ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

Summary

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Abstract

מערכות המבוסס על צמח נחשבות פלטפורמה חשובה לייצור חלבונים רקומביננטיים כתוצאה מהפוטנציאל המתועד היטב שלהם לייצור בעלות נמוכה הגמישה, באיכות גבוהה, מוצרים ביו-אקטיביים.

במחקר זה, השווינו את הביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי יעד בתרבויות מסורתיות מבוסס פרמנטור תא (חיידקים וחרקים) עם מערכות ביטוי על בסיס צמחי, שני חולפות ויציבים.

עבור כל פלטפורמה, שתארנו את הסט-אפ, הייעול ואורכו של תהליך הייצור, איכות המוצר הסופית ותשואות והערכנו את עלויות ייצור זמניות, ספציפיות לחלבון רקומביננטי היעד שנבחר.

בסך הכל, התוצאות שלנו מצביעות על כך שחיידקים אינם מתאימים לייצור של חלבון המטרה בשל ההצטברות שלה בתוך גוף הכללה מסיס. מצד השני, מערכות המבוסס על צמח הם לא פלטפורמות רב-תכליתיותכובע מאפשר הייצור של החלבון שנבחר בעלויות נמוכות יותר מאשר baculovirus / מערכת תא חרק. בפרט, קווים מהונדסים יציבים מוצג הגבוהה ביותר התשואה של המוצר הסופי וצמחים להביע חולפים פיתוח התהליך המהיר ביותר. עם זאת, לא כל החלבונים רקומביננטי עשויים להפיק תועלת ממערכות המבוסס על צמח אבל פלטפורמת ההפקה הטובה ביותר צריכה להיקבע באופן אמפירי עם גישת מקרה ומקרה, כפי שמתוארת כאן.

Introduction

Recombinant proteins are commercially mass-produced in heterologous expression systems with the aid of emerging biotechnology tools. Key factors that have to be considered when choosing the heterologous expression system include: protein quality, functionality, process speed, yield and cost.

In the recombinant protein field, the market for pharmaceuticals is expanding rapidly and, consequently, most biopharmaceuticals produced today are recombinant. Proteins can be expressed in cell cultures of bacteria, yeasts, molds, mammals, plants and insects, as well as in plant systems (either via stable- or transient-transformation) and transgenic animals; each expression system has its inherent advantages and limitations and for each target recombinant protein the optimal production system has to be carefully evaluated.

Plant-based platforms are arising as an important alternative to traditional fermenter-based systems for safe and cost-effective recombinant protein production. Although downstream processing costs are comparable to those of microbial and mammalian cells, the lower up-front investment required for commercial production in plants and the potential economy of scale, provided by cultivation over large areas, are key advantages.

We evaluated plants as bioreactors for the expression of the 65 kDa isoform of human glutamic acid decarboxylase (hGAD65), one of the major autoantigen in Type 1 autoimmune diabetes (T1D). hGAD65 is largely adopted as a marker, both for classifying and monitoring the progression of the disease and its role in T1D prevention is currently under investigation in clinical trials. If these trials are successful, the global demand for recombinant hGAD65 will increase dramatically.

Here, we focus on the expression of the enzymatically inactive counterpart of hGAD65, hGAD65mut, a mutant generated by substituting the lysine residue that binds the cofactor PLP (pyridoxal-5'-phosphate) with an arginine residue (K396R)¹.

hGAD65mut retains its immunogenicity and, in plant and insect cells, accumulates up to ten-fold higher than hGAD65, its wild-type counterpart. It was hypothesized that the enzymatic activity of hGAD65 interferes with plant cell metabolism to such an extent that it suppresses its own synthesis, whereas hGAD65mut, the enzymatically-inactive form, can be accumulated in plant cells to higher levels.

For the expression of hGAD65mut, the use of different technologies, widely used in plant biotechnology, was explored here and compared to traditional expression platforms (Escherichia coli and Baculovirus/insect cell-based).

