JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Аннотация

Системы на основе растений, которые считаются важной платформой для получения рекомбинантных белков в результате их хорошо документированный потенциала для производства гибкой и недорогой качественной, биологически активных продуктов.

В этом исследовании мы сравнили экспрессию целевого рекомбинантного белка в традиционных ферментере на основе клеточных культур (бактериальных и насекомых) с системами экспрессии на основе растений, как переходных и стабильных.

Для каждой платформы мы описали создание, оптимизацию и длительность процесса производства, качество конечного продукта и урожайности и мы оценили предварительные производственные затраты, определенные для рекомбинантного белка выбранной цели.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что бактерии являются непригодными для производства белка-мишени из-за его накопление в нерастворимых телец включения. С другой стороны, системы на основе растительных универсальные платформы тшлем позволяют производить выбранного белка при более низких затратах, чем-бакуловируса / системы клеток насекомых. В частности, стабильные линии трансгенных отображается самый высокий-выход конечного продукта и переходные выражающие растения быстро процесс развития. Однако, не все рекомбинантные белки могут извлечь выгоду из растительных систем на основе, но лучшая продукция платформа должна быть определена эмпирически случая к случаю подход, как описано здесь.

Введение

Recombinant proteins are commercially mass-produced in heterologous expression systems with the aid of emerging biotechnology tools. Key factors that have to be considered when choosing the heterologous expression system include: protein quality, functionality, process speed, yield and cost.

In the recombinant protein field, the market for pharmaceuticals is expanding rapidly and, consequently, most biopharmaceuticals produced today are recombinant. Proteins can be expressed in cell cultures of bacteria, yeasts, molds, mammals, plants and insects, as well as in plant systems (either via stable- or transient-transformation) and transgenic animals; each expression system has its inherent advantages and limitations and for each target recombinant protein the optimal production system has to be carefully evaluated.

Plant-based platforms are arising as an important alternative to traditional fermenter-based systems for safe and cost-effective recombinant protein production. Although downstream processing costs are comparable to those of microbial and mammalian cells, the lower up-front investment required for commercial production in plants and the potential economy of scale, provided by cultivation over large areas, are key advantages.

We evaluated plants as bioreactors for the expression of the 65 kDa isoform of human glutamic acid decarboxylase (hGAD65), one of the major autoantigen in Type 1 autoimmune diabetes (T1D). hGAD65 is largely adopted as a marker, both for classifying and monitoring the progression of the disease and its role in T1D prevention is currently under investigation in clinical trials. If these trials are successful, the global demand for recombinant hGAD65 will increase dramatically.

Here, we focus on the expression of the enzymatically inactive counterpart of hGAD65, hGAD65mut, a mutant generated by substituting the lysine residue that binds the cofactor PLP (pyridoxal-5'-phosphate) with an arginine residue (K396R)1.

hGAD65mut retains its immunogenicity and, in plant and insect cells, accumulates up to ten-fold higher than hGAD65, its wild-type counterpart. It was hypothesized that the enzymatic activity of hGAD65 interferes with plant cell metabolism to such an extent that it suppresses its own synthesis, whereas hGAD65mut, the enzymatically-inactive form, can be accumulated in plant cells to higher levels.

For the expression of hGAD65mut, the use of different technologies, widely used in plant biotechnology, was explored here and compared to traditional expression platforms (Escherichia coli and Baculovirus/insect cell-based).

In this work, the recombinant platforms developed for the expression of hGAD65mut comprising traditional and plant-based systems were reviewed and compared on the basis of process speed and yield, and of final product quality and functionality.

