sistemde hedef proteinin ekspresyonu için uygun koşullar kurarak farklı düzlemlerin kurulum oldu.

Hedef protein, hGAD65mut ekspresyonu, üçlü E. indüklenmiştir E. coli kültürleri. 37 ° C'de ifade 3 saat sonra, bakteri hücreleri santrifüjleme ile toplandı ve sonikasyon ile parçalanır. Bir santrif?...

Tartışmalar

Bakteriyel hücreler, Bakulovirüs / böcek hücreleri ve bitkiler: Bu çalışmada üç farklı ortam, bir rekombinant insan proteininin sentezlenmesi için karşılaştırıldı. (- MagnICON ve pK7WG2 tabanlı - ve istikrarlı, yani geçici) bitki bazlı bir platform daha üç yaygın olarak kullanılan ifade teknolojilerini istismar tarafından araştırılmıştır. Bu deneyde, hGAD65mut için seçilen hedef protein önceden farklı sistemlerde ¹³ olarak ifade edildi ve üretim ve işlevselliği ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast extract	Sigma	Y1333
Tryptone	Formedium	TRP03
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949
Sf-900 II SFM medium	Gibco	10902-088
Grace’s Insect Medium, unsupplemented	Gibco	11595-030
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	10362-100
MS medium including vitamins	Duchefa Biochemie	M0222
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Plant agar	Duchefa Biochemie	P1001
Ampicillin sodium	Duchefa Biochemie	A0104	Toxic
Gentamycin sulphate	Duchefa Biochemie	G0124	Toxic
Ganciclovir	Invitrogen	I2562-023
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin  sulfate	Duchefa Biochemie	S0148	Toxic
Spectinomycin  dihydrochloride	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside)	Sigma	I5502	Toxic
MES hydrate	Sigma	M8250
MgCl2	Biochemical	436994U
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Syringe (1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP                                                       (6-Benzylaminopurine)	Sigma	B3408	Toxic
NAA (Naphtalene acetic acid)	Duchefa Biochemie	N0903	Irritant
Cefotaxime	Mylan generics
Trizma base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
NaCl	Sigma	S3014	1 M stock
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride)	Sigma	P7626	Corrosive,  toxic
Urea	Sigma	U5378
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic
Tween-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Dithiothreitol)	Sigma	D0632	Toxic – 1 M stock, store at -20 °C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374	Toxic
Plant protease inhibitor cocktail	Sigma	P9599	Do not freeze/thaw too many times
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flammable, toxic, corrosive – 10% stock
Glycerol	Sigma	G5516
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
Isopropanol	Sigma	24137	Flammable
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67	Sigma	G5163	Do not freeze/thaw too many times
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
Sf9 Cells	Life Technologies	11496
BL21 Competent E.coli	New England Biolabs	C2530H
Protein A Sepharose	Sigma	P2545
Cell culture plates	Sigma	CLS3516
Radio Immuno Assay kit	Techno Genetics	12650805	Radioactive material