In this work, the recombinant platforms developed for the expression of hGAD65mut comprising traditional and plant-based systems were reviewed and compared on the basis of process speed and yield, and of final product quality and functionality.

Protocol

1. בנייה של וקטורי ביטוי

1. מערכת שיבוט רקומבינציה מסחרית:
   1. להגביר את הרצף באורך המלא של גן המטרה (hGAD65mut) עם פריימרים מתאימים המאפשרים תוספת של מהדק CACC ב5'-end של הגן כפי שתואר קודם לכן ^2.
   2. לשכפל את מוצר ההגברה מטוהר ג'ל, בהתאם למפרטי ערכת שיבוט כיוונית, בוקטור הכניסה (topoisomerase מחויב) על ידי הרכבת התגובה בהיקף כולל של 6 μl, באמצעות 1.5: הוספה טוחנת ליחס של 1: 1 ווקטור μl של תמיסת מלח (0.2 M NaCl ו0.01 MgCl _2). דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר (RT).
   3. להפוך כל התגובה לE. כימי המוסמך תאי coli על פי מפרט כיוונית ערכת שיבוט ומושבות שהתקבלו על ידי מסך המושבה PCR ^3, באמצעות M13 קדימה הפוך פריימרים כלולים בערכת השיבוט כיוונית. לבודד את הפלסמיד מpoמושבה sitive על פי מפרט פלסמיד דנ"א הכנת ערכה ורצף להוסיף באמצעות M13 קדימה ההפוך פריימרים על מנת להבטיח את היעדרן של מוטציות ^3.
   4. השתמש בשיבוט הכניסה הושג לבצע את תגובת רקומבינציה ידי Lambda recombinase Clonase השני האנזים (LR) עם וקטורי יעד ספציפיים: לביטוי חלבון רקומביננטי בתאי חיידקים עם pDEST17 (מניב pDEST17.G65mut), בצמחים (זמניים או קבועים) עם pK7WG2 (מניב pK7WG2.G65mut), בbaculovirus / מערכת תא חרק עם DNA הנגיפי לינארית (מניב Baculo.G65mut) ^4. להרכיב את התגובה, על פי מפרט ערכת clonase, עם כניסתו של וקטור 100 ng, 150 ננוגרם של וקטור יעד ו -2 μl של תערובת אנזים בנפח סופי של 10 μl. דגירה התמהיל ב RT עבור שעה 1.
   5. להפוך את המוצר לרקומבינציה E. כימי מוסמך תאי coli על פי מפרט ערכת clonase. מושבות שהושגו מסך על ידי PCR ³ שימוש לכל המושבות נגזרות תגובת הפיכת פריימר ההפוך GAD65mut הספציפי זהה (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ') ופריימרים הספציפיים הבאים וקטורי יעד קדימה: לpDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; לpK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; לוקטור לינארית Baculo: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 ".
   6. לבודד DNA פלסמיד באמצעות ערכת DNA minipreparation מסחרית ולאשר את קיומו של רצף היעד על ידי PCR ^3, תוך שימוש באותה השילובים פריימר ספציפיים שתוארו בשלב הקודם.
   7. השתמש בפלסמידים PCR החיוביים שהושגו להפוך אורגניזמים יעד שונים, בהתאם לפלטפורמה שנבחרה לביטוי חלבון רקומביננטי כמתואר בשלבים הבאים.
2. מערכת MagnICON ^5-7:
   1. לשכפל את גן המטרה בpICH31070 3'-מודול, כפי שתואר לעיל בפירוט ^7, מניב pICH31070.G65mut. השתמש בהבא מחזור תגובה ספציפי: 30 דקות דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5 דקות ב 50 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 5 דקות על 80 מעלות צלזיוס.