протокол

1. Конструирование векторов экспрессии,

  1. Коммерческая система рекомбинации клонирование:
    1. Амплификации последовательности полной длины гена-мишени (hGAD65mut) с соответствующими праймерами позволяет добавление CACC зажима на 5'-конце гена, как описано выше 2.
    2. Клон гель-очистке продукта амплификации, в зависимости от направления характеристики набора для клонирования в векторе ввода (топоизомеразы связан), собирая реакцию в общем объеме 6 мкл, с использованием 1,5 в: 1 мольное отношение вставки: вектор и 1 мкл солевой раствор (0,2 М NaCl и 0,01 MgCl 2). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
    3. Преобразование всей реакции в химически компетентную E. палочки клетки в соответствии с характеристиками направленности Cloning Kit и экраном, полученных колоний ПЦР колоний 3, с использованием M13 прямого и обратного праймеров, включенных в набор направленного клонировани. Изолировать плазмиды из роsitive колония в соответствии с плазмиды препарата ДНК спецификации комплекта и последовательность вставки диска с помощью M13 прямого и обратного праймеров, чтобы гарантировать отсутствие мутаций 3.
    4. С помощью полученного клона входа проводить реакцию рекомбинации с помощью лямбда рекомбиназу Clonase II фермента (LR) с конкретными векторами назначения: для экспрессии рекомбинантного белка в бактериальных клетках с получением pDEST17 (pDEST17.G65mut), в растениях (временной или стабильной) с pK7WG2 (уступая pK7WG2.G65mut), в Baculovirus / системы клеток насекомых с линеаризованной вирусной ДНК (уступая Baculo.G65mut) 4. Сборка реакции, в соответствии с техническими Clonase комплект, со 100 нг векторной записи, 150 нг вектора назначения и 2 мкл ферментной смеси в конечном объеме 10 мкл. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 1 часа.
    5. Преобразование рекомбинации продукт в химически компетентную E. палочки клетки в соответствии с Clonase спецификации комплекта. Экран полученные колонии с помощью ПЦР 3 с использованием всех реакционных преобразование полученных колоний и тот же обратный GAD65mut-специфический праймер (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 '), и следующие конкретные векторы назначения праймеры: для pDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; Для pK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; для Baculo линеаризованной вектора: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 ».
    6. Изолировать плазмидной ДНК с использованием набора коммерческой minipreparation ДНК и подтвердить наличие последовательности-мишени с помощью ПЦР 3, с использованием тех же конкретных комбинаций праймеров, описанных в предыдущем шаге.
    7. С помощью полученных ПЦР-позитивные плазмиды для трансформации различных целевых организмов, в зависимости от платформы, выбранной для экспрессии рекомбинантного белка, как описано в следующих шагах.
  2. Система MagnICON 5-7:
    1. Клонирование гена-мишени в 3'-модуля pICH31070, как ранее описано подробно 7, с получением pICH31070.G65mut. ИспользуйтеСледующие конкретные реакционного цикла: 30 мин инкубации при 37 ° С, 5 мин при 50 ° С, а затем 5 мин при 80 ° С.

2. рекомбинантный белок экспрессия

  1. Бактериальный клеточная система:
    1. Преобразование pDEST17.G65mut в E. палочка BL21 (DE3) Электрокомпетентные клетки с использованием стандартных методов и экран колоний, выращенных на ампициллин-содержащие (100 мкг / мл) LB-среды, от ПЦР колоний с использованием следующих трансгенных-специфических праймеров: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'и 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', при температуре отжига 58 & deg; С и ​​времени элонгации 20 сек. Проведение реакции ПЦР в общем объеме 20 мкл после растворения бактериальных клеток с пластмассовым наконечником в трубке.
    2. Посев одну колонию в течение ночи при 37 ° С в 3 мл ампициллина, содержащего (100 мкг / мл) LB-среде.
    3. Развести бактериальной культуры 1: 100 в 100 мл свежего LB среды (в том числе ampicillв) и не инкубировать при 37 ° С в течение 1-6 ч до конечной OD 600 0,8.
    4. Индуцируют экспрессию рекомбинантного белка путем добавлени isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) в конечной концентрации 1 мМ и инкубируют культуры при интенсивном встр хивании в течение 3 ч при 37 ° С.
    5. Собирают клетки центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и использовать бактериальный осадок для экстракции белка (шаг 3.1.1.1).
  2. Baculovirus система / клетка насекомого:
    1. Семенной Spodoptera frugiperda (Sf9) клеток в 6-луночных планшетах (8 х 10 5 клеток на лунку) и дважды промывали 2 мл, не дополненной Грейс насекомых среды.
    2. Снять и заменить среднего по каплям трансфекции смеси (5 мкл LR рекомбинантного реакции, 6 мкл раствора Celfectin и 200 мкл без дополненной Грейс насекомых среды).
    3. Планшеты инкубируют при 27 ° С в течение 5 часов.
    4. Снять и заменить трансфекции смесь с 2 мл свежей SF-900 средних, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл гентамицина и 100 мкМ ганцикловир, чтобы выбрать рекомбинантных клонов бакуловирус.
    5. После инкубации в течение 96 ч при 27 ° С, собирать среды (V1 вирусный штамм), центрифуги в 4000 мкг, для удаления клеток и крупного мусора и в магазине в темноте при 4 ° С.
    6. Семена 1 × 10 6 Sf9 клеток на лунку в 2,5 мл Sf-900, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл гентамицина и 100 мкМ ганцикловир и заражают 100 мкл V1 наличии в каждую лунку.
    7. Инкубируйте клетки в течение 3 дней при 27 ° С.
    8. Сбор и центрифуги среда в 4000g в.
    9. Храните супернатант (V2 с высоким титром акций) при 4 ° С.
    10. Семена 1 × 10 6 Sf9 клеток на лунку в 2,5 мл Sf-900, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл гентамицина и 100 мкМ ганцикловир и заражают 25 мкл V2 наличии в каждую лунку.
    11. Инкубируйте клетки в течение 3 дней при 27 ° С.
    12. Сбор клеток от центрифуге при 4000 мкг в и использовать осадок клеток насекомых для извлечения белка (шаг 3.1.2. 1).
  3. Nicotiana benthamiana временной экспрессии системы:
    1. Расти Н. benthamiana растения в теплице, при естественном свете в диапазоне температур 18-23 ° C. Для agroinfection использовать 4-5-недельных растений.
    2. Держите agroinfected растения в климатической камере при 22 ° С с 13 ч дня / 11 ч ночь светового дня.
    3. Коммерческая система рекомбинации клонирование:
      1. Представьте pK7WG2.G65mut в Agrobacterium tumefaciens штамма EHA105 Электрокомпетентные клетки, как описано выше, и экран 8 колоний, выращенных на LB среде, содержащей рифампицин (50 мкг / мл), стрептомицина (300 мкг / мл) и спектиномицином (100 мкг / мл) после того, как две дней инкубации при 28 ° С, ПЦР колоний 8 с использованием следующих трансгенных-специфических праймеров: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; и 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', при температуре отжига 58 & deg; С и ​​времени элонгации 50 сек. Проведение реакции ПЦР в общем объеме 20 мкл.