2. ביטוי חלבון רקומביננטי

1. מערכת תא חיידק:
   1. להפוך pDEST17.G65mut לE. coli BL21 (DE3) תאי electrocompetent תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית ומסך המושבות גדלו על המכיל אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) LB-בינוני, על ידי המושבה PCR באמצעות פריימרים transgene הספציפי הבא: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'ו 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ", עם טמפרטורת חישול של 58 מעלות צלזיוס וזמן התארכות של 20 שניות. לבצע את תגובת PCR בהיקף כולל של 20 μl לאחר המסת תאי חיידקים עם קצה פלסטיק בצינור.
   2. לחסן מושבה אחת הלילה בשעה 37 ° C ב 3 מיליליטר של (100 מיקרוגרם / מיליליטר) המכיל אמפיצילין LB-בינוני.
   3. לדלל את תרבות חיידקי 1: 100 ב 100 מיליליטר של מדיום LB הטרי (ampicill כוללב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-6 שעות עד OD סופי ₆₀₀ של 0.8.
   4. לגרום לביטוי חלבון רקומביננטי על ידי תוספת של isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) בריכוז סופי של 1 מ"מ ודגירת תרבות עם נמרץ רעד במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
   5. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 20 דקות ולהשתמש בגלולת חיידקים להפקת חלבון (שלב 3.1.1.1).
2. מערכת / תא חרק baculovirus:
   1. זרע תאי frugiperda Spodoptera (SF9) ל6-גם צלחות (8 x 10 ⁵ תאים לכל טוב) ולשטוף פעמיים עם 2 מיליליטר של אי-השלים החרקים בינוניים של גרייס.
   2. להסיר ולהחליף את מדיום ירידה מבחינת עם תערובת transfection (תגובת רקומביננטי LR 5 μl, פתרון Celfectin 6 μl ו -200 μl שאינה בתוספת החרקים בינוני של גרייס).
   3. דגירה צלחות על 27 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות.
   4. להסיר ולהחליף תערובת transfection עם 2 מיליליטר של SF-9 הטרי00 בינוניים, בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin ו -100 מיקרומטר Ganciclovir כדי לבחור שיבוטים baculovirus רקומביננטי.
   5. לאחר הדגירה של 96 שעות ב 27 ° C, לאסוף בינונית (מניית ויראלי V1), צנטריפוגות ב 4000 XG כדי להסיר תאים ופסולת גדולה וחנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס.
   6. זרעים 1 x 10 ⁶ תאים לכל גם בSF9 2.5 מיליליטר SF-900 בינוני מכיל 10% בסרום שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin ו -100 מיקרומטר Ganciclovir ולהדביק עם מלאי V1 100 μl היטב בכל.
   7. דגירה תאים במשך 3 ימים ב 27 מעלות צלזיוס.
   8. לאסוף ובינוני צנטריפוגות ב 4000 x גרם.
   9. אחסן את supernatant (המניות גבוהה כייל V2) בשעה 4 ° C.
   10. זרעים 1 x 10 ⁶ תאים לכל גם בSF9 2.5 מיליליטר SF-900 בינוני מכיל 10% בסרום שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin ו -100 מיקרומטר Ganciclovir ולהדביק עם 25 μl של מניית V2 בכל היטב.
   11. דגירה תאים במשך 3 ימים ב 27 מעלות צלזיוס.
   12. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG ולהשתמש תא גלולה חרקים להפקת חלבון (שלב 3.1.2. 1).
3. מערכות ביטוי חולף Nicotiana benthamiana:
   1. לגדול נ ' צמחי benthamiana בחממה, תחת אור הטבעי בתוך C ° טווח טמפרטורות 18-23. לagroinfection להשתמש בצמחים 4-5 בן שבוע.
   2. שמור צמחי agroinfected בתא אקלים על 22 מעלות צלזיוס עם / 11 יום photoperiod לילה hr 13 שעות.
   3. מערכת שיבוט רקומבינציה מסחרית:
      1. להציג pK7WG2.G65mut בAgrobacterium tumefaciens מתח EHA105 תאי electrocompetent כפי שתואר בעבר ⁸ ומסך המושבות, גדלו על ריפאמפיצין LB בינוני המכיל (50 מיקרוגרם / מיליליטר), סטרפטומיצין (300 מיקרוגרם / מיליליטר) וspectinomycin (100 מיקרוגרם / מיליליטר) לאחר 2 ימים של דגירה על 28 מעלות צלזיוס, במושבת PCR ⁸ באמצעות פריימרים transgene הספציפי הבאים: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; ו5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ", עם טמפרטורת חישול של 58 מעלות צלזיוס וזמן התארכות של 50 שניות. לבצע את תגובת PCR בהיקף כולל של 20 μl.
      2. לחסן חיידקים ב -30 מיליליטר של ריפאמפיצין LB ​​בינוני המכיל (50 מיקרוגרם / מיליליטר), סטרפטומיצין (300 מיקרוגרם / מיליליטר) וspectinomycin (100 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך יומיים על 28 מעלות צלזיוס.
      3. לאסוף חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 20 דקות גלולה וגלול ב 10 מיליליטר של חיץ חדירה (10 MES מ"מ, 10 מ"מ MgCl _2, 100 acetosyringone מיקרומטר, pH 5.6). מדוד את ערך OD ₆₀₀ ולאחר מכן להתאים אותו ל -0.9 על ידי דילול באותו המאגר.
         הערה: הנפח הכולל דרוש לחדירת שלושה נ ' צמחי benthamiana הוא 30 מיליליטר.
      4. השתמש במזרק 2.5 מיליליטר ללא מחטים לחדור ההשעיה Agrobacterium בנ benthamiana משאיר. לאט ובזהירות להזריק לוחות עלה עם ההשעיה מהמזרק. לחדור שלושה l מורחבמרזבים לכל צמח ולהשתמש בשלושה צמחים כtriplicates.
         הערה: מטעמי בריאות ובטיחות משקפי מגן במהלך תהליך חדירה.
      5. לאסוף עלים 2 ימים לאחר פגיעת agroinfiltrated (dpi) והקפאה בחנקן נוזלי. רקמות צמח חנות ב -80 ° C.
   4. מערכת MagnICON:
      1. להציג וקטורי MagnICON - "מודול (pICH20111), 3 '5 מודול (pICH31070.G65mut), ואת מודול אינטגראז (pICH14011) - בא tumefaciens מתח GV3101 תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית. מסך המושבות, גדלו על מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר ריפאמפיצין ואנטיביוטיקה מתאימה וקטור ספציפי (50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin לpICH20111 וpICH14011, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin לpICH31070), על ידי המושבה PCR באמצעות פריימרים ספציפיים עבור כל וקטור.
      2. לחסן בנפרד א שלוש tumefaciens הזנים ב 5 מיליליטר של מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר ריפאמפיצין ואנטיביוטיקת וקטור ספציפי מתאימהולנער לילה בשעה 28 ° C.
      3. תרבויות גלולה לילה חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 20 דקות ו resuspend אותם בשני כרכים של תרבות חיידקים הראשונית של 10 מ"מ MES (pH 5.5) ו -10 מ"מ ₄ MgSO.
      4. לערבב כמויות שווה של השעיות חיידקים המכילות את שלושת וקטורים ולהשתמש בתערובת ההשעיה לחדירת מזרק של נ ' benthamiana משאיר. לחדור שלושה עלים מורחבים לכל צמח.
      5. לאסוף עלים agroinfiltrated ב 4 dpi ולהקפיא בחנקן נוזלי.
      6. רקמות צמח חנות ב -80 ° C.
4. מערכת ביטוי יציב טבק:
   1. לגדול ולשמור במבחנה שתילים של נ ' tabacum (var SR1.) על מדיום תרבות צמח מוצק (4.4 g / L Murashige וSkoog - MS - בינוני כולל ויטמינים, 30 גר '/ סוכרוז L, pH 5.8, 7 גרם / אגר מפעל L) בתנאים מבוקרים בתא האקלים ב 25 מעלות צלזיוס עם 16 שעות יום / 8 שעות / נימשטר להילחם.
   2. התחל מראש תרבות של א ' tumefaciens EHA105 מחסה pK7WG2.G65mut וקטור הביטוי ב 5 מיליליטר של מדיום ייב נוזלי עם אנטיביוטיקה מתאימה (ריפאמפיצין 50 מיקרוגרם / מיליליטר, סטרפטומיצין 300 מיקרוגרם / מיליליטר, spectinomycin 100 מיקרוגרם / מיליליטר) ולגדול לילה בשעה 28 ° C בסט שייקר מסלולית ב 200 סל"ד.
   3. השתמש 1 מיליליטר של טרום-התרבות לחסן תרבות 50 מיליליטר Agrobacterium במדיום ייב בתוספת אנטיביוטיקה (ריפאמפיצין 50 מיקרוגרם / מיליליטר, סטרפטומיצין 300 מיקרוגרם / מיליליטר, spectinomycin 100 מיקרוגרם / מיליליטר) ולגדול למשך 24 שעות, עד שתרבות החיידקים היא הרווי (OD ₆₀₀ ערך של 0.5-1.0).