      2. Посев бактерий в 30 мл LB среды, содержащей рифампицин (50 мкг / мл), стрептомицина (300 мкг / мл) и спектиномицином (100 мкг / мл) в течение двух дней при 28 ° С.
      3. Сбор бактерий центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют осадок в 10 мл инфильтрации буфера (10 мМ MES, 10 мМ MgCl 2, 100 мкМ ацетосирингона, рН 5,6). Измерить значение OD 600, а затем отрегулировать его в 0,9 путем разбавления в том же буфере.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем необходим для проникновения в три N. benthamiana растения составляет 30 мл.
      4. Используйте 2,5 мл безыгольного шприца проникнуть в Agrobacterium суспензии в N. benthamiana уходит. Осторожно и медленно вводят листа панели с суспензией из шприца. Проникнуть три расширенный лкарнизы на заводе и использовать три растения, как трижды.
        Примечание: В целях охраны здоровья и безопасности надевайте защитные очки во время процесса инфильтрации.
      5. Сбор агроинфильтрации листья 2 дня после заражения (точек на дюйм) и замораживание в жидком азоте. Магазин тканей растений при -80 ° С.
    4. MagnICON система:
      1. Введем MagnICON векторы - 'модуль (pICH20111), 3' 5 модуль (pICH31070.G65mut), а модуль интегразу (pICH14011) - в А. tumefaciens GV3101 напряжение с помощью стандартных методик. Экран колоний, выращенных на LB среде, содержащей 50 мкг / мл рифампицина и соответствующего вектора конкретного антибиотика (50 мкг / мл карбенициллина для pICH20111 и pICH14011, 50 мкг / мл канамицина для pICH31070), ПЦР колоний с использованием специфических праймеров для каждого вектора.
      2. Привить отдельно три А. tumefaciens штаммы в 5 мл LB среды, содержащей 50 мкг / мл рифампицина и соответствующий вектор конкретным антибиотики встряхивали в течение ночи при 28 ° С.
      3. Гранул ночной бактериальной культуры центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют их в двух объемах исходного бактериальной культуры из 10 мМ MES (рН 5,5) и 10 мМ MgSO 4.
      4. Смешайте равные объемы бактериальной суспензии, содержащие три вектора и использовать для подвешивания смесь для шприца инфильтрации N. benthamiana уходит. Проникнуть три расширенные листья с растения.
      5. Сбор агроинфильтрации листья на 4 точек на дюйм и заморозить в жидком азоте.
      6. Магазин тканей растений при -80 ° С.
  4. Табак обыкновенный система стабильная экспрессия:
    1. Вырастить и сохранить ростки в пробирке N. аЬасит (вар Sr1.) на твердой питательной среде растений (4,4 г / л Мурасиге и Скуга - МС - средний в том числе витаминов, 30 г / л сахарозы, рН 5,8, 7 г / л агара) растений в контролируемых условиях в климатической камере при 25 ° С 16 ч / 8 ч день / Niнравом режим.
    2. Начать подготовительный культуры А. tumefaciens EHA105, несущие вектор экспрессии pK7WG2.G65mut в 5 мл жидкого YEB среде с соответствующими антибиотиками (рифампицин 50 мкг / мл, стрептомицин 300 мкг / мл, спектиномицин 100 мкг / мл) и расти в течение ночи при 28 ° С в орбитальном шейкере набора при 200 оборотах в минуту.
    3. Использование 1 мл предварительной культуры для инокуляции культуры 50 мл Agrobacterium в Yeb среде плюс антибиотики (рифампицин 50 мкг / мл, стрептомицин 300 мкг / мл, спектиномицин 100 мкг / мл) и расти в течение 24 ч, до тех пор, бактериальная культура не является насыщенный (OD 600 Значение 0,5-1,0).