   4. לאסוף חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 20 דקות גלולה וגלול ב 50 מיליליטר של מדיום תרבות צמח נוזלי. חזור על פעולה זו פעמיים כדי להסיר לחלוטין אנטיביוטיקה.
   5. קח עלים הרחיבו באופן מלא בריאים הראשונים במבחנת צמחי טבק ולחתוך אותם לריבועים כ 1 סנטימטר.
   6. חתיכות העברת עלהלצלחות פטרי עמוקות המכיל השעיה חיידקים ולהשאיר בחושך במשך 20 דקות.
   7. הסר פיסות עלים מהשעיה ולמחוק יבש על נייר סינון סטרילי.
   8. להניח את חלקי דף עם צד adaxial (פני עלה עליון) על מדיום תרבות צמח מוצק המכילים 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר 6-benzylaminopurine (BAP) ו -0.1 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אצטית נפטלין (NAA) ודגירת צלחות במשך יומיים בתא אקלים מבוקר ב תנאים (25 ° C, / 8 שעות בלילה יום 16 שעות).
   9. חתיכות העברת עלה על מדיום תרבות המוצק (לרבות 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר BAP, 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר NAA, 500 מיקרוגרם / מיליליטר cefotaxime, 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin) עם משטח abaxial (משטח תחתון של עלה) במגע עם מדיום.
   10. דגירה צלחות במשך 2-3 שבועות בתא האקלים של 25 מעלות צלזיוס עם משטר היום / לילה / 8 שעות 16 שעות כדי לגרום להיווצרות לירות. תת-תרבות כל 2 שבועות על ידי העברת explants עלה למדיום תרבות צמח המוצק טרי המכילה 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר BAP, 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר NAA, 500מיקרוגרם / מיליליטר וcefotaxime 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin.
   11. כאשר יורה מופיע להעביר אותם לתיבות מגנטה המכילות מדיום תרבות מוצק כולל 500 מיקרוגרם / מיליליטר וcefotaxime 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin לגרום להיווצרות שורש. דגירה שתילים עם photoperiod לילה hr / 8 יום 16 שעות של 25 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות.
   12. כאשר צורת שורשים, להעביר את הצמחים לאדמה בחממה.
   13. לאסוף חתיכת עלה לכל מפעל ולבודד DNA הגנומי עם ערכה מסחרית.
   14. לזהות הנוכחות של transgene על ידי PCR הספציפי. השתמש 30 ng של DNA גנומי כתבנית להגברת PCR באמצעות פריימרים transgene הספציפי הבא: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'ו5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ", עם טמפרטורת חישול של 58 מעלות צלזיוס וזמן התארכות של 20 שניות . לבצע את תגובת PCR בהיקף כולל של 50 μl.
   15. נתח את מוצר 220 נ"ב על ידי אלקטרופורזה על 1% ג'ל agarose בטריס-אצטט EDTA חיץ (טה) (40 מ"מ Trהוא, חומצה אצטית 20 מ"מ, ו1 mM EDTA).
   16. בחר צמחים מהונדסים המכילים את גן המטרה.
   17. לאסוף חתיכת עלה מכל אחד מהצמחים מהונדסים שנבחרו ולהקפיא בחנקן נוזלי באופן מיידי.
   18. הכן תמציות חלבון הכוללת מרקמת עלה צמח (שלב 3.1.3) ולבדוק כל דגימה על ידי ניתוח כתם מערבי כפי שתואר לעיל ² כדי לבחור את צמח הטבק להביע הטוב ביותר חלבון רקומביננטי.
   19. פרחי שקית של צמח הביצועים הטוב ביותר שנבחר לפני פורח כדי למנוע הפריה הדדית.
   20. לאחר הפריחה, הבשלת פרי וייבוש זרעים, לאסוף שקיות.
   21. זרעים נפרדים מן התבן ולאחסן אותם בחדר יבש בטמפרטורה מבוקרת (20-24 מעלות צלזיוס).
   22. לזרוע את הזרעים המיובשים לייצר צמחים מהונדסים דור השני ולאחר מכן לבחור את צמח הביצועים הטוב ביותר להיות האבקה עצמית.
   23. חזור על אותו התהליך מתואר בצעדי 2.4.19-2.4.21 לדורות הבאים.