    4. Сбор бактерий центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют осадок в 50 мл жидкой культуральной среды растений. Повторите этот шаг дважды, чтобы полностью удалить антибиотики.
    5. Взять первые здоровых Полностью укомплектованная листья с в пробирке растений табака и порежьте их на примерно 1 см квадраты.
    6. Передача кусочки листьевв глубоких чашках Петри, содержащие бактериальную суспензию и оставить в темноте в течение 20 мин.
    7. Удалить кусочков листьев с подвеской и промокнуть сухой стерильной фильтровальной бумаги.
    8. Поместите кусочков листьев с адаксиальной стороны (верхнюю поверхность листьев) на твердой растительной культуральной среде, содержащей 1,0 мкг / мл 6-бензоаминопурином (БАТ), в 0,1 мкг / мл нафталин уксусную кислоту (НАА), и инкубировать пластин в течение двух дней в климатической камере при контролируемой условия (25 ° С, 16 ч день / 8 ч ночь).
    9. Передача кусочки листьев на твердую культуральную среду (в том числе 1,0 мкг / мл BAP, 0,1 мкг / мл NAA, 500 мкг / мл цефотаксима, 100 мкг / мл канамицина) с абаксиальной поверхности (нижней поверхности листа) в контакте со средой.
    10. Планшеты инкубируют в течение 2-3 недель в климатической камере при 25 ° С с 16 ч / 8 ч день / ночь режим, чтобы вызвать образование отростков. Субкультура каждые 2 недели по передаче листовых эксплантов на свежий твердое культивировани растений среде, содержащей 1,0 мкг / мл BAP, 0,1 мкг / мл NAA, 500мкг / мл цефотаксима и 100 мкг / мл канамицина.
    11. При всходы появляются передавать их на Magenta коробки, содержащих твердую культуральную среду, включая 500 мкг / мл цефотаксима и 100 мкг / мл канамицина, чтобы вызвать образование корней. Выдержите ростки с 16 ч дня / 8 часов ночного светового дня при 25 ° С в течение 1-2 недель.
    12. Когда корни форма, передавать растения в почву в теплице.
    13. Сбор листьев кусок для каждого завода и изолировать геномной ДНК с коммерческого набора.
    14. Обнаружить присутствие трансгена по конкретной ПЦР. Использование 30 нг геномной ДНК в качестве матрицы для ПЦР-амплификации с использованием следующих трансгенных-специфических праймеров: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'и 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', при температуре отжига 58 & deg; С и ​​времени элонгации 20 сек , Проведение реакции ПЦР в общем объеме 50 мкл.
    15. Анализ 220 п.о. продукт с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в трис-ацетатном-ЭДТА (ТАЕ) буфере (40 мМ Trэто, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА).
    16. Выбор трансгенных растений, содержащих ген-мишень.
    17. Сбор кусок листа с каждой из выбранного трансгенного растения и заморозить в жидком азоте немедленно.
    18. Подготовка общего белка экстракты из растений листовой ткани (этап 3.1.3) и проверить каждый образец с помощью вестерн-блот анализа, как описано выше 2, чтобы выбрать лучший рекомбинантного белка, экспрессирующих растений табака.
    19. Сумка цветы выбранного самые эффективные растения перед цветением, чтобы предотвратить перекрестное опыление.
    20. После цветения, созревания плодов и семян сушки, собирать чемоданы.
    21. Отдельные семена от плевел и хранить их в сухом помещении при контролируемой температуре (20-24 ° C).
    22. Сейте Высушенные семена для получения поколение трансгенных растений второго и последующего выбора самых эффективных завод будет самоопыляемыми.
    23. Повторите ту же процедуру, описанную в шагах 2.4.19-2.4.21 для последующих поколений.