3. ניתוח ביטוי חלבון רקומביננטי

1. הפקת חלבון כולל:
   1. תאי חיידקים:
      1. Resuspend גלולה תא החיידק, שנאספו כמתואר בשלב 2.1.5, במחצית נפח התרבות של נאגר מלוח טריס (TBS - 2 מ"מ טריס / HCl, 500 מ"מ NaCl) pH 7.4 בתוספת phenylmethanesulfonylfluoride 1 מ"מ (PMSF).
      2. Sonicate resuspended תא גלולה שלוש פעמים במשך 40 שניות במחצית כוח, תוך שמירה על מדגם על קרח.
      3. להבהיר lysate ידי צנטריפוגה XG ב 14,000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      4. העברת supernatant לצינור נקי ולאחסן supernatant וגלול בנפרד ב -80 ° C.
      5. Solubilize גופי ההכללה, שנאספו בגלולה, במחצית lysate הסלולרי נפח של pH 8.0 TBS בתוספת 6 M אוריאה על ידי נמרץ רועד הלילה בטמפרטורת חדר.
      6. צנטריפוגה XG ב 10,000 במשך 25 דקות בטמפרטורת חדר ולאסוף supernatant בנקיצינור.
      7. לאחסן supernatant וגלול ב -80 ° C.
   2. תאי חרקים:
      1. לשטוף גלולה נגועה חרקים תא, שנאסף כמתואר בשלב 2.2.12, עם 1 מיליליטר של בופר פוספט (PBS - 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na _{2 4} HPO, 1.8 מ"מ KH ₂ PO ₄₎ pH 7.4.
      2. תאי Resuspend ב -200 μl של חיץ תמוגה (20 מ"מ טריס / HCl pH 8.0, 0.5 M NaCl, 3 מ"מ β-mercaptoethanol ו -1% Tween-20) ולדגור על קרח למשך 30 דקות.
      3. צנטריפוגה solubilized תאים 14,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      4. לאסוף שברים וחנות מסיסים ב -80 ° C וזורקים את הכדור.
   3. רקמת עלה צמח:
      1. נ 'Grind benthamiana או נ ' רקמת tabacum לאבקה דקה בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי.
      2. Homogenize של רקמת קרקע 100 מ"ג ב 300 μl של חיץ חילוץ (40 מ"מ Hepes pH 7.9, 5 מ"מ DTT, בחורים 1.5%), supplemented עם 3 μl של מעכבי פרוטאז קוקטייל ולהפשיר על קרח.
         הערה: היחס בין המשקל נבחר רקמות צמח (ז) למאגר נפח (מיליליטר) הוא 1: 3.
      3. תמצית צנטריפוגות ב 30,000 XG במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      4. איסוף supernatant בצינור נקי ולאחסן ב -80 ° C.
2. צביעת ג'ל Coomassie:
   1. הכן דילול מתאים של תמציות חלבון כוללת (לדוגמא, 2 μl של תמצית צמח, 5 μl של תמציות חיידקים וחרקים) לנפח סופי של 10 μl של חיץ חילוץ ולהוסיף 5 μl של חיץ מדגם 3x (1.5 מ 'טריס / HCl pH 6.8, 3% SDS, גליצרול 15%, 4% β-mercaptoethanol) לריכוז 1x סופי.
   2. דגימות רתיחה במשך 10 דקות.
   3. חלבונים נפרדים על ידי 10% SDS-PAGE.
   4. לאחר אלקטרופורזה, ג'ל חום בנוכחות פתרון Coomassie (הכחול R-250 0.05% מבריקים, isopropanol 25%, 10% חומצה אצטית) במיקרוגל במשך כשתי דקותים עד לנקודת רתיחה.
   5. להתקרר לטמפרטורת חדר ג'ל עם רעד עדין.
   6. א פתרון מכתים בטל Coomassie
   7. ג'ל destain על ידי חימום בנוכחות הפתרון B Coomassie (הכחול R-250 0.05% מבריקים, isopropanol 25%), C (הכחול R-250 0.002% מבריקים, 10% חומצה אצטית) ו- D (10% חומצה אצטית) בכל פעם הבא באותו הפרוטוקול מכתים.
   8. לאחר שלב החימום האחרון עם הפתרון D, לעזוב destaining ג'ל עד הרקע ברור ^9.
3. ניתוח כתם מערבי:
   1. לאחר אלקטרופורזה, העברה מופרדת חלבונים על קרום nitrocellulose תוך שימוש בטכניקות ובלוקים עם 4% חלב סטנדרטיים בPBS pH 7.4 בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
   2. דגירה כתם הלילה ב 4 ° C או ל4 שעות בטמפרטורת חדר בפתרון החסימה המכיל נוגדן ראשוני ארנב שהועלה נגד חלבון המטרה ב1: 10,000 והשלים עם Tween-20 0.1%.
   3. לאחר תווית נוגדן ראשוניתing, לשטוף את הממברנה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם פתרון חסימה המכיל 0.1% Tween-20.
   4. דגירה עם peroxidase חזרת (HRP) נוגדן נגד ארנב -conjugate ב1: 10,000 תמורת 1.5 שעות.
   5. קרום לשטוף 5 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם PBS-T (PBS בתוספת 20-Tween 0.1%).
   6. לעבד כתם מערבי באמצעות מצע peroxidase chemiluminescent.
4. assay Radioimmuno (RIA):
   1. לאפשר אספקת מים (antiserum, נותב וחלבון Sepharose) כדי להגיע לטמפרטורת חדר וpipet 20 μl של דגימות חלבון תמצית וסטנדרטים בריכוזים שונים (מ300-2,400 ng / ml של hGAD65 המסחרי רקומביננטי) לתוך צינורות פוליסטירן 12 x 75 מ"מ.
   2. הוסף 20 μl של antiserum, מוכן לדלל 1:30 הסרום מplasmapheresis של מטופל T1D.
   3. הוסף 50 μl של נותב (125-I-GAD65) ודגירה של 2 שעות בטמפרטורת חדר. הגדר צינור עם נותב רק להעריך את הפעילות הכוללת.
   4. הוסף 50 μlחלבון Sepharose דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
   5. לוותר על 1 מיליליטר של PBS הקר חיץ לתוך צינור אחד וצנטריפוגות ב 1500 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   6. למזוג את הצינורות כדי להסיר supernatant ולספוג נוזל שיורית על נייר סופג בעדינות על ידי הקשה על צינור.
   7. מדד immunoprecipitated רדיואקטיביות בכל הצינורות על ידי ספירת דקות 1 בgamma-counter.
   8. עלילה בקנה מידת יומן השיעורים המחייבים (B / T%) של כייל הקשורים לפעילות כוללת, להקים את העקומה סטנדרטית, ולקרוא ריכוז GAD של דגימות מהעקומות כיול ^10.
      הערה: אזורים מוגבלים צריכים להיות מתוכננים לאחסון, טיפול וסילוק של חומר רדיואקטיבי.