    3. Рекомбинантные Анализ экспрессии белка

    1. Всего экстракции белка:
      1. Бактериальные клетки:
        1. Ресуспендируют осадок клеток бактерий, собранных как описано в стадии 2.1.5, в два раза объема культуры в Трис-буферном солевом растворе (TBS - 2 мМ Трис / HCl, 500 мМ NaCl), pH 7,4 с добавлением 1 мМ PMSF (phenylmethanesulfonylfluoride).
        2. Ультразвук клеточный осадок ресуспендировали в три раза по 40 секунд при половинной мощности, сохраняя при этом образец на льду.
        3. Уточнить лизата центрифугированием при 14000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
        4. Передача супернатант в чистую пробирку и хранить как супернатант и осадок отдельно при -80 ° С.
        5. Солюбилизации тел включения, собранные в осадке, в половины объема сотовой лизата TBS рН 8,0 с добавлением 6 М мочевины путем энергичного встряхивания в течение ночи при комнатной температуре.
        6. Центрифуга при 10000 х г в течение 25 мин при комнатной температуре и собирают супернатант в чистомтруба.
        7. Хранить как супернатант и осадок при -80 ° С.
      2. Клетки насекомых:
        1. Промыть гранулу инфицированных клеток насекомых, собранных как описано в стадии 2.2.12, 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS - 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4 рН 7,4).
        2. Ресуспендируют клеток в 200 мкл буфера для лизиса (20 мМ Трис / HCl рН 8,0, 0,5 М NaCl, 3 мМ β-меркаптоэтанол и 1% Твин-20) и инкубировали на льду в течение 30 мин.
        3. Центрифуга клетки солюбилизировали при 14000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
        4. Собирают фракции растворимых и хранить при -80 ° С и отбросить гранул.
      3. Лист растительной ткани:
        1. Измельчить Н. benthamiana или N. аЬасит ткани в тонкий порошок в жидком азоте с использованием ступки и пестика.
        2. Однородный 100 мг наземной ткани в 300 мкл буфера для экстракции (40 мМ Hepes рН 7,9, 5 мМ ДТТ, 1,5% CHAPS), Supplemented с 3 мкл ингибитора протеазы коктейль и оттепель на льду.
          ПРИМЕЧАНИЕ: выбирается соотношение между весом тканей растений (г) в буфер объем (мл) 1: 3.
        3. Экстракт Центрифуга при 30000 х г в течение 30 мин при 4 ° С.
        4. Собирают супернатант в чистую пробирку и хранить при -80 ° С.
    2. Coomassie гель окрашивание:
      1. Подготовка соответствующего разбавления общих белковых экстрактов (например, 2 мкл растительного экстракта, 5 мкл бактериальных экстрактов и насекомых) в конечном объеме 10 мкл буфера для экстракции и добавить 5 мкл буфера для образцов 3x (1,5 М Трис / HCl, рН 6,8, 3% SDS, 15% глицерина, 4% β-меркаптоэтанола) до конечной концентрации 1х.
      2. Образцы кипятить в течение 10 мин.
      3. Отдельные белки на 10% SDS-PAGE.
      4. После электрофореза гель тепла в присутствии Кумасси раствора А (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% изопропанола, 10% уксусная кислота) в микроволновой печи в течение примерно двух минутс до температуры кипения.
      5. Охладить гель комнатной температуре и осторожном встряхивании.
      6. Отменить Coomassie окрашивание раствора А.
      7. Destain гель при нагревании в присутствии Кумасси раствора В (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% изопропанол), С (0,002% Brilliant Blue R-250, 10% уксусная кислота) и D (10% уксусной кислоты) каждый раз следуя той же протокол для окрашивания.
      8. После последнего стадии нагревания раствора Г, оставьте гель Обесцвечивание до фон прозрачный 9.
    3. Вестерн-блот-анализ:
      1. После электрофореза выделенные белки переноса на нитроцеллюлозную мембрану с использованием стандартных методов и блок с 4% молока в PBS, рН 7,4 при комнатной температуре в течение 1 часа.
      2. Инкубируйте блот в течение ночи при 4 ° С или в течение 4 ч при комнатной температуре в блокирующем растворе, содержащем первичное антитело кролика, поднятые против белка-мишени в 1: 10000 и с добавлением 0,1% Твин-20.
      3. После этикетке первичных антителING, мыть мембраны 3 раза по 5 мин в каждом блокирующим раствором, содержащим 0,1% Твин-20.
      4. Инкубируйте с пероксидазой хрена (HRP) -сопряженных анти-кроличьими антителами в 1: 10000 в течение 1,5 ч.
      5. Промыть мембраны в 5 раз по 5 мин каждый с PBS-T (PBS с добавлением 0,1% Твин-20).
      6. Процесс вестерн-блот с использованием хемилюминесцентного субстрата пероксидазы.
    4. Radioimmuno анализ (РИА):
      1. Разрешить реагенты (антисыворотка, Tracer и белка сефароза), чтобы достичь комнатной температуры и пипетки 20 мкл белка образцов экстракта и стандартов в различных концентрациях (от 300-2,400 нг / мл рекомбинантного коммерческой hGAD65) в 12 х 75 мм полистирольные пробирки.
      2. Добавить 20 мкл антисыворотки, подготовленный разбавления 1:30 сыворотки от плазмафереза ​​о T1D пациента.
      3. Добавить 50 мкл метки (125-я-GAD65) и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Установите трубку с трассирующими только оценить общую активность.
      4. Добавить 50 мклбелка A Sepharose и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
      5. Не включать 1 мл холодного PBS буфера в каждую пробирку и центрифугируют при 1500 х г при 4 ° С в течение 30 мин.
      6. Слейте трубы для удаления надосадочной жидкости и поглощать остаточную жидкость на промокательную бумагу, осторожно нажав трубку.
      7. Мера иммунопреципитировали радиоактивность во всех трубок путем подсчета в течение 1 мин в гамма-счетчике.
      8. Земельный участок в логарифмической шкале обязательные ставки (B / T%) калибраторов, связанных с общей активностью, чтобы установить стандартную кривую, и читать концентрации ГТР образцов с калибровочной кривой 10.
        ПРИМЕЧАНИЕ: закрытых районов должны быть разработаны для хранения, обработки и утилизации радиоактивных материалов.