תוצאות

עיצוב ניסיוני לביטוי Heterologous של חלבון רקומביננטי יעד במערכות ייצור שונים מתואר כאן. המוקד הראשון היה ההגדרה של הפלטפורמות השונות על ידי הקמת התנאים אופטימליים לביטוי של חלבון המטרה בכל מערכת.

הביטוי של חלבון המטרה, hGAD65mut, היה מושר...

Discussion

במחקר זה שלוש פלטפורמות שונות הושוו לביטוי של חלבון אנושי רקומביננטי: תאי חיידקים, תאי baculovirus / חרקים וצמחים. הפלטפורמה הבוסס על הצמחים שנחקרה עוד יותר על ידי ניצול שלוש טכנולוגיות בשימוש נרחבת ביטוי (כלומר, חולף - MagnICON וpK7WG2 מבוססת - ויציב). חלבון המטרה שנבחר לניסו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast extract	Sigma	Y1333
Tryptone	Formedium	TRP03
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949
Sf-900 II SFM medium	Gibco	10902-088
Grace’s Insect Medium, unsupplemented	Gibco	11595-030
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	10362-100
MS medium including vitamins	Duchefa Biochemie	M0222
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Plant agar	Duchefa Biochemie	P1001
Ampicillin sodium	Duchefa Biochemie	A0104	Toxic
Gentamycin sulphate	Duchefa Biochemie	G0124	Toxic
Ganciclovir	Invitrogen	I2562-023
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin sulfate	Duchefa Biochemie	S0148	Toxic
Spectinomycin dihydrochloride	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside)	Sigma	I5502	Toxic
MES hydrate	Sigma	M8250
MgCl2	Biochemical	436994U
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Syringe (1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-Benzylaminopurine)	Sigma	B3408	Toxic
NAA (Naphtalene acetic acid)	Duchefa Biochemie	N0903	Irritant
Cefotaxime	Mylan Generics
Trizma base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
NaCl	Sigma	S3014	1 M stock
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride)	Sigma	P7626	Corrosive, toxic
Urea	Sigma	U5378
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic
Tween-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Dithiothreitol)	Sigma	D0632	Toxic – 1 M stock, store at -20 °C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374	Toxic
Plant protease inhibitor cocktail	Sigma	P9599	Do not freeze/thaw too many times
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flammable, toxic, corrosive – 10% stock
Glycerol	Sigma	G5516
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
Isopropanol	Sigma	24137	Flammable
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67	Sigma	G5163	Do not freeze/thaw too many times
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
Sf9 Cells	Life Technologies	11496
BL21 Competent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Protein A Sepharose	Sigma	P2545
Cell culture plates	Sigma	CLS3516
Radio Immuno Assay kit	Techno Genetics	12650805	Radioactive material