Результаты

Опытно-конструкторских для гетерологичной экспрессии рекомбинантного белка-мишени в различных производственных систем описана здесь. Первый фокус был настройка различных платформ путем создания оптимальных условий для экспрессии целевого белка в каждой системе.

Вы?...

Обсуждение

В этом исследовании сравнивали три различные платформы для экспрессии рекомбинантного человеческого белка: бактериальных клеток бакуловируса / клеток насекомых и растений. Платформа на растительной основе было продолжено за счет использования трех широко используемых технологий э?...

Раскрытие информации

The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this paper.

Благодарности

This work was supported by the COST action ‘Molecular pharming: Plants as a production platform for high-value proteins’ FA0804. The Authors thank Dr Anatoli Giritch and Prof. Yuri Gleba for providing the MagnICON vectors for research purposes.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Yeast extractSigmaY1333
TryptoneFormediumTRP03
Agar Bacteriological GradeApplichemA0949
Sf-900 II SFM mediumGibco10902-088
Grace’s Insect Medium, unsupplementedGibco11595-030
Cellfectin II ReagentInvitrogen10362-100
MS medium including vitaminsDuchefa BiochemieM0222
SucroseDuchefa BiochemieS0809
Plant agarDuchefa BiochemieP1001
Ampicillin sodiumDuchefa BiochemieA0104Toxic
Gentamycin sulphateDuchefa BiochemieG0124Toxic
GanciclovirInvitrogenI2562-023
Carbenicillin disodiumDuchefa BiochemieC0109Toxic
Kanamycin sulfateSigmaK4000Toxic
RifampicinDuchefa BiochemieR0146Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin sulfateDuchefa BiochemieS0148Toxic
Spectinomycin dihydrochlorideDuchefa BiochemieS0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside)SigmaI5502Toxic
MES hydrateSigmaM8250
MgCl2Biochemical436994U
AcetosyringoneSigmaD134406Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Syringe (1 ml)Terumo
MgSO4Fluka63136
BAP (6-Benzylaminopurine)SigmaB3408Toxic
NAA (Naphtalene acetic acid)Duchefa BiochemieN0903Irritant
CefotaximeMylan Generics
Trizma baseSigmaT1503Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer
HClSigmaH1758Corrosive
NaClSigmaS30141 M stock
KClSigmaP9541
Na2HPO4SigmaS7907
KH2PO4SigmaP9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride)SigmaP7626Corrosive, toxic
UreaSigmaU5378
β-mercaptoethanolSigmaM3148Toxic
Tween-20SigmaP5927
HepesSigmaH3375
DTT (Dithiothreitol)SigmaD0632Toxic – 1 M stock, store at -20 °C
CHAPSDuchefa BiochemieC1374Toxic
Plant protease inhibitor cocktailSigmaP9599Do not freeze/thaw too many times
SDS (Sodium dodecyl sulphate)SigmaL3771Flammable, toxic, corrosive – 10% stock
GlycerolSigmaG5516
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
IsopropanolSigma24137Flammable
Acetic acidSigma27221Corrosive
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67SigmaG5163Do not freeze/thaw too many times
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibodySigmaA6154Do not freeze/thaw too many times
Sf9 CellsLife Technologies11496
BL21 Competent E. coliNew England BiolabsC2530H
Protein A SepharoseSigmaP2545
Cell culture platesSigmaCLS3516
Radio Immuno Assay kitTechno Genetics12650805Radioactive material

Ссылки

  1. Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
  2. Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).
  3. Sambrook, J., et al. . Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. , (1989).
  4. Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
  5. Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).
  6. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
  7. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), (2008).
  8. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).
  9. Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
  10. Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
  11. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
  12. Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).
  13. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419 (2014).
  14. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).
  15. Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

97Nicotiana benthamiana Baculovirus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены